CC BY
27
DOI: 10.17816/шоЫ83П-19
ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ОЦЕНКИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА РСА3 В МОЧЕ У БОЛЬНЫХ ЛОКАЛИЗОВАННЫМ РАКОМ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ГИСТОМОРФОЛОГИЧЕСКИМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ ПЕРИТУМОРАЛЬНОЙ ЗОНЫ
© Ф.С. Бова
ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, Ростов-на-Дону; ГБУ Ростовской области «Областная больница № 2», Ростов-на-Дону
Для цитирования: Бова Ф.С. Прогностическая значимость оценки экспрессии гена РСА3 в моче у больных локализованным раком предстательной железы и гистоморфологическими изменениями перитуморальной зоны // Урологические ведомости. - 2018. -Т. 8. - № 3. - С. 11-19. doi: 10.17816/uroved8311-19
Дата поступления: 02.08.2018 Статья принята к печати: 14.09.2018
® Цель — определить прогностическую значимость оценки экспрессии гена РСА3 в осадке и экзосомах мочи у больных с локализованным раком предстательной железы (РПЖ) и сочетанными гистоморфологическими изменениями в перитуморальной зоне при определении риска биохимического рецидива после радикальной простатэктомии (РПЭ). Материалы и методы. Обследованы 148 больных локализованным РПЖ. У 96 (65 %) пациентов основной группы в перитуморальной зоне предстательной железы имела место простатическая ин-траэпителиальная неоплазия высокой степени (ПИН-2). У 52 (35 %) пациентов группы сравнения гистопатоло-гические процессы в перитуморальной зоне отсутствовали. В осадке и экзосомах мочи у пациентов двух групп методом ПЦР в реальном времени определяли экспрессию гена РСА3 относительно референсного гена КЬКЗ. Результаты. Уровень экспрессии гена РСАЗ в экзосомах мочи у больных при одновременном сочетании РПЖ и ПИН-2 в перитуморальной зоне был выше при последующем рецидивировании по сравнению с благоприятным течением заболевания. Для определения риска рецидивирования опухолевого заболевания при сопутствующих изменениях перитуморальной зоны эффективна также оценка экспрессии гена РСАЗ в осадке мочи, но в ограниченном диапазоне. При снижении в осадке мочи АС РСАЗ-КЬКЗ менее 1,86 включительно биохимический рецидив у пациентов с РПЖ и ПИН-2 в перитуморальной зоне развивался чаще (84 % против 51 %, р = 0,013). Заключение. Прогностическая значимость оценки экспрессии гена РСАЗ в осадке и экзосомах мочи для определения риска биохимического рецидива после РПЭ повышается у больных с локализованным РПЖ и ПИН-2 в перитуморальной зоне.
"И5 Ключевые слова: рак предстательной железы; биохимический рецидив; перитуморальная зона; простатическая интраэпителиальная неоплазия; простатспецифический антиген 3; моча.
PROGNOSTIC SIGNIFICANCE OF THE EVALUATION OF EXPRESSION OF THE GENE PCA3 IN URINE IN PATIENTS WITH LOCALIZED PROSTATE CANCER AND HISTOMORPHOLOGICAL CHANGES IN THE PERITUMORAL ZONE
© Ph.S. Bova
Rostov Research Oncological Institute of the Ministry of Health of Russia, Rostov-on-Don, Russia; Regional Hospital No 2, Rostov-on-Don, Russia
For citation: Bova PhS. Prognostic significance of the evaluation of expression of the gene PCA3 in urine in patients with localized prostate cancer and histomorphological changes in the peritumoral zone. Urologicheskie vedomosti. 2018;8(3):11-19. doi: 10.17816/ uroved8311-19
Received: 02.08.2018 Accepted: 14.09.2018
Aim. To determine the prognostic significance PCA3 gene expression in urine sediment and exosomes in patients with localized prostate cancer (PC) and associated histologic changes in the peritumoral zone as a predictor of biochemical recurrence after radical prostatectomy (RPE). Materials and methods. Of 148 patients with localized PC, 96 (65%) had highgrade prostatic intraepithelial neoplasia (PIN-2) in the peritumoral zone. The other 52 (35%) had no pathologic tissue of the peritumoral zone. PDA3 expression in urine sediment and exosomes was determined with real-time PCR with respect
to the reference gene KLK3. Results. The PCA3 gene expression level in urine exosomes in patients with PIN-2 in the prostatic peritumoral zone and synchronous pancreatic adenocarcinoma was higher among patients with subsequent disease recurrence. Increased PCA3 gene expression in the urine sediment was also predictive of the risk of recurrence of a prostatic tumor with PIN-2 in the peritumoral zone, although to a lesser degree than the results with urine exosomes. When the ACt PCA3-KLK3 was >1,86 in the urine sediment, biochemical recurrence of PC and PIN-2 developed more frequently in the peritumoral zone (84% versus 51%, p = 0,013). Conclusions. Increased PCA3 gene expression in urine sediment and exosomes is a predictor of increased risk of biochemical recurrence after RPE in patients with localized PC and PIN-2 in the peritumoral zone.
