CC BY
23
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro Ha^0Ha№H0ro ymBepcurery BeTepHHapHOi MegnuUHH Ta 6i0TexH0H0riH iMeHi C.3. f^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyj
doi: 10.15421/nvlvet7002
ISSN 2413-5550 print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
УДК 619:636.1
Визначення термшу збер^ання та стабшьносл шфекцшно'! активностi культуральних антигенiв штаму ГВК 1 Ж та клону ГВК 2 ТТ
для постановки РДП
Встановлено, що джерелом збудника ГВК-1 та ГВК-2 е жеребц та кобили старше року. Удосконалили рашше запро-поноват серологiчнi методи дiагностики. З метою отримання антигетв проведено культивування герпесвiрусу першого типу на перещеплювальнт культурi клтин епiтелiю тестикули поросяти. Герпесвiрус другого типу - на перещеплювальнт культурi клтин ептелт трахеI теляти. Для визначення тфекцтног активностi культуральноI вiрусовмiсноi рiдини проводили в реакцп гемаглютинацп з суспензiею еритроцитiв коня. Вiруснi антигени для постановки реакцп дифузноi пре-циштацп, щодо герпесвiрусноi тфекцп першого та другого типу у коней до^джували на мжробну контамтацт.
Виявлено, що зберiгання культурального консервованого антигену ГВК 1 в замороженому стаю при температурi мтус 18 °С можна проводити протягом 12 мкящв, остльки тфекцтна активтсть його в нативному стан не змтилаль протя-гом вказаного перiоду.
З'ясовано, що при концентруванш антигену ГВК 1 оптимальне його розведення становить 1:20. При оцтщ антигена ГВК 2 придатним для постановки реакцп дифузiйноi прециттацп (РДП) е його концентращя вiд 1:60 до 1:20. Концентро-ваний антиген ГВК 2 в 30 раз, придатний до використання в розведенн 1:2 в РДП, а при розведен 1:4 не завжди утворюе специфiчну лтт прециттацп.
Ключовi слова: герпесвiрус, тфекщя, культивування, вiрусна рiдина, антиген, жеребщ, кобили, реакцiя дифузiйноi пре-циштацп (РДП), робоча доза, суспензiя еритроцитiв, лтя прециштацп, гiперiмунна сироватка, живильне середовище.
Определение срока хранения и стабильности инфекционной активности культуральных антигенов штамма ГВК 1 Ж и клонам ГВК 2 ТТ
для постановки РДП
Установлено, что источником возбудителя ГВК-1 и ГВК-2 есть жеребцы и кобылы старше года. Усовершенствовали раньше предложенные серологические методы диагностики. С целью получения антигенов проведено культивирование герпесвируса первого типа на перевиваемой культуре клеток эпителия тестикулы поросенка. Герпесвирус второго типа -на перевиваемой культуре клеток эпителия трахеи теленка. Для определения инфекционной активности культуральной вирусовместительной жидкости проводили в реакции гемагглютинации с суспензией эритроцитов коня. Вирусные антигены для постановки реакции диффузионной преципитации к герпесвирусной инфекции первого и второго типа у лошадей исследовали на микробную контаминацию.
Citation:
Antonuk, A., Dyshkant, O., Nikitin, O. (2016). Determination of expiration and stability of infectious activity of cultural antigens of stamm of EHV date 1 G and clonals of EHV 2 TT for raising of RDP. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj, 18, 3(70), 8-12.
А.А. Антонюк, О.В. Дишкант, О.А. Нттш [email protected]
Житомирський нацюнальний агроекологiчний утверситет, Старий бульвар, 7, м. Житомир, 10002, Украта
А.А. Антонюк, О.В. Дышкант, О.А. Никитин [email protected]
Житомирский национальный агроэкологический университет, Старый бульвар, 7, г. Житомир, 10002, Украина
Выявлено, что сохранения культурального консервированного антигена ГВК 1 в замороженном состоянии при температуре минус 18 °С можно в течение 12 месяцев, поскольку инфекционная активность его не снизилась после шести месячного хранения в замороженном состоянии.
Выяснено, что при концентрации антигену ГВК 1 оптимальное его разведение представляет 1:20. При оценке антигена ГВК 2 пригодной для постановки реакции диффузионной преципитации (РДП) является его концентрация от 1:60 до 1:20. Концентрированный антиген ГВК 2 в 30 раз, пригодный к использованию в разведении 1:2 в РДП, а при разведенные 1:4 не всегда образует специфическую линию преципитации.
