CC BY
77
© Н. М. MaTBieHKO
удк 578: 597. 2/. 5 Н. М. MaTBieHKO
ДОСЛЩЖЕННЯ AH^BiPyCHO'l" AKTИBHОCTi nPEnAPATiB у BiДHОШEHHi
ДО РНК вмюних BiPyCiB РИБ
1нститут рибного господарства НААН (м. Кшв)
Дана робота виконувалась вщповщно до НТП НААН на 2011-2013 «Удосконалити систему лку-вально-профiлактичних заходiв у рибництв^ спря-мовану на пiдвищення резистентност об'eктiв культивування та зниження стресово! дИ на них еко-лопчних i технологiчних чинникiв», шифр 28. 00. 03. 04П, № держ. реестрацп 0111и006974.
Вступ. Пошук та розробка способiв застосуван-ня нових безпечних та ефективних препаратiв, що мають iмуномодулюючий вплив на оргаызм риби та виражену антивiрусну дю у вiдношеннi до РНК-вмюних вiрусiв е одним iз сучасних напрямюв ри-богосподарсько! науки. Розвиток цього напрямку нерозривно пов'язаний з ршенням багатьох питань. До них належать критерп вщбору препаратiв, ви-вчення !х впливу на оргаызм риб в цiлому та зокрема на фактори вроджено! резистентностi, складання та обфунтування схем практичного застосування цих препара^в.
Синтезуеться велике рiзноманiття речовин, що можуть бути використан у гуманнiй та ветеринарнiй медицин з метою лiкування та профгпактики рiзних патологiй, у тому чиогм вiрусно! етюлогп [3,10]
Препарати антивiрусно! дм широко застосовують у гуманнм медицинi для лiкування рiзноманiтних вг русних iнфекцiй [8]. Викликае Ытерес дослiдникiв можливiсть застосування цих препара^в у рибни-цтвi, що може виявитись ефективним методом бо-ротьби з вiрусними iнфекцiями, якi е причиною зна-чно! загибелi риби [2].
Це i обумовило мету наших дослiджень - ви-вчити цитотоксичнють та антивiрусну дiю препара^в антивiрусно! дм щодо РНК-вмiсних вiрусiв риб. Така iнформацiя актуальна i необхiдна для оцiнки стану здоров'я риб
Об'ект i методи дослщжень. Вiруси: укра!нський iзолят VF-08 (7,2 1д ТЦД50т|-1) вiрусу iнфекцiйного панкреатичного некрозу форелi (IPNV) та iзолят VCH-1(6,8 1д ТЦД50 т|1) вiрусу вес-няно! вiремi! коропа (SVCV). Вiруси пiдтримували в лабораторнiй колекци 1РГ НААН
Вiрусолопчнi методи. Накопичення вiрусу в культурах клггин, титрування вiрусу в культурах клмтин проводили згiдно мiжнародних нормативних документ [6,11] Титр вiрусiв визначали методом ста-тистичного облiку i виражали в тканинних цитопато-генного дозах в 1 мл (ТЦД 50 т|-1) [6].
Препарати: Протефлазид - препарат розро-блено НПК «Екофарм», Укра!на, м. Ки1в. Препарат мютить: суми карбонових кислот в перерахунку на яблучну кислоту - 6. 3 г, флавоно1д1в в перерахунку на рутин - 0. 32 г (флавонощн глкозиди, ви-дтен з диких злаюв Deschampsia caespitosa L. та calamagrostis epigeios L.)[1]. Для досл1дження був використаний концентрат препарату 20 мл якого розчиняли у 4 мл поживного середовища ДМЕМ [8].
«1зат1зон» - комплексний препарат, до складу якого входять речовини, що застосовуються як са-мост1йн1 засоби у медичнм практик, а саме мети-сазон (марборан), диметилсульфоксид (димексид) i пол1етиленгл1коль з молекулярною масою 400. Пщ час роботи використовували препарат «1затоон», виготовлений в умовах лаборатори МСБАР IMБiГ НАН Укра1ни, чистота продукту доведена методами хiмiчного аналiзу [3].