® Keywords: prostate cancer; biochemical relapse; peritumoral zone; prostatic intraepithelial neoplasia; prostate-specific antigen 3; urine.
ВВЕДЕНИЕ
Анализ экспрессии генов представляет собой перспективный метод исследования ткани опухоли, полученной при биопсии либо при оперативном лечении. При раке предстательной железы (РПЖ) уровень экспрессии простатспе-цифических генов определяют уже более десяти лет [1]. Основная цель состоит в выявлении генетических сигнатур для диагностики злокачественного процесса и дальнейшего прогнозирования клинического течения заболевания (индолентное или агрессивное), выраженности метастатического и летального потенциала опухоли, склонности к рецидивированию [2, 3]. Внедрение генетических исследований ткани опухоли предстательной железы (ПЖ) в клиническую практику сдерживается рядом обстоятельств, среди которых можно выделить мультифокальность, межочаговую гетерогенность опухолей, гистоморфологические изменения перитуморальной зоны [4]. В связи с этим оценка экспрессии генов в ткани опухоли сопровождается во многих работах исследованием других биологических жидкостей и клеточных элементов — сыворотки крови, мононуклеарной фракции крови, цельной мочи, ее осадка, экзосом мочи [4-6]. Таким образом, актуальным и практически значимым представляется определение информативных методов неинвазивной диагностики, позволяющих дать характеристику основного заболевания с учетом микроокружения опухоли и состояния перитуморальной зоны. Одним из таких молекулярно-генетических маркеров РПЖ является оценка уровня экспрессии гена РСА3 относительно референсного гена с простатспеци-фической экспрессией — КЬКЗ [6]. При этом если диагностические возможности определения экспрессии гена РСАЗ в моче и экзосомах при дифференциальной диагностике злокачественного и доброкачественного процесса в ПЖ известны [4],
то влияние на последующее течение заболевания до настоящего момента не исследовалось.
Целью работы было определение прогностической значимости оценки экспрессии гена РСАЗ в осадке и экзосомах мочи у больных с локализованным РПЖ и сочетанными гистоморфологиче-скими изменениями в перитуморальной зоне при определении риска биохимического рецидива (БР) после радикальной простатэктомии (РПЭ).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена в Центре урологии, нефрологии и гемодиализа, патологоанатомическом отделении ГБУ Ростовской области «Областная больница № 2» в 2015-2017 гг. Исследование было одобрено локальным независимым этическим комитетом ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России. Все пациенты дали информированное согласие на участие в исследовании.
Критерии включения больных в исследование были следующими: 1) локализованный РПЖ (Т1с-Т2с) как по клинической, так и по патоморфологиче-ской стадии по результатам гистологического исследования биопсийных и операционных биопта-тов; 2) наличие гистологического исследования образцов опухоли и перитуморальной зоны; 3) отсутствие отдаленных метастазов. Критерием исключения явилось наличие экстракапсулярной инвазии опухоли по результатам гистологического исследования хирургических образцов ткани ПЖ.
Гистологические исследования в операционных биоптатах проведены у 148 больных с локализованным РПЖ (Т1с-Т2сМ0М0). Возраст больных общей клинической группы колебался от 54 до 79 лет, составив в среднем 65,6 ± 2,5 года. Распределение больных в зависимости от клинической стадии РПЖ было следующим: сТ 1с — 15/148 (10,1 %),
сТ 2а — 20/148 (23 %), сТ 2Ь — 43/148 (29 %), сТ 2с — 76/148 (51,4 %). Высокая степень гистопатологи-ческой дифференцировки (<6 баллов по Глисону) встречалась у 12/148 (8,1 %), умеренная (7 баллов по Глисону) — у 134/148 (90,5 %) и низкая (8-10 баллов по Глисону) — у 2/148 (1,4 %) больных.
У всех больных гистологический тип опухоли ПЖ был представлен аденокарциномой. У 96/148 (64,9 %) больных основной группы помимо аденокарциномы ПЖ в перитуморальной зоне имели место изменения, соответствующие диагнозу простатической интраэпителиальной неоплазии высокой степени (ПИН-2). У 52/148 (35,1 %) пациентов группы сравнения гистопатологические процессы перитуморальной зоны отсутствовали.
Всем больным РПЭ выполняли открытым способом. Полученный хирургом биопсийный материал после РПЭ помещали в 4 % стабилизированный буфером раствор формалина и сразу отправляли в патологоанатомическое отделение, где хранили не более 24 часов. Для морфологического исследования патологоанатом формировал образцы опухолевой ткани (не менее 3 кусочков), периту-моральной зоны (2 см от опухоли и более из обеих долей железы) отсечением конусовидных кусочков размером 1,0 х 0,5 см. Далее полученные кусочки поперечно нарезали на 15-20 пластинок толщиной 0,3 мм. При микроскопическом исследовании отмечали гистологический тип опухоли, степень гисто-патологической дифференцировки.
Для гистологического исследования при световой микроскопии кусочки тканей железы фиксировали в 10 % растворе формалина, стабилизированном буфером по Лилли при рН 7,4, затем заливали в парафин по обычной методике. Серийные срезы толщиной 3-5 мкм депарафинировали по стандартной схеме, затем окрашивали гематоксилином и эозином. Образцы исследовали в световом микроскопе TOPIC-T CETI (Нидерланды).
