CC BY
46
HayKOBHH ßicHHK .HbBiBCbKoro Ha^oHaibHoro ymBepcurery BeTepHHapHoi' mcahuuhh Ta 6i0TexH0^0riH iMeHi C.3. I^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies
doi: 10.15421/nvlvet8201
ISSN 2518-7554 print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
УДК 619:616.523:615.381
Особливосл застосування екстракту алое у технологи культивування repnecBipyciB
К.О. Дроботюк, Т.О. Романишина, В.С. Прокопенко [email protected], tveterinar@ gmail.com, ogp.zt2013@ gmail.com
Житомирський нацгональний агроеколог1чний утверситет, вул. Корольова, 39, Житомир, 10002, Украгна
Вивчеш особливостг застосування екстракту алое у технологи культивування герпесвгрусгв на перещеплювальнт куль-тург клтин тестикул поросяти. Перед нами були поставлен таю завдання: тдгбрати культуру клтин та концентраци екстракту алое для визначення токсичног дози препарату; вивчити прояв ЦПД заражених герпесвгрусом культур клтин при ргзних концентращях препарату; визначити тфекцшну актившсть вгрусу тсля його пасажування на культург клтин при застосуванш екстракту алое. Робота виконувалася на факультетг ветеринарног медицини, в навчально-дослгднгй лабораторп етзоотологи кафедри мжробюлогп, фармакологи та етзоотологи Житомирського Нацюнального агроеколо-ггчного утверситету. Матергалом дослгджень були: перещеплювальна культура клтин тестикул поросяти, герпесвгрус коней 1-го типу та стерильний екстракт алое. Культивування культур, зараження гх вгрусом i визначення його концентраци тсля контакту з культурою та внесення екстракту алое проводили у стерильних умовах за загальноприйнятими методиками. Облт результатiв проводили щоденно, звертаючи увагу на змту кольору середовища, цтстсть моношару та наявтсть клтин у середовищi. Паралельно iз зараженими вели спостереження за контрольними, незараженими, культурами клтин. 1нкубування припиняли при руйнувант 90-100% моношару клтин. В результатi проведеног роботи доведено, що екстракт алое в дозi 0,14-0,28 мг на 1 см3 ростового середовища дозволяе на 2-у добу переЫву спостерiгати цiлiс-ний щыьний моношар у матрац без змт кольору, а також, посилен процеси росту i регенераци клтин та метаболiзму епiтелiальноi тканини перещеплювальног культури клтин тестикул поросят, що дае змогу скоротити час на вирощування нового моношару для подальших вiрусологiчних та iмунологiчних до^джень. Застосування даного препарату сприяе збi-льшенню концентраци клтин у матрацах, що, своею чергою дозволяе тдвищити концентращю вiрусу на 1 -2 log2 за вико-ристання аналогiчних об 'емiв ростового середовища без екстракту алое. Такий модифжований споЫб збыьшення бюмаси клтин придатний для подальшого розмноження вiрусiв i виготовлення дiагностичних антигетв з меншими економiчними витратами. Використання даного методичного тдходу дозволить виршитинизку завдань, пов'язаних з накопиченням вiрусiв та виробництвом препаратiв для дiагностики та профилактики вiрусних тфекцт.
Knmnoei слова: перещеплювальна культура клтин тестикул поросяти, культивування, екстракт алое, герпесвiрус коней.
Особенности исспользования экстракта алоэ в технологии культивирования герпесвирусов
Е.А. Дроботюк, Т.А. Романишина, В.С. Прокопенко [email protected], tveterinar@ gmail.com, ogp.zt2013@ gmail.com
Житомирский нацоональный агроекологический университет, ул. Королёва, 39, Житомир, 10002, Украина
В статье изучены особености исспользования экстракта алоэ в технологии культивирования герпесвирусов на перевиваемой культуре клетик тестикул поросёнка. Перед нами были поставлены такие задания: подобрать культуру клеток и
Citation:
Drobotiuk, K.O., Romanyshyna, T.O., Prokopenko, V.S. (2017). Pecularities of aloe extract application in the cultivation technology of herpes viruses. Scientific Messenger LNUVMB, 19(82), 3-7.