Ключевые слова: герпесвирус, инфекция, культивирование, вирусная жидкость, антиген, жеребцы, кобылы, реакция диффузионной преципитации (РДП), рабочая доза, суспензия эритроцитов, линия преципитации, гипериммунная сыворотка, питательная среда.
Determination of expiration and stability of infectious activity of cultural antigens of stamm of EHV date 1 G and clonals of EHV 2 TT for raising of
RDP
A. Antonuk, O. Dyshkant, O. Nikitin [email protected]
Zhytomyr national agroecological university, Staryj Boulevard, 7, Zhytomyr, 10002, Ukraine
Getting a culture herpesviridae antigens first and second types is possible using cell cultures inoculated epithelial pig testicles and tracheal calf respectively. The incubation herpesviridae first and second types should be conducted on the above lines in cell culture incubator at a temperature of 37,5 °C for up to 10 days. To maximize the release of virus from cell culture fluid viral after incubation need three frozen at temperatures from -18 °C to + 20 °C. The resulting liquid is purified viral the culture by centrifugation. Determining the infectious activity of the culture liquid viral performed in response hemagglutination of horse erythrocytes suspension, and the material is titrated to 1: 128 in the two recurrence. Accounting reaction was performed at 2, 4, 6 and 8 hours. Infectious material volumetric activity was 1:4. Getting antigens envisages concentrating liquid viral culture fluid by reverse dialysis. To do this, conducted a study to identify the optimal concentration of antigen suitable for setting reaction diffusion precipitation. At 1:10 antigen concentration result of different reactions, depending on the account of the diffusion precipitation reactions. When concentration of EHV-1 antigen was found that the optimum dilution for its RDP is 1:20. In assessing the EHV-2 antigen, found that suitable for setting reaction diffusion precipitation RDP is an antigen concentrated from 1:60 to 1:20. In practical terms, most rational use of antigen, concentrated 20 times.Keeping culture antigens can be conducted frozen at minus 18 ° C, for 12 months because after six months of storage of the frozen infectious activity was not decreased. And in research in 12 months noted a line of precipitation in native samples and serum diluted 1:2. Working antigens for diffuse precipitation reaction must be sterile on various forms of bacteria and fungi. Therefore, samples of viral antigens were plated on agar culture media for general purpose (plain agar), after having spent preserving antigen using 0.01% solution mertiolyatu rate of 0.1 sm3/1sm3 culture fluid. Using such an environment can detect material in the test organisms belonging to different morphological groups. Research sterility subjected to viral antigens, herpesviridae infection on the first type of herpesviridae infection and the second type.
Key words. Herpesvirus, infection, culturing, viral liquid, antigen, stallions, mares, reaction diffusion precipitation (PRD), the working dose, suspension of red blood cells, line ofprecipitation, hyperimmune serum, culture medium.
Вступ
Конярство e одшею i3 важливих галузей сшьського господарства Украши. Останшм часом в результат штенсивного ведення конярства спостертаеться тен-денщя до поширення латентного перебпу шфекцш-них захворювань (Galatjuk and Kan'ovs'kij, 2003). Серед них найбшьш поширеними е герпесвiруснi шфекцп першого (ГВК-1) та другого типу (ГВК-2) у коней. Герпесвiруснi шфекцп завдають значних економiчних збитшв конярству, яш складаються з втрати вщтво-рювально! здатносп конематок, вибраковки цшних племшних тварин, затрат на проведения ветеринарно-санггарних заходiв (Apatenko, 2003).
В природних умовах вiрус вражае коней, о^в i мулiв незалежно ввд стап, породи та вшу. Чистокровш кош бшьш сприйнятливi до збудника, шж нашвкровш i аборегенш породи. Захворювання, що виникло в конегосподарсга, набувае характеру стацюнарно! шфекцп. Гострий перебп- хвороби чергуеться з перюдами прихованого атипового
прояву, що значно ускладнюе постановку д1агнозу (Busol et al.,1996; Robinson, 2007).
У систем! заход1в боротьби з герпесв1русною шфекщею важливе значення мае надшна д1агностика хвороби. На сьгодшшнш день щентифжащя збудника в1руса герпеса проводиться в спещал1зованих лаборатор1ях i включае в1русолопчш (культуральш) дослщження та молекулярно-генетичш (ПЛР). На мюцях проводять клшко-ешзоотолопчш та серолопчш дослщження. Проте запропоноваш рашше серолопчш методи дiагностики вимагають подальшого удосконалення i це також стосуеться засобiв та методiв профшактики хвороби (Busol et al., 1996).