Всем пациентам в сыворотке крови исходно и каждые 3 месяца после РПЭ определяли содержание ПСА путем иммуноферментного анализа на фотометре Multiscan-P2 (Thermo Fisher Scientific Inc., Финляндия). Конечной точкой наблюдения было выявление БР. Основанием для заключения о БР служило превышение концентрации ПСА в крови более 0,2 нг/мл в трех последовательных измерениях, проведенных с интервалом 2 и более недель.
На первом этапе первую порцию мочи пациентов в объеме 70 мл собирали в контейнер после
трехкратного нажатия на каждую долю ПЖ. Далее полученную порцию мочи делили на две: одну порцию в объеме 20 мл помещали в пробирку для получения мочевого осадка и оставшиеся 50 мл мочи использовали для выделения экзосом.
Для получения образца мочевого осадка 20 мл мочи центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об/мин. Далее надосадочную жидкость удаляли, а оставшийся осадок ресуспендировали и отбирали 1,5 мл в пробирку «эппендорф». Осадок мочи консервировали, добавляя 1 мл «Среды РНК» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия), пробирку закрывали и заворачивали в герметизирующую лабораторную пленку.
При выделении экзосом 50 мл мочи центрифугировали в течение 15 минут при 10 000 об/мин. Полученный супернатант центрифугировали в течение 3 часов при 100 000 об/мин. Осадок промывали добавлением 3 мл буферного раствора PBS (phosphate-buffered saline), осаждали кратковременным центрифугированием. Далее экзосомы ре-суспендировали в буфере PBS в объеме 200 мкл.
Тотальную РНК из мочи выделяли сорбент-ным методом при помощи набора «АмплиПрайм РИБО-сорб» («НекстБио», Россия) по шаговой инструкции производителя. Образцы обрабатывали ДНКазой (6 ед. активности) для удаления примеси геномной ДНК в течение 40 мин при комнатной температуре в соответствующем буфере (реагенты Applied Biosystems, США).
При обратной транскрипции использовали набор High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, США). При получении кДНК на РНК-матрице применяли метод отжига случайных олигонуклеотидов при расходовании 40,0 мкл набора и в соответствии с пошаговой инструкцией производителя.
Экспрессию гена РСА3 в осадке и экзосомах мочи определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). При этом сравнивали величины пороговых циклов Ct изучаемого и референсного гена. В качестве референсного гена рассматривали ген калли-креина человека KLK3, для которого характерна простатспецифичная экспрессия. Реакционная смесь содержала 1,0 мкл образца кДНК из осадка мочи или экзосом мочи, 8,0 мкл деионизиро-ванной воды, 1,0 мкл готовой смеси праймеров и TaqMan-зонда, 10,0 мкл концентрированного буферного раствора с полимеразой согласно
протоколу производителя. Температурные параметры: начальная денатурация 95 °C в течение 10 мин, затем 47 циклов при 95 °C в течение 15 с, 60 °C — 1 мин (детекция).
При ПЦР-РВ использовали готовые прай-меры KLK3 (assay ID Hs02576345_m1, Applied Biosystems, FAM), PCA3 (assay ID Hs01371939_g1, Applied Biosystems, FAM), а также TaqMan-зонды с красителями и малобороздочные лиганды MGB (Minor Groove Binders, MGB). Образец мочи исследовали, если экспрессию KLK3 обнаруживали при значении порогового цикла Ct до 45 циклов. В каждом образце ген амплифицировали трехкратно и рассчитывали усредненное значение порогового цикла Ct.
Для проведения ПЦР-РВ использовали тер-моциклер Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, США), специализированное программное обеспечение Bio-Rad CFX Manager (ver. 2.1). Для выражения экспрессии гена РСА3 вычисляли показатель ÁCt = Ct (РСА3) - Ct (KLK3).
Статистическую обработку результатов осуществляли при использовании программы Statis-tica 12 (StatSoft, США), модуля описательной статистики, частотного анализа, таблиц кросстабуляции. Рассчитывали медиану, 25-й и 75-й процентили.
Различия количественных показателей между группами оценивали с помощью критерия Манна - Уит-ни при уровне значимости р < 0,05. Различия долей определяли с помощью критерия х2. В работе использовали ROC-анализ.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исходные клинические и послеоперационные характеристики больных основной и контрольной групп представлены в табл. 1.