Препарат «Гропринозин» (Inosine pranobex). Активною речовиною Гропринозину е Ыозин пра-нобекс - молекулярний комплекс Ыозину та 1-(ди-метил амшо)-2- пропанол- 4- ацетамiнобензоату у стввщношены 1:3. Препарат мае противiрусну та iмуностимулюючу активнiсть [4,12].
Визначення цитотоксичного впливу проводили у системi in vitro: у перещеплюваних лiнiях клггин EPC (epidermal neoplasm of carp) та RTG-2 (rainbow trout gonads) Для культивування клмтин використовували середовища 1гла MEM, RPMI-16 з подвмний набiр амiнокислот i вiтамiнiв i DMEM/F12 (Sigma), з дода-ванням ембрюнально! бичачо! сироватки (FBS) та антибютики (гентамiцин, канамiцин, пенiцилiн, ампг цилiн). Для отримання суспензiI клгтин для подаль-шого пересiву використовували сумш, трипсин / ЕДТА (0,25 / 0,02 %), 1М Hepes-буфера (рН 7,0) Всi культури ктмтин були тестованi на вiдсутнiсть конта-мiнацií мiкроорганiзмами [7,9]
Для визначення максимально допустимо! кон-центрацií (МДК) препара^в використовували вказа-нi вище кJliтини. В дослiдах застосовували не менш, нiж десять лунок в плашках з культурою клгтин для кожного розведення препарату в поживному се-редовищг Плашки з культурою ^тин iнкубували при 15-21 о С протягом 96 годин. Щодня проводили дослiдження дослiдних та контрольних культур з метою встановлення наявност або вщсутност цито-токсично! дií.
Таблиця 1
Визначення максимально допустимо'!' концентрацм' гропринозину в культурах кл1тин ЕРС та RTG-2
КК n Тестоваш концентрацй, мкг/мл МДК, мкг/мл
2250 1125 562 281 140 70 35 17 8 4
ЕРС 10 ± ± 562
RTG-2 10 ± ± 562
Примпжа: Р 2264 > 0,01.
Таблиця 2
Визначення максимально допустимо! концентрацм' 1зат1зону в культурах кл1тин ЕРС та RTG-2
КК n Тестоваш концентрацй', мкг/мл МДК, мкг/мл
800 400 200 100 50 25 12,5 6,3 3,2 1,5
ЕРС 10 ± ± ± ± ± ± 12,5
RTG-2 10 ± ± ± ± ± ± 12,5
Примпжа: Р 2264 > 0,05.
Таблиця 3
Визначення максимально допустимо! концентрацм' протефлазиду в культурах кл1тин ЕРС та RTG-2
КК n Тестоваш концентрацй', мкг/мл МДК, мкг/мл
312,4 156,2 78,1 39,1 19,1 9,8 4,9 2,4 1,2 0,6
ЕРС 10 ± ± ± ± 19,1
RTG-2 10 ± ± ± ± 19,1
Примпжа: КК - культура клггин; МДК - максимально допустима концентращя; п -повторнють; «-»- дегенерацiя моношару клiтин; « ± »- моношар клiтин без ознак дегенерацп (через 96 год.); Р 2264 > 0,05.
Таблиця 4
Вплив дослщжуваних препарат1в на РНК вмюш в1руси риб
препарат Вiрус IPN Вiрус SVC
lнфекцiйний титр вiрусу lg ID5„ Показник шпбування |g ID50 1нфекцмний титр вiрусу |g ID50 Показник iнгiбування |g ID50
Протефлазид 1 ± 0,02 6,0 ± 0,02 1 ± 0,01 5,0 ± 0,02
1затаон 5,0 ± 0,03 2,0 ± 0,02 3,0±0,03 3,0 ± 0,02
Гропринозин 1 ± 0,05 6,0±0,03 1 ± 0,05 5,0 ± 0,03
Контроль 7,0 ± 0,04 6,0 ± 0,02
Примпжа: * - Р 2264 > 0,05.
