CC BY
8
© Ф.С. Бова, О.И. Кит, А.Ю. Максимов, Н.С. Карнаухов, 2018
УДК 616.65-002-007.61-006.66:575.2
ОСОБЕННОСТИ КОПИЙНОСТИ ГЕНОВ, РЕГУЛИРУЮЩИХ АПОПТОЗ И НЕОАНГИОГЕНЕЗ, У БОЛЬНЫХ С ЛОКАЛИЗОВАННЫМ РАКОМ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ РАННЕМ РЕЦИДИВИРОВАНИИ
Ф.С. Бова1, О.И. Кит2, А.Ю. Максимов2, Н.С. Карнаухов2
1ГБУ Ростовской области «Областная больница №2», г. Ростов-на-Дону
2ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ, г. Ростов-на-Дону
PECULIARITIES OF COPYNAMICS OF GENES REGULATING APOPTOSIS AND NEOANGIOGENESIS IN PATIENTS WITH LOCALIZED PROSTATE CANCER IN EARLY RECOVITION
Ph.S. Bova1, O.I. Kit2, AYu. Maksimov2, N.S. Karnaukhov2
1The Regional Hospital №2, Rostov-on-Don 2Rostov Research Institute of Oncology, Rostov-on-Don
Бова Филипп Сергеевич — руководитель Центра урологии, нефрологии и гемодиализа ГБУ Ростовской области «Областная больница №2»
344112, г. Ростов-на-Дону, ул. 1-й Конной Армии, д. 33, тел.: (863) 254-98-90, +7-928-957-08-06, е-mail: alald@inbox.ru Bova Ph.S. — Head of the Center for Urology, Nephrology and Hemodialysis of the Regional Hospital №2 33 the 1st Cavalry Army Str., Rostov-on-Don, Russian Federation, 344112, tel.: (863) 254-98-90, +7-928-957-08-06, e-mail: alald@inbox.ru
Реферат. Измерение копийности генов важно для определения молекулярных механизмов прогрессирования онкологического заболевания. Целью работы явилось исследование относительной копийности генетических локусов, ответственных за апоптоз и контроль неоангиогенеза в опухолевых тканях предстательной железы, у больных локализованным раком предстательной железы (РПЖ) с биохимическими рецидивами (БР) и без рецидивов после радикальной простатэктомии. В основную группу были включены 56 пациентов с локализованным РПЖ, у которых в течение двух лет после РПЭ выявлен БР. 60 больных локализованным РПЖ, у которых рецидив не наблюдался, составили группу сравнения. 55 пациентов, у которых операционные биоптаты предстательной железы были взяты в пределах здоровых тканей при удалении доброкачественной гиперплазии предстательной железы, объединены в контрольной группу. Определение относительной копийности генетических локусов BAX, BCL2, VEGFA, VEGFB проводили методом ПЦР реального времени. Установлено, что у пациентов основной группы в опухолевых образцах наблюдалось значительное повышение активности гена, стимулирующего нео-ангиогенез, а также угнетение апоптоза за счет повышения экспрессии гена BCL2. Снижение коэффициента, характеризующего соотношение относительной копийности генов с проапоптической и антиапоптической активностью BAX/BCL2 ниже 1,64, ассоциировано с риском развития БР у больных локализованным РПЖ после простатэктомии с диагностической чувствительностью 89,3% и специфичностью 88,3%.
Ключевые слова: рак предстательной железы, биохимический рецидив, прогноз, копийность генов, апоптоз, неоангиогенез.