В исследование были отобраны пациенты, у которых по результатам гистологического исследования операционных биоптатов клиническая и патомор-фологическая стадии РПЖ совпадали. В результате были исключены случаи экстракапсулярного распространения опухоли у отдельных пациентов по результатам послеоперационного обследования, поскольку инвазия злокачественного новообразования является ключевым фактором риска рецидивирова-ния заболевания. Распределение больных основной и контрольной групп в зависимости от клинической и патоморфологической стадии, дифференцировки по шкале Глисона по результатам исследования операционных биоптатов не имело различий (р > 0,05), что позволило изучить влияние наличия ПИН-2 в перитуморальной зоне на послеоперационное те-
Таблица 1
Исходные клинические и послеоперационные характеристики больных основной и контрольной групп
Table 1
Baseline clinical and postoperative characteristics of patients with localized prostate cancer
Показатель Основная группа (РПЖ + ПИН-2) (n = 96) Контрольная группа РПЖ (n = 52) Р
Возраст 64,5 ± 2,7 66,1 ± 2,3 >0,05
Клиническая стадия, абс. (%): сТ1с сТ2а сТ2Ь сТ2с 10 (10,4 %) 9 (9,4 %) 26 (27,1 %) 51 (53,1 %) 5 (9,6 %) 5 (9,6 %) 17 (32,7 %) 25 (48,1 %) >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
Патоморфологическая стадия (операционные биоптаты), абс. (%): рТ2а РТ2Ь РТ2С РПЖ обнаружен при игольной биопсии 9 (9,4 %) 26 (27,1 %) 51 (53,1 %) 10 (10,4 %) 5 (9,6 %) 17 (32,7 %) 25 (48,1 %) 5 (9,6 %) >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
Дифференцировка по шкале Глисона (операционные биоптаты), абс. (%): • высокая (<6 балла) • умеренная (7 баллов) • низкая (8-10 баллов) 8 (8,4 %) 87 (90,6 %) 1 (1,0 %) 4 (7,7 %) 47 (90,4 %) 1 (1,9 %) >0,05 >0,05 >0,05
ПСА в сыворотке крови до операции, нг/мл (М ± т) 12,1 ± 1,3 12,5 ± 1,6 >0,05
ПСА крови на момент выявления БР, нг/мл (М ± т) 3,4 ± 0,5 2,0 ± 0,3 <0,05
Примечание. РПЖ — рак предстательной железы; ПИН-2 — простатическая интраэпителиальная неоплазия высокой степени; ПСА — простатспецифический антиген; БР — биохимический рецидив.
чение болезни без учета основных общепризнанных факторов риска прогрессирования.
Среди пациентов группы сравнения в течение двух лет после РПЭ биохимический рецидив был выявлен у 5/52 (10 %), а в основной группе при со-четанном РПЖ + ПИН-2 — у 25/96 (26 %). Следовательно, у пациентов основной группы в отличие от группы сравнения БР встречался чаще (р = 0,03).
В основной группе и группе сравнения перед операцией медиана и межквартильный диапазон величины простатспецифического антигена в сыворотке крови практически не различались (р = 0,96) (табл. 2).
Значения медианы и межквартильного диапазона Да гена РСА3 по сравнению с референсным геном КЬКЗ в осадке мочи были близки в двух изучаемых группах и статистически значимо не различались (р = 0,89) (см. табл. 2). Отрицательное среднее значение ДС изучаемого гена по отношению к референсному гену свидетельствовало о более высоком уровне экспрессии первого гена по сравнению со вторым. В основной группе и группе срав-
нения уровень экспрессии гена РСАЗ в осадке мочи не различался (р = 0,89).
Между тем в экзосомах мочи в основной группе установлен более высокий уровень мРНК гена РСАЗ по сравнению с группой сравнения (р = 0,04). Медиана ДС РСАЗ-КЬКЗ в экзосомах мочи в основной группе составила -2,57, а в группе сравнения -1,13 (см. табл. 2). Меньшее значение ДС свидетельствовало о более высоком уровне мРНК анализируемого гена РСАЗ по сравнению с референсным геном КЬКЗ в экзосомах мочи.
Ретроспективно с учетом двухгодичных сведений о рецидивировании заболевания были проанализированы дооперационные результаты генетических исследований (табл. 3).
Средние значения содержания ПСА в сыворотке крови, а также экспрессия гена РСАЗ до операции у пациентов основной группы и группы сравнения в зависимости от наличия или отсутствия БР в последующие 2 года не различались (р > 0,05). У пациентов группы сравнения экспрессия гена РСАЗ в экзосомах мочи с учетом рецидива также
Таблица 2
Содержание простатспецифического антигена в сыворотке крови и экспрессия гена РСА3 в осадке и экзосомах мочи у больных основной группы и группы сравнения
Table 2
Serum prostate-specific antigen and РСА3 expression levels in urine sediment and exosomes
Показатель Группа сравнения (РПЖ) (n = 52) Основная группа (РПЖ + ПИН-2) (n = 96) Р
Me [25 %; 75 %] Me [25 %; 75 %]
ПСА в сыворотке крови, нг/мл 12,6 [9,3; 17,8] 12,0 [8,5; 18,6] 0,96
ДС РСАЗ-КЬКЗ в осадке мочи -0,02 [-0,27; 0,79] -0,49 [-0,35; 0,86] 0,89
ДС РСАЗ-КЬКЗ в экзосомах мочи -1,13 [-1,96; 1,58] -2,57 [-3,02; 0,12] 0,04
Показатель Группа сравнения (РПЖ) (n = 52) Основная группа (РПЖ + ПИН-2) (n = 96)
БР есть (n = 5) БР нет (n = 47) Р БР есть (n = 25) БР нет (n = 71) Р
ПСА в сыворотке крови, нг/мл Ме [25 %; 75 %] 13,1 [9,7; 18,3] 12,2 [9,0; 16,2] 0,64 15,8 [10,6; 19,1] 11,2 [8,3; 17,5] 0,37
DCt РСАЗ-КЬКЗ в осадке мочи Ме [25 %; 75 %] -0,21 [-0,36; 0,55] 0,03 [-0,22; 0,94] 0,58 -0,68 [-0,92; 0,63] -0,15 [-0,31; 0,88] 0,41
DCt РСАЗ-КЬКЗ в экзосомах мочи Ме [25 %; 75 %] -1,24 [-1,53; 1,42] -0,86 [-0,91; 1,63] 0,32 -3,17 [-4,13; 0,04] -1,14 [-2,08; 0,36] 0,02
Примечание. РПЖ — рак предстательной железы; ПИН-2 — простатическая интраэпителиальная неоплазия высокой степени; ПСА — простатспецифический антиген; БР — биохимический рецидив.