СтупЫы цитотоксичностi визначали за змЫою морфологiI клiтин (округлення, зморщування клiтин, вiдторгнення вiд noBepxHi лунок клггин, що зазнали дегенеративних змЫ). За максимально допустиму концентрацiю (МДК) препарату приймали його най-бтышу кiлькiсть, яка не викликала дегенерацю клг тин [7,9].
Для визначення антивiрусноI дм препаратiв Bi-русну суспензю змiшували з кожним препаратом (1:1), в контроль вiрусу вносили вщповщну кiлыкiсты середовища. Через 1 годину контролыний вiрус та
Bipyc, оброблений препаратами розтитровували мiкрометодом у 96-лункових планшетах з моношаром культур кгмтин за загально-прийнятою методикою для визначення титру шфекцмно! активностi вiрусу. [7]
Результати дослщжень та 'Гх обговорення. Нами визначено максимально допустимi концентрацй (МДК) дослiджуваних пре-паратiв для роботи в культурах кгмтин, що було важливо для оцш-ки можливост 1х подальшого ви-користання в якост антивiрусних речовин. Результати дослщжень вказанi у табл. 1-3.
Визначено, що при концен-тращях протефлазиду - 19,1 мкг/ мл, iзатизону - 12,5 мкг/мл, гропринозину - 16 мкг/мл та нижчих концентра^ях в культурах кгмтин через 96 годин не спостер^али де-генеративнi змiни моношару та ус лiнil клiтин зберiгали здатнють до подальшого культивування. При застосуванн у культурах клiтин ЕРС, RTG-2 вказан концентрацiI i становили МДК. При тестуванн вищих концентрацiй у обох л^ях клiтин вже через 24-28 годин спо-стерiгали дегенерацю клггинного моношару: клiтини округлюва-лись, вщокремлювались вiд по-верхнi лунок, змшювалось рН середовища в кислу сторону. Таким чином вищi дози доотджуваних препаратiв володiли цитотоксич-ною дieю.
Для визначення антивiрусноI дiI у якостi тест-об'екта було об-рано РНК-вмiснi украIнськi iзоляти вiрусу iнфекцiйного панкреатично-го некрозу (IPNV) VF-08 та вiрусу весняно! вiремií коропа VCH-1. За результатами наших попередых дослiджень саме вiруси цих сис-тематичних груп, являють собою найбтьшу загрозу для прюноводно! аквакультури Укра!ни [5].
Для тестування препаратiв в умовах in vitro ви-користовуючи перещеплювальнi культуру ЕРС, що е оптимальною для репродукцп вiрусу SVC та культуру RTG-2, яка е оптимальною для репродукцп та нако-пичення вiрусу IPN Результати доотджень наведенi у табл. 4.
Аналiзуючи отриманi результати можна конста-тувати, що дослiджуванi препарати мали противг русну активнiсть вщ 1 до 6. Речовини, як знижують
титр шфекцмного вiрусу за умов одно циклового до- Висновки.