Abstract. The measurement of gene copy is important for determining the molecular mechanisms of the progression of cancer. The aim of the study was to study the relative replicability of genetic loci responsible for apoptosis and control of neoangiogenesis in tumor tissues of the prostate gland in patients with localized prostate cancer (PC) with biochemical recurrence (BR) and without recurrences after radical prostatectomy. The main group included 56 patients with localized PC who had been diagnosed with BR within two years after RP. 60 patients with localized PC who did not relapse had a comparative group. 55 patients in whom operative biopsy specimens of the prostate gland were taken within healthy tissues with the removal of benign prostatic hyperplasia were combined into a control group. Determination of the relative copies of the genetic loci BAX, BCL2, VEGFA, VEGFB was performed by real-time PCR. It was found that a significant increase in the activity of the gene stimulating neoangiogenesis was observed in the patients of the main group in tumor samples, as well as inhibition of apoptosis due to an increase in the expression of the BCL2 gene. The decrease in the ratio characterizing the ratio of the relative copies of genes with the pro-apoptotic and antiapoptotic activity of BAX/BCL2 below 1,64 is associated with a risk of developing BR in patients with localized PC with a diagnostic sensitivity of 89,3% and a specificity of 88,3%.
Key words: prostate cancer, biochemical relapse, prognosis, gene copy, apoptosis, neoangiogenesis.
Введение
В настоящее время ключевой проблемой рака предстательной железы (РПЖ), требующей внимания, является разработка точного и минимально инвазив-ного скринингового теста в дополнение к исследованию сыворотки крови на простатспецифический антиген (ПСА) для разделения пациентов с прогрессивным либо индолентным течением ракового заболевания [1, 2]. РПЖ имеет сложный патогенез, опирающийся на комплекс гормональных, генетических, молекулярных и гистологических изменений [5]. Среди генетических изменений значимую роль играет модификация копийности генов (Copy Number Variation или CNV), что приводит к усилению либо ослаблению экспрессии онко-ассоциированных генов, избыточной или недостаточной продукции белка либо некодирующей РНК [8]. Определение точного числа копий генов позволяет контролировать их экспрессию. Копийность генов можно отнести в разновидности генетического полиморфизма, когда в результате делеции и дупликации возникают хроматические перестройки [9].
Изменение копийности генов в геноме человека ассоциировано с развитием различных карцином, включая РПЖ [3, 13]. G. Novelli et al. [12] при разработке специального андрочипа предложил использовать мониторинг экспрессии генов в 190 локусах в андрогензависимых и андрогеннезависимых клетках предстательной железы (ПЖ). Автор показал высокую прогностическую значимость предложенного метода контроля экспрессии генов для решения вопроса о прогнозе развития РПЖ. Высокую разделительную значимость по прогнозу выживаемости больных РПЖ несут также результаты исследования копийности генов в мононуклеарной фракции крови (диагностическая значимость 92%) [4, 10]. В работе РошаЬ Р. еt al. [13] было отмечено, что модификация копийности 314 генных локусов уникальна для пациентов с РПЖ. Особо важное значение для прогноза развития РПЖ имело исследование копийности генов в локусах 1 q21.3, 15q 15, 7p12.1 и 12q23.1 генов ARNT, THBS1, SLC5A8 и DDC. Снижение числа копий в локусе 8p11.21 гена SFRP1 характеризовало наибольшее прогностическое значение и сопровождалось секрецией цитокинов, стимулирующих пролиферацию эндоте-лиальных клеток.
Если гены ассоциированы с прогрессией опухоли, то измерение их копийности важно для определения молекулярных механизмов прогрессирования онкологического заболевания. Путем изменения копийно-
сти генов контролируется экспрессия генов-супрес-соров опухолевого роста [7]. Сопоставление точного числа копий определенных генов и последующего течения болезни помогает определить предикторные возможности метода.
Целью работы явилось исследование относительной копийности генетических локусов, ответственных за апоптоз и контроль неоангиогенеза в опухолевых тканях ПЖ, у больных локализованным РПЖ с биохимическими рецидивами (БР) и без рецидивов после радикальной простатэктомии (РПЭ).