концентрации экстракта алоэ для определения токсической дозы препарата; изучить проявление ЦПД зараженных герпе-свирусом культур клеток при разных концентрациях препарата; определить инфекционную активность вируса после его пасажирования на культуре клеток при исспользовании экстракта алоэ. Работу проводили на факультете ветеринарной медицины, в учебно-экспериментальной лаборатории эпизоотологии кафедры микробиологии, фармакологии и эпизоотологии Житомирського национального агроэкологического университета. Для исследований использовали: перевиваемую культуру клеток тестикул поросенка, герпесвирус лошадей 1-го типа и стерильний экстракт алоэ. Культивирование культур, заражение их вирусом и определение его концентрации после контакта с культурой и добавления экстракта алоэ проводили в стерильных условиях по общепринятым методикам. Учет результатов проводили ежедневно, обращая внимание на изменение цвета среды, целосность моношара и наличие клеток в среде. Паралельно с зараженными наблюдали за контрольными, незараженными, культурами клеток. 1нкубирование останавливали тогда, когда 90-100% моношара клеток было разрушено. В результате сделанной работы было доказано, что экстракт алоэ в дозе 0,14-0,28 мг на 1 см3 ростовой среды позволяет на 2-ой день пересева наблюдать целосный моношар в матраце без изменения цвета, а также, усиленный рост и регенерацию клеток и метаболизма эпителиальной ткани перевиваемой культуры клеток тестикул поросенка, что позволяет сократить время для выращивания нового моношара для дальнейших вирусологических и имунологических исследований. Исспользование даного препарата увеличивает концентрацию клеток в матрацах, что, в свою очередь, позволяет повысить концентрацию вируса на 1-2 log2 при исспользовании аналогических обемов среды без экстракта алоэ. Такой модифицирований способ увеличения биомассы клеток подходит для дальнейшего размножения вирусов и изготовления диагностических антигенов с меньшими экономическими растратами. Использование даного методического подхода позволит решить ряд задач, связанных с накоплением вирусов и производством препаратов для диагностики и профилактики вирусных инфекций.
Ключевые слова: перевиваемая культура клеток тестикул поросенка, культивирование, экстракт алоэ, герпесвирус лошадей.
Pecularities of aloe extract application in the cultivation technology
of herpes viruses
K.O. Drobotiuk, T.O. Romanyshyna, V.S. Prokopenko [email protected], tveterinar@ gmail.com, ogp.zt2013@ gmail.com
Zhytomyr National Agroecological University, Koroleva Str., 39, Zhytomyr, 10002, Ukraine
In the article there are studied peculiarities of aloe extract application in the cultivation technology of herpes viruses on the re-cultivating culture of testicular piglets cells. We were faced with the following tasks: to select a cell culture and aloe extract concentration to determine the toxic dose of the drug; to study the manifestation of the cytopathic effect in cell cultures infected with herpesvirus at different drug concentrations ; to determine infectious virus activity after its passage on the cells culture with the use of aloe extract. The work was carried out at the faculty of veterinary medicine, in the educational-research laboratory of epizootolo-gy department of microbiology, pharmacology and epizootology of the Zhytomyr National Agroecological University. The research materials included: the re-cultivating culture of testicular piglets, horse herpes virus of the first type and sterile aloe extract. Cultivation of crops, infection with the virus and determination of its concentration after contact with culture and the introduction of aloe extract were carried out under sterile conditions according to the generally accepted methods. The results were recorded daily, paying attention to the environment color changing, the integrity of the monolayer and the presence of cells in the medium. Along with the infected cells we were observing additional, uninfected, cultures of cells. The Incubation process was stopped at the destruction of 90-100% cell monolayer. As a result of this work, it is proved that the aloe extract in a dose of 0.14-0.28 mg per cm3 of growth medium allows to observe for the 2nd day of replanting a solid dense monolayer in the mattress without color changing, as well as enhanced growth and regeneration of cells and the metabolism of the epithelial tissue of the re-cultivating culture of testicu-lar piglets, which makes it possible to shorten the time to grow a new monolayer for further virological and immunological studies. The use of this drug helps to increase cells concentration in the mattresses, which, in turn, can increase the concentration of the virus to 1 -2 log2 for the use of similar amounts of growth medium without aloe extract. Such modified way to increase the biomass of cells is suitable for the further multiplication of viruses and the production of diagnostic antigens with lower economic costs. The use of this methodical approach will allow to solve a number of tasks related with accumulation of viruses and the production of drugs for the diagnosis and prevention of viral infections.