слщу на 1,25-2 lg ID50 вважаються активними та пер- 1. Встановлен MДK дослiджуваних препаратiв в
спективними для подальших дослiджень [9,7]. Таким культурах кл™н риб ЕРС та RTG-2, як становлять:
чином в результат проведених дослiджень показана для препарату протефлазид - 19,1 мкг/мл, iзатiзон
висока антивiрусна активнiсть по вщношенню до - 12,5 мкг/мл, гропринозину - 1б мкг/мл. сиро-
PNV препара^в групи флавоноiдiв (протефлазид) ватки кровi райдужно'1 форелi експериментально
та препарату гропринозин. Препарат iзатiзон також шфковано'|
мае вираженi антивiруснi властивостг 2. За результатами експериментальних до-
Показана висока антивiрусна активнiсть по вщ- слiджень, встановлено, що запропонован препа-
ношенню до SVC препара^в групи флавоноiдiв рати володiють вираженою антивiрусною дieю у
(протефлазид), препарату гропринозин та iзатiзон, вiдношеннi до вiрусу весняно'1 вiремiÏ коропа та
вони знижували вiрусну репродукцiю на 3-5 lg. Ви- шфекцмного панкреатичного некрозу форелi та
ходячи iз економiчних мiркувань для профiлактики знижують титр шфекцмного вiрусiв вiд 2 до б lg ID50 у
та л^вання рабдовiрусноÏ Ыфекци коропа доцть- культуральних системах.
но застосовувати препарат iзатiзон, а для плщни- Перспективи подальших дослiджeнь поля-
юв можливе використання препарату гропринозин. гають у подальшому дослiдженнi запропонованих
Застосування цих препара^в необхiдно проводити препара^в та Ïx впливу на оргаызм та iмунну систе-
у контекст розроблених комплексних заходiв та му риб, що дозволить проводити профтактику i лг
методiв профiлактики та л^вання вiрусних хвороб кування вiрусних iнфекцiй риб та розробити схему Ïx
риб. застосуванняурибництвк
Лiтeрaтyрa
1. Богоявленский А. П. Противовирусные препараты растительного происхождения. Институт микробиологии и вирусологии, Алматы / А. П. Богоявленский, А. С. Турмагамбетова, В. Э. Березин // Биологические науки. Фундаментальные исследования. - 2013. - № б. - C. 1141-1145.
2. Головина H. А. Ихтиопатология / H. А. Головина, О. H. Бауэр. - M.: Mир, 2007. - 448 с.
3. Заика Л. А. Противовирусные, противоопухолевые и иммуномодулирующие свойства лечебного препарата изатизон : Mонография / Л. А. Заика, О. И. Болсунова, А. И. Потопальский. - K.: ^лообиг, 2010. - 212 с.
4. Земсков В. M. Иммуномодулирующие свойства препаратов инозина и их аналогов / В. M. Земсков // Успехи современной биологии. - 1989. - № 107 (1). - C. б9-78.
5. Mатвieнко H. M. Mонiторинг вiрусниx захворювань риб у рибогосподарських водоймах Укра'ши / H. M. Mатвieнко // Hауковi записки Терноптьського нацюнального педагопчного ушверситету iменi Володимира Гнатюка. Cерiя: Бюлопя. - 2013. - № 3 (5б). - С. б7-73.
6. Mейxи Б. Вирусология. Mетоды / Б. Mейxи [пер. с англ.]. - M.: Mир,1988. - 344 с.
7. Mетодичнi рекомендацп з визначення та контролю антивiрусниx властивостей в системi in vitro / З. С. 1<лестова, О. С. Зоз. - Ю/лв, 2009. - 33 с.
8. Порва Ю. И. Mоделирование инфекции вирусного гепатита С in vivo и изучение антивирусного действия препаратов группы флавоноидов и эллаготанинов : автореф. дис. на здобуття наук. ступеня канд. биол. наук : спец. 03.00.0б / Порва Юлия Ивановна; Невский ^циональный университет им. Тараса Шевченко, 2010. - 19 с.
9. Щербинская А. M. Изучение антивирусного действия потенциальных лекарственных средств: Доклинические исследования лекарственных средств: методические рекомендации / А. M. Щербинская, H. С. Дяченко, С. Л. Рыбалко; под ред. А. В. Стефанова. - ^ев, 2002. - С. 394-420.
10. Golebiowska-Wawrzyniak M. Immunological and clinical study on therapeutic efficiacy of inosine pranobex / M. Golebiowska-Wawrzyniak, K. Markiewicz, A. Kozar [et al.] // Pol. Merkuriusc. Lek. - 2005. -Vol. 19. - P. 379-382.