Примечание. РПЖ — рак предстательной железы; ПИН-2 — простатическая интраэпителиальная неоплазия высокой степени; ПСА — простатспецифический антиген.
Таблица 3
Содержание простатспецифического антигена в сыворотке крови и экспрессия гена РСА3 в осадке и эк-зосомах мочи у больных раком предстательной железы основной группы и группы сравнения в зависимости от рецидивирования заболевания
Table 3
Serum prostate-specific antigen and РСА3 expression levels in urine sediment and exosomes in patients with prostate cancer according to recurrence
не имела различий (р = 0,32). Исключение составили результаты сравнительного анализа экспрессии гена РСА3 в экзосомах мочи только у пациентов основной группы. Так, уровень экспрессии гена РСА3 в экзосомах мочи у больных при одновременном сочетании аденокарциномы ПЖ и ПИН-2 в перитуморальной зоне был выше (медиана Да РСА3-К1К3 -3,17 против -1,14, р = 0,02) при последующем рецидивировании по сравнению с благоприятным течением заболевания.
Экспрессия гена РСА3 в экзосомах мочи у пациентов с РПЖ с прогрессирующим течением заболевания была повышена при скомпрометированности перитуморальной зоны. Наличие в перитуморальной зоне ПИН-2, повышенная экспрессия гена РСА3 в экзосомах мочи были сопряжены с развитием БР в последующем. Для более детального изучения сопряжения между указанными процессами был предпринят частотный анализ и метод кросстабуляции (табл. 4).
В результате было установлено, что у пациентов при одновременном наличии аденокарцино-мы и ПИН-2 в перитуморальной зоне снижение DCt РСА3-КЬК3 в осадке мочи ниже 1,86 (дифференциальной точки разделения для РПЖ по сравнению с доброкачественной гиперплазией ПЖ по О.И. Аполихину и др. [6]) встречалось чаще (40 % против 59 %, р = 0,04). Следовательно, сравнительная оценка экспрессии гена РСА3 в осадке
мочи информативна для оценки риска рецидиви-рования опухолевого заболевания при сопутствующих изменениях перитуморальной зоны при снижении Да РСА3-К1К3 менее 1,86.
Результаты частотного анализа содержания ПСА в сыворотке крови и уровней экспрессии генов РСА3 в осадке и экзосомах мочи с учетом реци-дивирования заболевания представлены в табл. 5.
Анализ результатов табл. 5 показал, что у больных основной группы с изменениями перитумо-ральной зоны наличие БР после операции было сопряжено с повышением экспрессии гена РСА3 в осадке мочи (р = 0,013).
Далее нами был использован ROC-анализ для дальнейшего поиска уровня порогового цикла а в экзосомах мочи и выделения больных с высоким риском рецидивирования заболевания при наличии ПИН-2 в перитуморальной зоне. С помощью ROC-анализа был определен разделительный уровень для значения АС РСА3-КЬК3 < -2,6. То есть если у пациентов с аденокарциномой ПЖ и наличием ПИН-2 в перитуморальной зоне АСР СА3-КЬК3 в экзосомах мочи был ниже значения -2,6 включительно, то с диагностической чувствительностью 88 % и диагностической специфичностью 86 % можно говорить о высоком риске БР в ближайшие 24 месяца после РПЭ. Доля ложноотрицательных случаев составила 12 %, а ложноположительных — 14 %. Общая диагностическая эффективность оцен-
Показатель Группа сравнения (РПЖ) (n = 52) абс. (%) Основная группа (РПЖ + ПИН-2) (n = 96) абс. (%) Р* р**
ПСА в сыворотке крови, нг/мл:
<10 2 (4 %) 1 (1 %) 0,59 0,07
10-20 49 (94 %) 84 (88 %) 0,31
>20 1 (2 %) 11 (11%) 0,087
ДС£ РСА3-КЬК3 в осадке мочи:
>3,3 3 (6 %) 2 (2 %) 0,48 0,065
[1,86-3,3] 28 (54 %) 37 (39 %) 0,10
< 1,86 21 (40 %) 57 (59 %) 0,04
ДС£ РСА3-КЬК3 в экзосомах мочи: >1,48 <1,48 2 (4 %) 50 (96 %) 4 (4 %) 92 (96 %) 0,73 0,73 0,73
Примечание. р* — доверительная вероятность по критерию х2 при попарном сравнении; р** — доверительная вероятность по критерию х2 при множественном сравнении; РПЖ — рак предстательной железы; ПИН-2 — простатическая интраэпите-лиальная неоплазия высокой степени.