Key words: re-cultivating cultures of testicular piglets cells, cultivation, aloe extract, herpesvirus of horses.
Вступ
Культури клггин (первинш культури, штами кль тин i клггинш тни, виготовлеш з тканин лаборатор-них тварин) використовують для видшення i розмно-ження вiрусiв, 1хньо! вдентифшацп, накопичення як антигешв при виготовленш дiагностикумiв i противь русних вакцин в сучасних вiрусологiчних лабораторь ях i на бюфабриках. Впровадження культури клгтин у вiрусологiчну практику вадсунуло на другий план
використання лабораторних тварин i курячих ембрю-шв.
Масове вирощування клгган у культурi е центральною ланкою технолопчного процесу вироб-ництва вiрусних препарапв. Вона зшмае видовi об-меження культивування вiрусiв, оскшьки in vitro можна вирощувати будь-яш клггани рiзних видiв тварин. Ця стада визначае шльшсть i яшсть клгтин та тим самим в цшому технолопю отримання бюмаси вiрусу. Немае едино! кгаганно! культури, яка була б придатною для видшення будь-якого вiрусу. Тому в
лабораторий дiагностицi зазвичай застосовують калька видiв культур залежно вщ того, який вiрус перед-бачаеться видiлити. Ефективнiсть технологи отри-мання вiрусноl сировини залежить вiд використання штаму вiрусу, клиинно! системи, способу накопичен-ня бiомаси клiтин i вiрусу тощо.
У вiрусологiчнiй практищ найчастiше використо-вують одношарову (моношарову) культуру клiтин. Це клiтини in vitro, одержат в результатi диспергування тканин, як1 прикрiплюються до субстрату i розмно-жуються, утворюючи моношар (на склi пробiрок, флаконiв, матращв).
Для культивування культури клiтин використову-ють поживнi середовища до яких додають ембрюна-льну сироватку та антибютики (Golubev et al., 1976; Sergeev, 1976; Vahtin and Sominina, 1988; Sjurin et al., 1991; Ganiev, 2007). Залежно вiд типу культури клиин середовища рiзняться сво!м як1сним та кiлькiсним складом. Експериментальним шляхом автори добирали оптимальш концентрацп речовин, що сприяли яшснш пролiферацi! та функцiонуванню культури (Sjurin et al., 1991).
Так, у певних середовищах метиться подвiйна концентращя амiнокислот, лiзин, серин, пiруват заль за, глюкоза, альбумiни, трансферин, лшвди, бiотин, вiтамiн В12, селенiт натрш (Iscove and Melchers, 1979; Iscove, 1984), параамшобензойна кислота, глю-татюн, шозит (Patterson and Dell'orco, 1978), цинк, купрум, ненасиченi жирнi кислоти. Ряд авторiв досягали безсироваткового росту рiзних клiтин, застосо-вуючи стандартш середовища i замiнюючи сироватку специфiчним для даного клiтинного типу набором гормошв, гормоноподiбних ростових факторiв, транспортних бiлкiв (глюкагон, фолшулотрошн, гидрокортизон, прогестерон, iнсулiн, трансферин) (Barnes and Sato, 1980).
Недолжом таких методичних пiдходiв е те, що бь льшiсть стимуляторiв е дороговартюними, високоспе-цифiчними (фактори росту) i зазвичай отримуються з сироватки кровi, що ставить тд сумшв ввдсутшсть вiрусноl чи прюнно! контамшаци. Актуальним питан-ням сьогодення залишаеться пошук недорогих стиму-ляторiв росту, при застосуванш яких концентрацiю будуть зберiгатись морфологiчнi особливостi клiтин
культури, збшьшиться !х бiомаса (для накопичення вiрусу) та вiдповiдно шдвищиться концентрада вiрусу при внесеннi його у дослвджуваш культури.
Поставлене завдання ми спробували вирiшити шляхом застосування стерильного екстракту алое, який прискорюе репаративш та пролiферативнi про-цеси у тканинах макроорганiзмiв.
Метою нашо'1 роботи було визначити особливосл застосування екстракту алое у технологи культивування герпесвiрусiв.