Актуальтсть теми. Серед найбшьш поширених шфекцшних захворювань коней е герпесвiруснi шфекцп. Дослщи, що проведеш доцентом М.Л. Радзиховським, вказують на те, що жеребщ е переносниками герпесвiрусiв, а зараження вщбуваеться саме пвд час парування тварин (Radzyhovs'kyj, 2006). В наших дослщженнях, яш
проводяться з 2004 року встановлено, що джерелом збудника ГВК-1 та ГВК-2 е жеребцi та кобили старше року. Це е надзвичайно актуальним питаниям ветеринарно'' науки i практики оск1льки потребуе удосконалення лабораторно! дiагностики ГВК-2 та л^вально-профшактичних заходiв.
Мета та завдання до^дження. Удосконалити лабораторнi методи дiагностики герпесвiрусних iнфекцiй коней, зокрема обумовлено! ГВК-1 чи ГВК-2 (або одночасно ураженням обома типами).
Матерiал i методи досл1джень
Дослiдження виконували згвдно з планом науково-дослвдних робгг кафедри мкробюлоги, фармакологii' та ешзоотологп Житомирського нацiонального агроекологiчного унiверситету та на базi Нагiрянськоi' фiлii' ПрАТ «Райз-Максимко», с. Нагiрянка Чорткiвського району Терношльсько! областi. Провели епiзоотологiчний мониторинг сумiсного перебiгу герпесвiрусно! iнфекцii' 1-го та 2-го титв та удосконалили iснуючi лабораторнi методи дiагностики.
Результати та Ух обговорення
З метою отримання антигенiв ми проводили куль-тивування герпесвiрусу першого типу на перещеплю-вальнiй культурi клiтин ештелш тестикули поросяти. Герпесвiрус другого типу культивували на перещеп-лювальнiй культурi клiтин епiтелiю трахе' теляти. 1нкубащю герпесвiрусiв першого та другого титв проводили на вищезгаданих лiнiях культур клгтин в термостатi при температурi 37,5 °С термiном до 10-ти дiб. Пiсля iнкубування вiрусовмiсну культуральну родину тричi переморожували при температурних режимах ввд -18 °С до +20 °С, для максимально!' руй-нацii' клiтин i звiльнення вiрусу. Отриману культура-льну вiрусовмiсну рвдину центрифугували (10 - 20 хвилин при 2000 об/хв., 200g) для очищення вiд великих частин. Для визначення тфекцшнох активностi культурально1 вiрусовмiсноi' рiдини проводили постановку реакцп гемаглютинацii' з суспензiею еритроци-тiв коня. Реакцiю ставили по загальноприйнятш мето-дицi в 96-лункових мiкропланшетах, розтитровуючи дослiджуваний матерiал до 1:128 в двох повторюва-ностях. Облш реакцii' проводили через 2, 4, 6, та 8 годин. Результати реакцп представлеш на рисунку 1.
Рис. 1. Аглютинащя еритроциив коня repnecBipycoM коней.
Примгтки: «К-1» - контроль ^зюлопчний розчин + в1русна р1дина + суспенз1я еритроцш1в).
«К-2» - контроль ^зюлопчний розчин + суспензш еритроцит1в), на спонтанну аглютинацта еритроцит1в.
З рисунка 1 видно, як в лунц 2, що вщповвдае роз-веденню 1:4, в1дм1чаегься аглютинатя еритроципв, яш оадають у вигляд1 р1вном1рно! пл1вочки утворю-ючи так звану «парасольку». Починаючи з лунки три що ввдповвдае розведенню 1:8 в1дм1чаеться освдання еритроципв у вигляд1 «гудзика», що вказуе на вщсут-шсть аглютинацп.
Отже, шфекцшна актившсть титрованого матер1а-лу становить 1:4.
Наступним етапом отримання антигешв було про-ведення концентрування в1русовм1сно! культурально! рщини методом зворотного д1ал1зу рисунок 2.
Дал1 проводили дослвдження з виявлення оптимально! концентрацп антигену, придатного для постановки реакцп дифузшно! прециттаци таблиця 2. З да-них таблиц! видно, що при концентраци антигешв 1:10 результат реакци р!зний в залежносп в!д проведения обл!ку реакц!! дифуз!йно! прециштацй.