Таблица 4
Число пациентов основной группы и группы сравнения в зависимости от содержания простатспецифи-ческого антигена в сыворотке крови и экспрессия гена РСА3 в осадке и экзосомах мочи у больных раком предстательной железы
Table 4
Number of patients in the study group and control group according to the level of serum prostate-specific antigen and РСА3 expression in urine sediment and exosomes in patients with prostate cancer
Таблица 5
Число пациентов основной группы и группы сравнения в зависимости от содержания простатспецифи-ческого антигена в сыворотке крови и экспрессия гена РСА3 в осадке и экзосомах мочи у больных раком предстательной железы с учетом рецидивирования заболевания
Table 5
Recurrence-specific number of patients in the study group and control group according to the level of serum prostate-specific antigen and РСА3 expression in urine sediment and exosomes in patients with prostate cancer
Показатель Группа сравнения (РПЖ) (n = 52) абс. (%) Основная группа (РПЖ + ПИН-2) (n = 96) абс. (%)
БР есть (n = 5) БР нет (n = 47) р* БР есть (n = 25) БР нет (n = 71) Р*
ПСА в сыворотке крови, нг/мл: <10 10-20 >20 0 5 (100 %) 0 2 (4 %) 44 (94 %) 1 (2 %) 0,84 0 19 (76 %) 6 (24 %) 1 (1 %) 65 (91,5 %) 5 (8,5 %) 0,064
DCt РСАЗ-КЬКЗ в осадке мочи: >3,3 [1,86-3,3] <1,86 0 1 (20 %) 4 (80 %) 3 (6 %) 27 (58 %) 17 (36 %) 0,16 0 4 (16 %) 21 (84 %) 2 (3 %) 33 (46 %) 36 (51 %) 0,013
DCt РСАЗ-КЬКЗ в экзосомах мочи: >1,48 <1,48 0 5 (100 %) 2 (4 %) 45 (96 %) 0,45 1 (4 %) 24 (96 %) 3 (4 %) 68 (96 %) 0,59 0,59
Примечание. р* — доверительная вероятность по критерию х2 при множественном сравнении; РПЖ — рак предстательной железы; ПИН-2 — простатическая интраэпителиальная неоплазия высокой степени; БР — биохимический рецидив.
ки экспрессии гена РСАЗ в экзосомах мочи для прогноза раннего БР после РПЭ соответствовала 86 %. Площадь под ЯОС-кривой составила 0,812 ± 0,0003 (р < 0,0001), что свидетельствовало о высокой информативности метода.
ОБСУЖДЕНИЕ
В исследовании было установлено, что у пациентов основной группы при сочетании аденокар-циномы ПЖ и ПИН-2 в перитуморальной зоне по сравнению с группой сравнения БР встречался чаще (26 % против 10 %). В ранних работах других авторов при гистологическом исследовании операционных биоптатов ПЖ у пациентов с верифицированным РПЖ указывалось на сочетание аденокарциномы и ПИН в 40-73 % случаев [7]. В работах З.А. Юрмазова и др. (2010) отмечено более агрессивное течение онкологического заболевания при одновременном сочетании РПЖ + ПИН: исходно установлен более высокий уровень ПСА в крови, мультифокальность опухоли, чаще встречались периневральная инвазия и низкая степень дифференцировки опухоли, плотность рецепторов НБК2/пеи на мембранах злокачественных клеток была выше [8].
В клинической практике рецидивирование РПЖ отслеживают при помощи динамичной лабораторной оценки содержания ПСА в сыворотке крови.
Однако определение уровня ПСА только в сыворотке крови в 1,7-67 % случаев приводит к гипердиагностике прогрессирования РПЖ [9]. Несмотря на разработанную тактику и дополнительные стратегии оценки мониторинга ПСА в сыворотке крови после операции у больных РПЖ с учетом возраста, скорости прироста и сроков удвоения уровня ПСА, изоформ маркера, «плотности» ПСА [9, 10] для повышения эффективности прогноза прогрессиро-вания заболевания после хирургического лечения изучают широкий спектр биохимических и молеку-лярно-генетических маркеров в различных биологических жидкостях и тканях. В работах О.И. Апо-лихина и др. [6] в качестве перспективного теста для диагностики РПЖ была предложена оценка экспрессии РСАЗ в осадке мочи и экзосомах. Эк-зосомы как объект для генетических исследований ввиду наличия в их составе мРНК и их участия в межкоммуникативных информационных связях между клетками начали использовать с 2007 г. [11]. Опухолевые клетки продуцируют больше экзо-сом, чем неопухолевые. Доказано участие экзосом в формировании преметастатических ниш, ремо-делировании опухолевого микроокружения [12]. Опухолевые клетки «подготавливают» премета-статическую зону через дистанционную передачу информации, в том числе посредством экзосом. До попадания раковой клетки такая ниша считает-
ся преметастатической, а после попадания в такую микросреду опухолевые клетки начинают активно делиться. Применение методики позволило улучшить раннее выявление РПЖ, сократить «ненужные» биопсии органа.