Для досягнення мети перед нами були поставленi такi завдання:
1) пщбрати культуру клiтин та концентрацп екстракту алое для визначення токсично! дози препарату;
2) вивчити прояв ЦПД заражених герпесвiрусом культур клiтин при рiзних концентращях препарату;
3) визначити iнфекцiйну актившсть вiрусу пiсля його пасажування на культурi клiтин при застосуваннi екстракту алое.
MaTepia™ i методи дослвджень
Робота виконувалася на факультетi ветеринарное' медицини, в навчально-дослiднiй лабораторi! етзоо-тологi! кафедри мiкробiологi!, фармакологi! та етзоо-тологi! Житомирського Нацiонального агроеколопч-ного унiверситету.
Матерiалом до^джень були перещеплювальна культура клiтин тестикул поросяти, герпесвiрус коней 1-го типу (штам «Буковина») та стерильний екстракт алое. Для культивування культури клиин використо-вували склянi матраци об'емом 20 см3, яш зберiгали в термостат при +37,5°.
Через 2-3 доби шсля пересiву формувався 90-100% моношар, котрий використовували для заражения вiрусом i внесення середовища з рiзними концентрацiями екстракту алое. Зараження вiрусом i визначення його концентрацп тсля контакту з культурою проводили за загальноприйнятими методиками (Sjurin et al.,1991). При цьому ростове середовище зливали i замiнювали на пвдтримуюче з вмiстом препарату. Схема постановки експерименту наведена в таблищ 1.
Схема внесення екстракту алое на моношар культури клгтин тестикул поросяти
Таблиця 1
Одиниця вимiрювання / № до^ду № 1 № 2 № 3 № 4 № 5 № 6
Об'ем середовища у матращ (мл) 0 1 1,5 1,75 1,875 1,94
Об'ем екстракту алое у матращ (мл) 2 1 0,5 0,25 0,125 0,063
Концентращя екстракту алое у матращ (%) 100 50 25 12,5 6,25 3,125
Маса сухо! речовини алое в перерахунку на 1см3 середовища (мг/см 3) 2,25 1,125 0,56 0,28 0,14 0,07
При вивченш дп рiзних концентрацiй екстракту алое були використаш 18 матращв-флакошв (з розра-хунку - 3 матраци на кожну дозу препарату), яш ку-льтивували на ростовому середовищi такого складу: середовище 199 (90%) + 10% сироватки велико! рогато! худоби, гентамщин та екстракт алое. Екстракт алое вносили на клпини в дозах вщ 0,063 до 2 см3 на
1 матрац. Вищевказаш культури клиин культивували протягом 10 днiв.
Облш результатiв проводили щоденно, звертаючи увагу на змiну кольору середовища, цшсшсть моношару та наявнiсть клиин у середовищi.
Паралельно ¡з зараженими вели спостереження за контрольними, незараженими, культурами клиин.
1нкубування припиняли при руйнуванш 90-100% моношару клгган. Гемаглютинувальну актившсть в1русу з уах дослщних матратв визначали у РГА.
Результати та Ух обговорення
Результати в1русолопчних дослщжень навчально-дослвдно! лаборатори кафедри шкробюлоги, фармакологи та етзоотологи Житомирського Нацюнально-го агроеколопчного ушверситету дозволили нам зу-пинитись на перещеплювальнш культур! тестикул поросят 1 адаптованому до не! герпесв1русу першого типу (штам «Буковина») з визначеною гемаглютину-вальною актившстю 4 ГАО.
Для вивчення стану культур тд впливом р1зних доз екстракту алое нами було сформовано 6 вар1антш
Рис. 1. Стан моношару контрольноУ культури клггин тестикул поросят на 3-ю добу культивування (х120)
дослщв. Використовували по 3 матраци на кожну дозу екстракту алое ввдповщно для дози 2,25 мг/см3 -матраци № 1, 2, 3; 1,125 мг/см3 - № 4, 5, 6; 0.56 мг/см3 - № 7, 8, 9; 0,28 мг/см3 - № 10, 11,12; 0,14мг/см3 -№13, 14, 15; 0,07 мг/см3 - № 16, 17, 18. Контролем служили 3 матраци культури такого ж в1ку без застосування препарату (рис. 1).