Материал и методы исследования
Работа выполнена в Центре урологии, нефрологии и гемодиализа, патологоанатомическом отделении ГБУ Ростовской области «Областная больница №2», отделении онкоурологии, патологоанатомическом отделении ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России в 2015-2018 гг. Исследование было одобрено Локальным независимым этическим комитетом ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России.
Всем пациентам в сыворотке крови исходно и каждые 3 месяца после РПЭ определяли содержание ПСА путем иммуноферментного анализа на фотометре «Multiscan-Р 2» (Thermo Fisher Scientifi c Inc., Финляндия). Основанием для заключения о БР были: превышение концентрации ПСА в крови более 0,2 нг/мл в трех последовательных измерениях, проведенных с интервалом 2-х и более недель.
В основную группу были включены 56 пациентов с локализованным РПЖ, у которых в течение двух лет после РПЭ выявлен биохимический рецидив. 60 больных локализованным РПЖ, у которых рецидив не наблюдался, составили группу сравнения. 55 пациентов, у которых операционные биоптаты ПЖ были взяты в пределах здоровых тканей при удалении доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ), объединены в контрольной группу.
Возраст больных РПЖ колебался от 57 до 74 лет, составив в среднем в основной группе 66,7±2,1 лет, группе сравнения — 62,4±2,5 года. В контрольной группе средний возраст соответствовал 63,1±2,4 года. Распределение больных в основной группе в зависимости от клинической стадии РПЖ было следующим:
сТ
3/56 (5,3%), сТ2а — 5/56 (8,9%), сТ„
21/56
(37,5%), сТ2с — 27/56 (48,2%). Высокая степень гистопа-
тологической дифференцировки (<6 баллов по шкале Глисона) встречалась у 6/56 (10,7%), умеренная (7 баллов по шкале Глисона) — у 45/56 (80,4%) и низкая (8-10 баллов по шкале Глисона) — у 5/56 (8,9%) больных.
В группе сравнения стадии РПЖ было следующим: сТ1с — 3/60 (5%), сТ2а — 3/60 (5%), сТ2Ь — 21/60 (35%), сТ2с — 33/55 (55%). Высокая степень гистопатологиче-ской дифференцировки (<6 баллов по Глисону) встречалась у 8/60 (7,1%), умеренная (7 баллов по Глисону)
— у 48/60 (91,6%) и низкая (8-10 баллов по Глисону)
— у 4/60 (1,3%) больных.
Кусочки ПЖ после хирургических вмешательств помещали в 4% раствор забуференного формалина и отправляли в патологоанатомическое отделение. Операционный материал хранили не более 24 часов. При микроскопическом исследовании фиксированных образов ткани железы с окраской гемотоксилин-эозином отмечали гистологический тип опухоли, степень гистопатологической дифференцировки. У всех больных основной группы и группы сравнения гистологический тип опухоли ПЖ был представлен адено-карциномой.
В зависимости от риска рецидива РПЖ 116 пациентов основной группы и группы сравнения после операции были разделены на четыре подгруппы: очень низкого (n=4), низкого (n=10), промежуточного (n=93) и высокого риска (n=9) согласно общепринятой классификации D'Amico с соавт. [6].
С помощью метода ПЦР в реальном времени контролировали активность транскрипции в локусах генов, кодирующих синтез сосудистого эндотелиаль-ного фактора роста (Vascular endothelial growth factor, VEGF) VEGF типа A (RTPrimer DB ID 2803) и гена VEGF типа B (RTPrimer DB ID 2804). Кроме того, определяли копийность генов, контролирующих апоптоз: анти-апоптозного гена, контролирующего синтез BCL2 — протеина (B-cell lymphoma 2) (RTPrimer DB ID 1545); проапоптозного гена BAX, ответственного за синтез ассоциированного с Bcl-2 белка X (RTPrimer DB ID 1541).