11. OIE. Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases. Fourth Edition,- Paris:Word Organization for Animal Heatch, 2003. -(Chapter 2. 1. 8.)- Р. 142-152 http://www. oie. int/doc/ged/D6505. PDF.
12. Siwicki A. K. Anti-Birnavirus Activity of Methisoprinol - in vitro Study with Infectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV) / A. K. Siwicki, M. Morand, F. Pozet [et al.] // Acta Vet. Brno. - 2002. - Vol. 71. - P. 543-547.
УДК 578: 597. 2/. 5
ДОСЛЩЖЕННЯ AHTИBiPУCHОTАКТИВНОСТ ПРЕПАРАПВ У ВЩНОШЕНШ ДО РНК ВМЮНИХ BiPУ-
ав риб
Maтвieнко Н. М.
Резюме. У статт представлен результати вивчення цитотоксичност та ант^русно! дм доотджуваних препаратв по вщношенню до РНК-вмюних вiрусiв риб.
У робот були використан антивiруснi препарати вггчизняного виробництва: «Протефлазид», «1затоон» та препарат «Гропринозин». Викликае штерес дослщниюв щодо можливос^ застосування цих препаратiв у рибницга, що може виявитись ефективним методом боротьби з вiрусними iнфекцiями, яю е причиною зна-чно! загибелi риби.
Для визначення антивiрусноI дм у якостi тест-об'екта було обрано украIнськi iзоляти вiрусу iнфекцiйного панкреатичного некрозу (1РКМ) VF-08 та вiрусу весняно! вiремií коропа VСН-1. За результатами наших попе-реднiх доотджень саме вiруси цих систематичних груп, являють собою найбiльшу загрозу для прюноводно! аквакультури.
Встановлен МДК дослiджуваних препара^в в культурах кгмтин риб ЕРС та RTG-2, як становлять: для препарату протефлазид - 19,1 мкг/мл, iзатiзон - 12,5 мкг/мл, гропринозину - 16 мкг/мл. За результатами екс-периментальних доотджень, встановлено, що запропонован препарати володiють вираженою антивiрус-ною дieю у вiдношеннi до вiрусу весняно! вiремií коропа та шфекцмного панкреатичного некрозу форелi та знижують титр iнфекцiйного вiрусiв вщ 2 до 6 lg ID50 у культуральних системах.
Kлючовi слова: антивiруснi препарати, культури клiтин риб, вiрус весняно! вiремií коропа, вiрус Ыфек-цiйного панкреатичного некрозу.
УДК 578: 597. 2/. 5
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ В ОТНОШЕНИИ РНК СОДЕРЖАЩИХ ВИРУСОВ РЫБ
Матвиенко Н. Н.
Резюме. В статье представлены результаты изучения цитотоксичности и антивирусной действия исследуемых препаратов по отношению к РНК- содержащим вирусов рыб.
В работе были использованы антивирусные препараты отечественного производства: «Протефлазид», «Изатизон» и препарат «Гропринозин». Вызывает интерес исследователей о возможности применения этих препаратов в рыбоводстве, что может оказаться эффективным методом борьбы с вирусными инфекциями, которые являются причиной значительной гибели рыбы.
Для определения антивирусного действия в качестве тест- объекта был избран украинский изолят вируса инфекционного панкреатического некроза (IPNV) VF - 08 и вируса весенней виремии карпа VCH -1. По результатам наших предыдущих исследований именно вирусы этих систематических групп представляют собой наибольшую угрозу для пресноводной аквакультуры.
Установленные МДК исследуемых препаратов в культурах клеток рыб ЕРС и RTG -2, которые составляют: для препарата протефлазид - 19,1 мкг / мл, изатизон - 12,5 мкг / мл, гропринозин - 16 мкг / мл. По результатам экспериментальных исследований установлено, что предложенные препараты обладают выраженным антивирусным действием в отношении вируса весенней виремии карпа и вируса инфекционного панкреатического некроза форели, снижая при этом инфекционный титр вирусов от 2 до 6 lg ID50 в культуральных системах.