За культурами спостерпали щодня в1зуально - за змшами кольору середовища 1 пвд мжроскопом при малому збшьшенш (8 х 15), звертаючи увагу на форму 1 розм1ри клггин та р1вном1ршсть моношару. Як видно з рисунка 2, при застосуванш екстракту алое на клггани тестикул поросят у дозах 0,14-0,56 на 2-у добу експерименту м1жклгганш зв'язки стають бшьш чпгсими, а клггани з яскравими морфолопчними озна-ками.
ЙГ
дай
Рис. 2. Стан моношару культури клiтин тестикул поросят на 3-ю добу культивування з концентращею алое 0,14 мг/см3 (х120)
Кол1р середовища у перших двох вар1ащях дослвду зм1нювався тсля внесення екстракту алое з яскрово-гранатового кольору на свпло-червоний, що поясню-емо повним припиненням росту клгган, а в останньо-му змшився до яскраво-жовтого, отже тут препарат не одразу под1яв на геном клгган.
На третю добу тсля зараження у матрацах № 1-6 1 на четверту в матрацах № 7-9 цшстсть моношару порушилась (рис. 3). Через 24 години у перших двох експериментах вщбулася повна загибель клгган.
У четвертому 1 п'ятому дослщах спостерпали ная-втсть клгган з хвостопод1бними ввдростками. При вивчент дози 0,14 мг/см3 1 0,28 мг/см3 на четверту
Рис. 3. Прояв ЦПД на культурi клiтин тестикул поросят з дозою екстракту алое 2,25 мг на 1 см3, на четверту добу тсля внесення вiрусу. х240
добу культивування у матрацах № 10-12 1 13-15 спо-стерпати цшсний щшьний моношар без змш кольору, збшьшення розм1ру клгган, м1жклггант зв'язки ставали б1льш чикими, а також посилювалися проце-си росту 1 регенераци клгган та метабол1зму. Цитопа-тична д1я в1русу почала проявлятися на шосту добу тсля внесення в1русу (рис. 4). У четвертш вар1аци дослщу на сьому добу клгган з хвостопод1бними ввд-ростками ми вже не спостерпали. Повне руйнування моношару вщбулося у третьому дослщ на 8, а в четвертому- на 9 добу. На десяту добу вс1 матраци були вибракуваш.
5*
Щ01 9 •
' - ' О
тгаЕз'
ЯШНР
Рис. 4. Стан культури клгтин тестикул поросят з дозою екстракту алое 0,14 мг на 1 см3, на шо-сту добу шсля внесення вiрусу. х240
У контрольних матрацах змшився кол1р середовища з яскравого-оранжевого до жовтого, а ввдшару-вання клиин почалося тшьки на 10 добу, внаслвдок старшня моношару.
Таким чином, екстракт алое високих концентрацш (вище н1ж 0,56 мг на 1 см3) проявляе на культуру клиин консервуючу та пригшчуючу дш, про що свщ-чить вщсутшсть моношару, змша кольору середовища та наявшсть мертвих клиин в середовища
Як видно з результата експерименту, концентрацй' екстракту алое 0,14-0,28 мг на 1 см3 in vitro стиму-люють процеси регенерацп клиин та метабол1зму еп1тел1ально! тканини перещеплювано! культури кль
тин тестикул поросят та вщповщно сприяють зб1ль-шенню концентрацп клиин у матращ для накопичен-ня в1русу.
Для визначення активносп в1русу ва матраци i3 культурами клiтин пвдлягали послвдовному триразо-вому заморожуванню-вiдтаюванню, що забезпечувало руйнування стiнок клiтин i вихвд вiрусу. Iндикацiю наявностi антигену та визначення його концентрацй' проводили у культуральнш рвдиш всiх дослвдних матрацiв. Результата гемаглютинувально! активностi герпесвiрусу на культурах клиин тестикул поросяти, визначення РГА подат у таблищ 2.
Гемаглютинувальна активнiсть repnecBipycy в досл1дних матрацах, визначена у РГА
Таблиця 2
Актившсть вiрусу , ГАО Варiант дослщу
1 2 3 4 5 6
1 log2 2 log2 2 log2 3 log2 4 log2 2 log2
Як видно з таблищ 1, концентрацп екстракту алое 0,14-0,28 мг на 1 см3 in vitro сприяе збшьшенню концентрацп вiрусу в матрацах, що пояснюемо збшьшен-ням бюмаси клiтин у матращ як об'екпв для розмно-ження i вiдповiдно накопичення герпесвiрусiв.