Для проведения генетических исследований геномную ДНК экстрагировали путем использования фенол-хлороформной экстракции из свежезамороженных биоптатов тканей ПЖ в присутствии лизи-рующего SDS-содержащего буфера и протеиназы-К. Содержание полученной ДНК контролировали на флюориметре Qubit 2.0" (Invitrogen, США) с использованием набора Quant-iT™ dsDNA High-Sensitivity (HS) Assay Kit (Invitrogen, США). Нормализацию ДНК для проведения ПЦР реального времени доводили до уровня 2 нг/мкл.
При осуществлении метода ПЦР использовались прямые и обратные праймеры с учетом референтных последовательностей ДНК, предоставленных базой данных GenBank Национального центра биотехнологической информации США (табл. 1).
Каждые 25 мкл ПЦР-смеси содержали 10 нг геномной ДНК, по 100 наномолярного раствора прямого и обратного праймера референтного гена или гена-мишени, 0,2 миллимолярной смеси дезокситрифос-фатов, ПЦР-буфер, 2,5 ммоль MgCl2, 0,05 u/мкл ДНК-полимераза Thermus aquaticus («Синтол», Россия), краситель SYBR"Green I (Invitrogen, США).
Последовательно проводилась трехкратная одновременная амплификация гена-мишени и референтного гена (гена с постоянной экспрессией) в экспериментальных и контрольных образцах, изучение соотношения сигналов от амплификатов. Вывод об изменении дозы гена делается на основании соотношения сигналов от амплификатов.
Для проведения ПЦР реального времени использовали термоциклер Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA), специализированное программное обеспечение BioRad CFX Manager (ver. 2,1). Усредненные показатели для каждого исследуемого гена соотносили с аналогичным показателем референтного гена и определяли ACt как разность значений пороговых циклов для исследуемого и референтного гена. Расчет относительной копийности генетического локуса (RQ) опре-
Таблица 1. Панель праймеров для измерения относительной копийности генов
Таблица 2. Соотношение относительной копийности генов с проапоптической и антиапоптической активностью у пациентов клинических групп
Ген № в базе данных GenBank NCBI Хромосомный локус
BAX NM_138761.3 19q13.3-q13.4
BCL2 NM_000633.2 18q21.3
VEGFA NC_000006.12 6p21.1
VEGFB NM_011697.3 11g13.1
Группа BAX/BCL2 (M±m) Р
Осн. гр. Гр. срав.
Основная группа (п=56) 0,94±0,06
Группа сравнения (п=60) 1,93±0,03 0,004
Контрольная группа (п=55) 1,07±0,01 0,02 0,001
деляли по формуле 2-ACt [11]. На следующем этапе для каждого генетического локуса и значений RQ опухолевых и контрольных образцов тканей определяли медиану, рассчитывали соотношение RQ в опухолевой ткани к RQ контрольных образцов (RQ^/RQ^.
Статистическая обработка результатов проведена с помощью программы STATISTICA 10 (StatSoft, США). Количественные показатели были представлены в виде средней и ошибки средней. Различие долей анализировали с помощью четырехпольных таблиц с использованием критерия согласия Пирсона с2, Фишера. Различие средних оценивали с помощью непараметрического критерия Манна — Уитни.
Результаты
В результате исследования в основной группе по сравнению с контрольной было обнаружено выраженное (более 1,5) и статистически значимое повышение в 3,1 раза (p<0,05) относительной копийности гена, регулирующего неоангиогенез (VEGFA), а также повышение соотношения медиан относительной копийности локуса антиапоптического гена BCL2 на 40% (p<0,05) (рис. 1). При сравнительном анализе относительной копийности генов в опухолевых образцах ткани в основной группе по сравнению с группой сравнения установлено повышение (p<0,05) относительного по-
казателя для гена VEGFA (в 2,4 раза), BCL2 (в 1,8 раза) и снижение (р<0,05) соотношения медиан для проапоп-тического гена BAX на 37%. Относительная копийность гена VEGFВ в основной группе и группе сравнения не отличалась (р<0,05) от контрольной группы.