Рис. 2. Концентрування культуральноУ Bipyco-BMicHOi рвдини
При концентруваинi антигену ГВК-1 було встановлено, що оптимальне його розведення для проведен-ня РДП становить 1:20. При оцiнцi антигена ГВК-2, було встановлено, що придатним для постановки реакцп дифузшно! прециштацй РДП е антиген, кон-центрований ввд 1:60 до 1:20. З практично! точки зору
найрацюнальшше використовувати антиген, концент-рований у 20 разiв.
Результата щодо визначення робочо!' концентрацп культуральних антигенi ГВК 1та ГВК 2 для постановки РДП представлен в таблиц 1.
Таблиця 1
Результати визначення робочоТ дози (концентрацп)
ючи антиген та сироватки до розведення 1:32 (рисунок 4).
Концентру-вання вiрусов- Результат через год.
мюно! рщини 24 48 72 96
1:100 ±±*/±** ±/± ±/± -/-
1:80 ±/± ±/± ±/± -/-
1:60 ±/+ ±/+ +/+ ±/±
1:30 ±/+ +/+ +/+ ±/+
1:20 +/± +/+ +/+ +/±
1:10 +/- -/- ±/± -/-
Примггка: * - ГВК 1; ** - ГВК 2.
Збер^ання культуральних антигенiв ми проводили в замороженому станi при температурi м^с 18 °С, попередньо проводили консервування антигену, за допомогою 0,01% розчину мертiоляту з розрахунку 0,1 см3/1 см3 культурально! рвдини, для знищення додатково! мiкрофлори. Кiлькiсть консерванту який необхщно додавати визначали поступовим збшьшен-ням дози розчину мертiоляту, контролюючи виаван-ням антигену на поживш середовища.
Отримання антигену передбачае перевiрку на шк-робну стерильнiсть Зразки вiрусних антигенiв з в кшькосп 0,5 см3 висiвали на агаровi живильнi середовища загального призначення (МПА). Використання такого середовища дозволяе виявити в дослщжувано-му матерiалi мiкроорганiзми, що належать до рiзних морфологiчних груп. Дослiдженню на стерильшсть пiддавали вiруснi антигени, щодо герпесвiрусноl ш-фекцп першого типу та герпесвiрусноl шфекцп другого типу (рисунок 3).
З метою визначення термшу зберiгання та придат-ностi антигенiв через кожнi 6 мюящв проводили постановку реакци дифузшно!' прециттаци розтитрову-
Рис. 3. Результат вимву культуральних антигенiв ГВК 1 та ГВК 2 тишв з вмктом 0,01 % розчину мертиоляту
Результати обл^ реакцй' дифузшно!' прециттаци з титрованим антигеном ГВК 1 та гiперiмунними сироватками представленi в таблищ 2.
З даних таблищ 2 видно, що протягом шести мюя-щв зберiгання антигену в замороженому стан шфек-цiйна актившсть його не знизилася. При проведет дослщження через 12 мiсяцiв тнш преципггацп ввд-мiчали в нативних пробах та в розведеш сироватки 1:2.
Отже, збереження культурального консервованого антигену ГВК 1 в замороженому сташ при температу-рi м^с 18 °С можна протягом 12 мюящв.
Результати облiку реакци дифузно1 прециштацп з титрованим антигеном ГВК 2 та гiперiмунними сироватками представлеш в таблищ 3. З яко1 видно, що концентрований антиген ГВК 2 в 30 раз, придатний до використання в розведенш 1:2 для постановки РДП, а при розведеш 1:4 не завжди утворюе специфiчну т-нiю прециштацп тобто вiдмiчаеться не характерний прояв реакцй'.
Рис 4. Схема постановки РДП
де, АГ - антиген нативний, АГ - антиген в розведеш 1:2; СН - сироватка нативна серопозитивна; 1:2-1:32 - розведення
позитивно! сироватки.
Таблиця 2
Стабшьшсть та термш збер^ання культурального _ антигену ГВК 1_
Перюд Розведення Розведення антигену
зберггання сироватки нативний 1:2 1:4 1:8
Перед заморожу-ванням нативна + + + +
1:2 + + + -
1:4 + ± - -
1:8 ± - - -
нативна + + + +
6 мюящв 1:2 + ± ± -
1:4 ± - - -
1:8 ± - - -
нативна + - - -
12 мюящв 1:2 + - - -
1:4 - - - -
1:8 - - - -
Приметка: «+» - позитивно; «-» - негативно; «±» - сумтвно
Нами було проведено анал1з щодо збереження ак-тивносп даного концентрованого антигену шсля за-морожування i повторного його використання. При проведет реакцп через 6 мюящв нами було встанов-лено, що придатнiсть антигену лишаеться без змiн порiвнюючи з вихвдним матерiалом, а можливiсть використання антигену шсля 12 мiсячного термiну збертання в замороженому станi змiнюеться не знач-но i дозволяе його використання у нативному виглядi. Антиген щодо дiагностики герпесвiрусноl шфекцп другого типу збертае свою придатнiсть для постановки реакцп дифузшно! прециттаци протягом 6 мюящв без змш порiвнюючи з аналоговим антигеном який отримували безпосередньо перед необхiднiстю серо-лопчно1 дiагностики.