Отже, одшею з переваг застосування екстракту алое у культивуванш клiтинних культур серед шших об'ектiв дослiдження е можливють тривалого спосте-реження за життедiяльнiстю клiтин, за станом окре-мих клiтинних органел, за процесами, що вщбувають-сяв в клиинах, фiксувати стан культури з урахуван-ням кiлькiсних i як1сних параметрiв.
Висновки
1. Додавання екстракту алое в дозi 0,140,28 мг/см3 ростового середовища дозволяе на 2-у добу переаву спостерiгати цiлiсний щшьний моношар у матрацi без змш кольору, а також посилен процеси росту i регенерацй' клиин та метаболiзму епiтелiальноl тканини перещеплювально! культури клiтин тестикул поросят, що дае змогу скоротити час на вирощування нового моношару для подальших вiрусологiчних та iмунологiчних дослвджень.
2. Застосування даного препарату сприяе збшьшенню концентрацп клиин у матрацах, що своею чергою, дозволяе шдвищити концентрацш вiрусу на 1-2 log2 за використання аналогiчних об'емiв ростового середовища без екстракту алое.
3. Такий споаб збiльшення бiомаси клиин прида-тний для подальшого розмноження вiрусiв i виготов-лення дiагностичних антигенiв з меншими економiч-ними витратами.
Перспективи подальших дослгджень. Використання даного методичного шдходу дозволить виршити ряд завдань, пов'язаних з накопиченням вiрусiв i ви-робництвом препаратiв для дiагностики та профшак-тики вiрусних iнфекцiй.
Бiблiографiчнi посилання
Vahtin, Ju.B., Sominina, A.A. (1988). Metody kul'tiviro-
vanija kletok. L.: Nauka (in Russian).
Ganiev, I.M. (2007). Primenenie kombinacij syvorotok krovi razlichnyh vidov zhivotnyh dlja kul'tivirovanija kletok i reprodukcii virusov. avtoref. diss. na soisk. uch. st. kand. biol. nauk; 03.00.23 «Biotehnologija» Ul'janovsk, 22 (in Russian).
Golubev, D.B., Sominina, A. A., Medvedeva, M.N. (1976). Rukovodstvo po primeneniju kletochnyh kul'tur v virusologii. M. (in Russian).
Novohatskij, A.S. (1979). Tkanevye i kletochnye kul'tury v virusologii i molekuljarnoj biologii. M. (in Russian).
Sergeev, V.A. (1976). Reprodukcija i vyrashhivanie virusov zhivotnyh. M.: Kolos (in Russian).
Sjurin, V.N., Belousova, R.V., Fomina, N.V. (1991). Diagnostika virusnyh boleznej zhivotnyh. Spravochnik. M. : Agroproizdat (in Russian).
Freshni, R. (1989). Kul'tura zhivotnyh kletok. Metody. Perevod s ang. pod red. R. Freshni. M.: Mir (in Russian).
Iscove, N.N., Melchers, F. (1979). Complete replacement of serum by albumin, transferrin and soybean lipid in cultures of lipopolysaccharide reactive B lymphocytes. J. Exp. Med. 147, 923-933.
Iscove, N.N. (1984). Culture of lymphocytes and hemopoietic cells in serum-free medium. Methods for serum-free culture of neuronal and lymphoid cells. New York, 169-185.
Patterson, M.K., Dell'orco, R.T. (1978). Preparation of McCoy's madium 5A. Tissue Cult. Assoc. Manual. 4, 737-740.
Ham, R.G., McKeehan, W.L. (1979). Media and growth requirements. Methods in enzymology. New York. 58, 44-93.
Ham, R.G. (1963). An improved nutrient solution for diploid Chinese hamster and human cell lines. Exp. Cell Res. 29, 515-526.
Ham, R.G. (1984). Selective media j j Cell separation. New York. 3, 20.
Barnes, D., Sato, G. (1980). Serum-free cell culture: a unifying approach. Cell. 22, 649-655.
Received 20.09.2017 Received in revised form 23.10.2017 Accepted 27.10.2017