В группе сравнения по сравнению с контрольной группой относительная копийность проапоптическо-го гена BAX была выше в 1,6 раза (р<0,05), а для антиапоптического гена В^2 отмечалась недостоверная тенденция к снижению (р=0,09).
Таким образом, у пациентов с локализованным РПЖ при отсутствии БР после РПЭ исходно повышение копийности гена BAX способствовало активации процессов апоптоза. У пациентов с локализованным РПЖ при последующем рецидивировании изначально в опухолевых образцах наблюдалось значительное повышение активности гена, стимулирующего неоангиогенез, а также угнетение апоптоза за счет повышения экспрессии гена BCL2.
Поскольку у больных с РПЖ по сравнению с контрольной группой, а также в зависимости от течения заболевания изменение экспрессии проапоптическо-го гена BAX и антиапоптического гена BCL2 происходило непропорционально, то расчет соотношения относительной копийности этих генов позволил понять тренд изменений, способствующих либо ограничивающих апоптоз в опухолевой ткани (табл. 2).
Рис. 1. Соотношение медиан относительной копийности генов VEGFA VEGFB, BAXи 8а2 в ткани ПЖ в основной группе (Осн. гр.) и группе сравнения (Гр. срав.) по отношению к контрольным образцам (Контр. гр.) и между собой
Примечание: *—достоверные отличия
Повышение коэффициента BAX/BCL2 в клинических группах способствовало активации апоптоза опухолевых клеток, а снижение коэффициента, напротив, свидетельствовало об активации антиапопти-ческих механизмов. Анализ полученных результатов позволил установить, что копийность в локусах BAX и BCL2 в контрольной группе находилась на сбалансированном уровне и коэффициент BAX/BCL2 составил 1,07±0,01. В группе сравнения повышенная экспрессия гена BAX и снижение копийности гена BCL2 в тканевых образцах опухоли привели к активации апоптоза, коэффициент BAX/BCL2 составил 1,93±0,03. В основной группе коэффициент BAX/BCL2 снижался до 0,94±0,06 по сравнению с группой сравнения (p<0,05), что свидетельствовало об активации анти-апоптических механизмов.
Для оценки прогностической значимости коэффициента BAX/BCL2 в отношении определения вероятности биохимического рецидивирования у больных локализованным РПЖ после РПЭ был использован ROC анализ. Дифференциальная точка разделения (точка cut-off) показателя BAX/BCL2, позволяющая сформировать прогноз, составила 1,64. При снижении коэффициента BAX/BCL2 <1,64, с диагностической чувствительностью 89,3% (доверительный интервал
Рис. 2. Соотношение диагностической чувствительности и специфичности на ROC кривой с пороговой точкой cut-off коэффициента BAX/BCL2 для прогноза вероятности развития БР у больных локализованным РПЖ
78,1-96) и специфичностью 88,3% (доверительный интервал 77,4-95,2) можно статистически значимо (z=30,97, p<0,0001) заключить о высокой вероятности развития БР. При превышении коэффициента BAX/BCL2 >1,64, риск рецидива был низким. Площадь под ROC кривой соотношения диагностической чувствительности и специфичности для оценки прогностической значимости риска развития БР у больных локализованным РПЖ по коэффициенту BAX/BCL2 составила 0,961 ±0,015 (доверительный интервал 0,932-0,99) (рис. 2).
На следующем этапе было изучено сопряжение между степенью риска рецидива РПЖ по классификации D'Amico, объединяющим информацию о клинической стадии РПЖ, степени гистопатологической диф-ференцировки по шкале Глисона, содержании ПСА в крови, и уровнем коэффициента BAX/BCL2 (табл. 3). При очень низком и низком риске рецидива по классификации D'Amico у всех больных коэффициента BAX/BCL2 был более 1,64, а при высоком риске снижался ниже 1,64. Следовательно, прогностическая значимость двух классификаторов была сходной при крайних значениях риска. При промежуточном риске рецидива по классификации D'Amico из 93 больных 57% (n=53) имели высокий, а 43% (n=47) низкий риск вероятности развития БР по величине коэффициента BAX/BCL2.