В продолжение разработки неинвазивной мониторинговой системы наблюдения за больными РПЖ нами была проведена оценка экспрессии гена РСА3 в осадке и экзосомах мочи у больных РПЖ с развитием БР и без рецидивирования заболевания в начале наблюдения за пациентами до операции. Такой подход позволил оценить прогностическую значимость показателя экспрессии гена РСА3 в осадке и экзосомах мочи для определения риска раннего рецидивирования заболевания еще на этапах подготовки к операции.
Поскольку уровень Да РСА3-КЬК3 в экзосомах мочи, равный 1,48, был предложен в работе О.И. Аполихина и др. [6] с целью прогнозирования риска развития РПЖ при дифференциальном анализе с доброкачественными процессами, то нами был использован ROC-анализ для дальнейшего поиска уровня порогового цикла а и выделения больных с высоким риском рецидивирования заболевания при наличии ПИН-2 в перитуморальной зоне.
В результате было установлено, что уровень экспрессии гена РСА3 в экзосомах мочи у больных при одновременном сочетании аденокарциномы ПЖ и ПИН-2 в перитуморальной зоне был выше при последующем рецидивировании по сравнению с благоприятным течением заболевания. Таким образом, наличие в перитуморальной зоне ПИН-2, повышенная экспрессия гена РСА3 в экзосомах мочи были сопряжены с развитием БР. При этом если у пациентов с аденокарциномой ПЖ и наличием ПИН-2 в перитуморальной зоне АС РСА3-К1К3 в экзосомах мочи был ниже значения -2,6 включительно, то с диагностической чувствительностью 88 % и диагностической специфичностью 86 % можно говорить о высоком риске БР в ближайшие 24 месяца после РПЭ.
Для определения риска рецидивирования опухолевого заболевания при сопутствующих изменениях перитуморальной зоны эффективна также оценка экспрессии гена РСА3 в осадке мочи, но в ограниченном диапазоне. Так, при снижении в осадке мочи РСА3-К1К3 менее 1,86 включительно БР у пациентов с РПЖ и ПИН-2 в перитумо-ральной зоне развивались чаще (84 % против 51 %, р = 0,013).
Полученные нами результаты согласуются с данными других авторов, которые анализировали экспрессию гена РСА3 наряду с другими генами с простатспецифичной экспрессией в цельной моче, осадке мочи и экзосомах мочи [6, 13]. Авторы подчеркивали информативность исследования указанных биологических жидкостей при дифференциальной диагностике между злокачественными и доброкачественными опухолями в ПЖ.
В нашей работе было установлено, что оценка экспрессии гена РСА3 в осадке и экзосомах мочи информативна, но имеет определенные ограничения для прогноза развития БР в ближайшие 2 года после РПЭ.
Полученные нами данные имеют клиническую и практическую значимость, поскольку способствуют выделению групп повышенного риска биохимического рецидивирования у пациентов с локализованным РПЖ после РПЭ по итогам исходной неинвазивной оценки экспрессии гена РСА3 в осадке и экзосомах мочи и гистологическом исследовании операционных образцов ткани ПЖ в периту-моральной зоне. Доказательства информативности оценки экспрессии белкового онкомаркера в осадке и экзосомах мочи до операции, а также гистологического исследования перитуморальной зоны ПЖ после операции для анализа риска раннего рециди-вирования РПЖ и выделения пациентов для более тщательного послеоперационного мониторинга скорректировали имеющиеся знания о способах оценки прогрессирования заболевания.
ВЫВОДЫ
1. Прогностическая значимость оценки экспрессии гена РСА3 в осадке и экзосомах мочи для определения риска БР после РПЭ повышается у больных с локализованным РПЖ и ПИН-2 в перитуморальной зоне.
2. При повышении экспрессии гена РСА3 в осадке и экзосомах мочи у больных с локализованным РПЖ и ПИН-2 в перитуморальной зоне риск БР в течение двух лет после РПЭ возрастает. Финансирование исследования. Исследование
не имело источников финансирования.
Конфликт интересов. У автора нет конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Толкач Ю.В., Рева С.А., Носов А.К., и др. Клиническая значимость генетической характеризации рака предстательной
оригинальные статьи
19
железы: обзор литературы // Онкоурология. - 2015. - № 2. -С. 99-106. [Tolkach YuV, Reva SA, Nosov AK, et al. Clinical Significance of Genetic Characterization of Prostate Cancer: A Review of Literature. Onkourologiya. 2015;(2):99-106. (In Russ.)]. doi: 10.17650/1726-9776-2015-11-2-99-106.