Ключевые слова: антивирусные препараты, культуры клеток рыб, вирус весенней виремии карпа, вирус инфекционного панкреатического некроза.
UDC 578: 597. 2/. 5
Study of Antiviral Activity of Drugs Against RNA-Containing Viruses of Fish
Matvienko N.
Abstract. The article contains results of a study of cytotoxicity and antiviral effect of investigated drugs against RNA-containing viruses of fish.
Search for and development of means of application of new safe and effective drugs, which have an immunomodulating effect on fish, is one current trends of fisheries science.
Following drugs have been used in this work:
Proteflazid - a drug developed by the SPC "Ecofarm" Ukraine, Kyiv. The drug contains: sums of carboxylic acids as equivalent to apple acid - 6. 3 g, flavonoids as equivalent to rutin - 0. 32 g (flavonoid glycosides extracted from wild cereals Deschampsia caespitosa L. and Calamagrostis epigeios L.). Flavonoid glycosides contained in wild cereals Deschampsiacaespitosa L. та Calamagrostis epigeios L. are able to inhibit virus-specific enzymes DNA-polymerase and thymidine kinase in virus-infected cells. We used a drug concentrate, 20 ml of which were dissolved in 4 ml of Eagle's medium DMEM.
Groprynozyn (Inosine pranobex). Active drug substance is inosine pranobeks - molecular complex of inosine and 1 - (dimethyl amino) -2 - propanol-4 - atsetaminobenzoatu at a ratio of 1:3. The drug has antiviral and immunostimulatory activity
Izatizon is a complex drug, which contains substances used as independent medicinal products in medical practice, namely Metisazon (Marboran), Dimethylsulfoxide (Dimexid), and Polyethylene glycol with a molecular weight of 400. During the work we used the drug Izatizon manufactured in conditions of the laboratory of the Institute of Molecular Biology and Genetics of the NAS of Ukraine.
All above-mentioned drugs are widely used in human medicine for treatment of various viral infections. A possibility of their use in aquaculture attracts interest in scientists that can be an effective method for controlling viral infections, which are a cause of high death rate of fish.
For determining antiviral effect, as a test object we selected Ukrainian isolates of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) VF-08 and isolate VCH-1 of spring viraemia of carp virus (SVC). Based on results of our previous studies, viruses of these systematic groups are the highest threat for freshwater aquaculture.
For testing the drugs in conditions in vitro, we used a passaged EPC culture, which is optimal for SVC virus reproduction, and RTG-2 culture, which is optimal for IPN virus reproduction and accumulation.
Results of determination of maximum acceptable concentrations (MAC) of the studied drugs in fish cell cultures are presented. It was found that at concentrations of Proteflazid - 19. 1 mcg/ml, Izatizon - 12. 5 mcg/ml, Groprinozid - 16 mcg/ml and lower concentrations, no degenerative changes of monolayer were observed in cell cultures in 96 hours and all cell lines preserved their ability for further cultivation.
According to results of experimental studies, it was found that the proposed drugs have pronounced antiviral effects against spring viraemia of carp virus and infectious pancreatic necrosis virus and reduce the titer of infection viruses from 2 to lg ID50 in cultural systems.
Based on economic considerations, for prevention and treatment of rhabdovirus infection of carp, it is advisable to use the drug Izatizon, while the drug Groprinozin can be used for brood fish. Application of these drugs should be performed in the context of developed complex measures and methods.
Key words: antiviral drugs, fish cell cultures, spring viraemia of carp virus, infectious pancreatic necrosis virus.
Рецензент - проф. ДубШШ С. I.
Стаття надшшла 14. 02. 2014 р.