Сопряжение двух классификаций было статистически значимым, о чем свидетельствовало высокое значение критерия согласия c2 Пирсона с непараметрической поправкой (M-L Chi-square=33,15) и соответствующее p<0,001. Следовательно, основное практическое значение классификация риска БР у больных локализованным РПЖ имеет при промежуточном риске рецидива по классификации D'Amico (один из признаков — клиническая стадия Т2в-Т2с, 7 баллов по шкале Глисона, содержание ПСА в крови 10-20 нг/мл)
Обсуждение
Проведенные исследования позволили установить, что как при развитии локализованного РПЖ, так и при развитии БР в опухолевой ткани происходит активация гена VEGFA и усиленная секреция сигнального белка для стимуляции васкулогенеза. Избыточная экспрессия VEGFA способствует росту кровеносных сосудов опухоли и прогрессирующему ее течению. Ведущую роль в стимуляции ангиогенеза играет ре-гуляторный белок VEGFA. В систему белков семейства
Таблица 3. Распределение больных локализованным РПЖ в зависимости от риска рецидива по классификации ОАтнсо и коэффициента ВАХ/ВС1.2
Риск рецидива BAX/BCL2 <1,64 BAX/BCL2>1,64 Всего
Очень низкий 0 4 (100%) 4 (100%)
Низкий 0 10 (100%) 10 (100%)
Промежуточный 53 (57%) 40 (43%) 93 (100%)
Высокий 9 (100%) 0 9 (100%)
VEGF входит также белок VEGFB, обеспечивающий в основном эмбриональный ангиогенез, главным образом, в миокарде. Экспрессия сигнального белка VEGFB не нарушалась в опухолевой ткани ПЖ как в основной группе, так и группе сравнения. Развитие БР у больных локализованным РПЖ было ассоциировано с высоким трехкратным приростом копийности гена VEGFA.
Как известно, прогрессивное развитие злокачественных опухолей связано с изменением устойчивости клеток к запрограммированной гибели. Усиление апоптоза опухолевых клеток способствует стабилизации злокачественного заболевания. Проапоптиче-ский белок ВАХ является антагонистом по отношению к свойству BCL-2, способствует пролонгации апоп-тозного каскада реакций. Про- и антиапоптические механизмы, как и любые сигнальные пути, находятся во взаимосвязи друг с другом. Баланс про- и анти-апоптозных механизмов в тканях опухоли динамично изменяется. В связи с этим, прогностической значимостью обладают не столько абсолютные либо относительные показатели активности транскрипционной активности генов, а сколько соотношение между экспрессией про- и антиапоптозных сигнальных белков. В связи с этим, в нашем исследовании был введен коэффициент, характеризующий соотношение относительной копийности генов с проапоптической и антиапоптической активностью BAX/BCL2. У больных локализованным РПЖ с последующим развитием БР исходно соотношение относительной копийности генов с проапоптической и антиапоптической активностью BAX/BCL2 было снижено за счет усиления экспрессии белка BCL2 в опухолевой ткани. В группе сравнения соотношение копийности генов BAX и BCL2 было смещено в сторону преобладания активности проапоптозного локуса BAX, превышающего аналогичный показатель гена BCL2. Следовательно при отсутствии рецидивов у пациентов проапоптозные гены по активности преобладали над антиапоптозными. В основной группе антиапоптозные механизмы уси-
ливались по отношению к проапоптозным. Снижение коэффициента BAX/BCL2 ниже 1,64 было ассоциировано с риском развития БР у больных локализованным РПЖ. Разработанный механизм прогнозирования обладал наибольшей практической значимостью при промежуточном риске развития рецидивов по классификации, опирающейся на сведения о стадии заболевания, степени дифференцировки и концентрации специфического маркера заболевания в крови. В связи с этим, оценка относительной копийности генов, регулирующих апоптоз в опухолевой ткани, может эффективно использоваться для повышения достоверности прогноза рецидива РПЖ.