2. Сергеева Н.С., Скачкова Т.Е., Маршутина Н.В., и др. Клиническая значимость ПСА-ассоциированных тестов в диагностике и стадировании рака предстательной железы // Онкология. -2018. - № 1. - С. 55-67. [Sergeeva NS, Skachkova TE, Marshutina NV, et al. Clinical significance of PSA-associated tests in the diagnosis and staging of prostate cancer. Onkologija. 2018;(1):55-67. (In Russ.)]. doi: 10.17116/onkolog20187155-67.
3. Шкурников М.Ю., Алексеев Б.Я. Ассоциация экспрессии генов рецепторов фактора роста тромбоцитов альфа и бета (PDGFRA и PDGFRB) с биохимическим рецидивом рака предстательной железы после радикальной простатэкто-мии // Онкоурология. - 2017. - Т. 13. - № 4. - С. 45-50. [Shkurnikov MYu, Alekseev BYa. Association of gene expression of platelet-alpha-beta-beta receptor (PDGFRA and PDGFRB) receptors with biochemical recurrence of prostate cancer after radical prostatectomy. Onkourologiya. 2017;13(4):45-50. (In Russ.)]. doi: 10.17650/1726-9776-2017-13-4-45-50.
4. Михайленко Д.С., Новиков А.А., Григорьева М.В., и др. Сравнение экспрессии гена РСА3 в осадках и экзосомах мочи при раке предстательной железы // Онкоурология. -2017. - Т. 13. - № 3. - С. 54-60. [Mihajlenko DS, Novikov AA, Grigor'eva MV, et al. Comparison of the expression of the PCA3 gene in precipitates and urine exosomes in prostate cancer. Onkourologiya. 2017;13(3):54-60. (In Russ.)]. doi: 10.17650/17269776-2017-13-3-54-60.
5. Коган М.И., Чибичян М.Б., Водолажский Д.И. Изменение экспрессии генетических локусов в мононуклеарной фракции периферической крови больных раком предстательной железы // Клиническая онкология. - 2012. - № 5. - С. 59-60. [Kogan MI, Chibichjan MB, Vodolazhskij DI. Change in the expression of genetic loci in the mononuclear fraction of peripheral
blood of patients with prostate cancer. Klinicheskaja onkologija. 2012;(5):59-60. (In Russ.)]
6. Аполихин О.И., Сивков А.В., Ефремов Г.Д., и др. РСА3 и TMPRSS2: ERG в диагностике рака предстательной железы: первый опыт применения комбинации маркеров в России // Экспериментальная клиническая урология. - 2015. - № 2. -С. 30-35. [Apolikhin OI, Sivkov AV, Efremov GD, et al. The first Russian experience of using PCA3 and TMPRSS2-ERG for prostate cancer diagnosis. Experimental'naya klinicheskaya urologiya. 2015;(2):30-5. (In Russ.)]
7. Mc Neal JE. Origin and development of carcinoma in the prostate. Cancer. 1969;23:24-34.
8. Юрмазов З.А., Васильев Н.В. Клинические и морфологические особенности рака предстательной железы в сочетании с ПИН // Сибирский онкологический журнал. - 2010. - Приложение № 1. - С. 118. [Jurmazov ZA, Vasil'ev NV. Clinical and morphological features of prostate cancer in combination with PIN. Sibirskijonkologicheskijzhurnal. 2010;(Suppl. 1):118. (In Russ.)]
9. Loeb S, Bjurlin MA, Nicholson J, et al. Overdiagnosis and over-treatment of prostate cancer. Eur Urol. 2014;65(6):1046-1055. doi: 10.1016/j.eururo.2013.12.062.
10. Adhyam M, Gupta AK. A review on the clinical utility of PSA in cancer prostate. Indian J Surg Oncol. 2012;3(2):120-129. doi: 10.1007/s13193-012-0142-6.
11. Valadi H, Ekstrom K, Bossios A, et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 2007;9:654-659. doi: 10.1038/ ncb1596.
12. Молекулярный канцерогенез / Под ред. М.А. Красильникова, И.Б. Зборовской. - М.: АБВ-пресс, 2016. - 418 c. [Molecular carcinogenesis. Ed by M.A. Krasil'nikov, I.B. Zborovskaya. Moscow: ABV-press; 2016. 418 p. (In Russ.)]
13. Louie KS, Seigneurin A, Cathcart P, Sasieni P. Do prostate cancer risk models improve the predictive accuracy of PSA screening? A meta-analysis. Ann Oncol. 2015;26(5):848-64. doi: 10.1093/ annonc/mdu525.
Сведения об авторе: Information about the author:
филипп Сергеевич Бова — канд. мед. наук, докторант, ФГБУ Philip S. Bova — Candidate of Medical Sciences, Doctorant,
«Ростовский научно-исследовательский онкологический инсти- Rostov State Scientific Research Institute of Oncology of the
тут» Минздрава России, Ростов-на-Дону; руководитель центра Ministry of Health of Russia, Rostov-on-Don, Russia; Head,
урологии, нефрологии и гемодиализа, гБУ Ростовской области Center of Urology, Nephrology and Hemodialysis of the Rostov
«Областная больница № 2», Ростов-на-Дону. E-mail: alald@ Region State Regional Hospital "Regional Hospital No 2". Rostov-
inbox.ru. on-Don, Russia. E-mail: [email protected].