Таблиця 3
Стабшьшсть та термш збер^ання культурального _антигену ГВК 2_
Перюд зберггання Розведення сироватки Розведення антигену
нативний 1:2 1:4
Перед заморожу-ванням Нативна + + ±
1:2 + - -
1:4 ± - -
1:8 - - -
6 мюящв Нативна + + -
1:2 + - -
1:4 - - -
1:8 - - -
12 мюяцв Нативна + - -
1:2 - - -
1:4 - - -
1:8 - - -
Примгтка: «+» - позитивно; «-» - негативно; «±» - сумшв-но.
Даний експеримент визначив i дозволив ефективно використовувати антигени ГВК-1 та ГВК-2, при не-обхiдностi, без додаткових тдготовчих манiпуляцiй в умовах дослвдно! лабораторп на перiод серолопчних монiторингових дослвджень.
Висновки
Таким чином, на основi лiтературних даних та проведених експериментальних дослiджень щодо визначення терм^ зберiгання та стабiльностi шфек-цшно1 активностi культуральних антигенiв штаму ГВК 1 Ж та клону ГВК 2 ТТ для постановки РДП можна констатувати, що при концентрацп антигену ГВК 1 оптимальне його розведення становить 1:20. При оцшш антигена ГВК 2 придатним для постановки реакцй' дифузшно1 прециттаци (РДП) е його концен-тращя ввд 1:60 до 1:20. З практично1 точки зору най-рацюнальшше використовувати антиген, концентро-ваний у 20 разiв.
Збереження культурального консервованого антигену ГВК 1 в замороженому сташ при температур м^с 18°С можна протягом 12 мюящв.
Встановлено, що концентрований антиген ГВК 2 в 30 раз, придатний до використання в розведенш 1:2 в РДП, а при розведеш 1:4 не завжди утворюе специфь чну лiнiю прециттаци тобто вiдмiчаеться не характе-рний прояв реакцй.
Антиген щодо дiагностики герпесвiрусноl шфекцп другого типу збериае свою придатнiсть для постановки реакцй дифузшно1 прециштацп протягом 6 мюящв без змiн порiвнюючи з аналоговим антигеном який отримували безпосередньо перед необхвднютю серо-лопчно1 дiагностики.
Перспективи подальших дослгджень. У подальшш роботi вважаемо за необхвдним провести аналiз при-датностi культурального антигену в шших серолопч-них реакщях.
Бiблiографiчнi посилання
Apatenko, V.M. (2003). Virusnye infekcii sel'skohozjajstvennyh zhivotnyh. Har'kov: RVV HGZVA. 122-125 (in Ukrainian). Galatjuk, O.Je. (2003). Zarazni hvorobi konej. Zhitomir:
Volin' (in Ukrainian). Galatjuk, O.Je., Kan'ovs'kij, A.I. (2003). Osnovi profilaktiki hvorob konej. Vet. Medicina. 4, 12-13 (in Ukrainian).
Robinson, Je. (2007). Gerpesvirusnye infekcii. Bolezni loshadej, sovremennye metody lechenija. M. 66-70 (in Russian).
Busol, V.O., Mandygra, M.S.,. Galatjuk, O.Je [ta in.]. (1996). Ocinka imunnogo statusu konej v normi i za pryhovanogo perebigu infekcijnoi' anemii': metod. rek. Rivne: In-t epizootologii' (in Ukrainian). Radzyhovs'kyj, M.L. (2006). Vykorystannja RDP dlja diagnostyky u konej gerpesvirusnoi' infekcii' II typu. Naukovi ta praktychni aspekty veterynarnoi' medycyny v Ukrai'ni: Visnyk Bilocerkivs'kogo derzhavnogo agrarnogo universytetu. Bila-Cerkva. 106-109 (in Ukrainian).
Стаття над1йшла до редакцп 30.09.2016