Заключение
Установлено, что у пациентов основной группы в опухолевых образцах наблюдалось значительное повышение активности гена, стимулирующего нео-ангиогенез, а также угнетение апоптоза за счет повышения экспрессии гена BCL2. Разработана система дополнительного прогноза рецидива РПЖ при промежуточном риске по классификации Р'Атко, основанная на оценке в операционных биоптатах баланса относительной копийности генов BAX/BCL2, регулирующих апоптоз с диагностической чувствительностью 89,3% и специфичностью 88,3%.
Конфликт интереса по представленной статье отсутствует.
Литература
1. Говоров А.В., Васильев А.О., Ширяев А.А. и др. Актуальные методы ранней диагностики рака предстательной железы // Урология. — 2017. — №6. — С. 101-106.
2. Гулиев Ф.А. Предикторы биохимического прогресси-рования рака предстательной железы // Казанский медицинский журнал. — 2017. — №6. — С. 890-894.
3. Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С. и др. Изменение копийности генетических локусов при раке желудка // Молекулярная биология. — 2015.
— Т. 49, №4. — С. 658-666.
4. Коган М.И., Чибичян М.Б., Водолажский Д.И. Изменение экспрессии генетических локусов в мононуклеарной фракции периферической крови больных раком предстательной железы // Клиническая онкология. — 2012. — №5. — С. 59-60.
5. Corn P.G. The tumor microenvironment in prostate cancer: elucidating molecular pathways for therapy development // Cancer management and research.
— 2012. — Vol. 4. — P. 183-193. doi: https://doi.org/ 10.2147/ CMAR. S32839.
6. D'Amico A.V., Whittington R., Malkowicz S.B., et al. Combined modality staging of prostate carcinoma and its utility in predicting pathologic stage and postoperative prostate specific antigen failure // Urology. — 1997 Mar. — Vol. 49 (3A Suppl). — P. 2330.
7. Engler D.A., Gupta S., GrowdonW.B. et al. Genome Wide DNA Copy Number Analysis of Serous Type Ovarian Carcinomas Identifies Genetic Markers Predictive of Clinical Outcome // PLoS ONE. — 2012. — Vol. 7 (2). — P. e30996.
8. Heitzer E., Ulz P., Belic J. et al. Tumor-associated copy number changes in the circulation of patients with
prostate cancer identified through whole-genome sequencing // Genome Medicine.—2013.—Vol. 5. — P. 30.
9. Kader T., Goode D.L., Wong S.Q. et al. Copy number analysis by low coverage whole genome sequencing using ultra low-input DNA from formalin-fixed paraffin embedded tumor tissue // Genome Medicine. — 2016. — Vol. 8. — P. 121 https://doi.org/10.1186/ s13073-016-0375-z
10. Komatsu N., Matsueda S., Tashiro K. et al. Gene expression profiles in peripheral blood As a biomarker in cancer patients receiving Peptide vaccination // Cancer. — 2012. — Vol. 118 (12). — P. 3208-3221.
11. Livak K., Schmittgen T. Analysis of Relative gene expression data using real-time Quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method // Methods.—2001. — Vol. 25 (4). — P. 402-428.
12. Novelli G., Ciccacci C., Borgiani P. et al. Genetic tests and genomic biomarkers: Regulation, qualification and validation // Clin. Cases Miner. Bone Metab. — 2008. — Vol. 5 (2). — P. 149-154.
13. Poniah P., Zain S.M., Razack A. et al. Genome-wide copy number analysis reveals candidate gene loci that confer susceptibility to high-grade prostate cancer // Urologic Oncology. — 2017. — Vol. 35. — P. 545.e1-545e11.
