CC BY
92
особенности функциональном активности эффекторов врожденного иммунитета онкологических больных на фоне сепсиса
Н.Ю. Анисимова, Е.Г. Громова, Л. С. Кузнецова, Н. А. Плужникова,
М.В. Киселевский
РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, e-mail: n.u.anisimova@gmail.com
Проведена сравнительная оценка цитотоксической и фагоцитарной активности лейкоцитов крови онкологических больных с сепсисом, без признаков системного гнойно-воспалительного процесса и здоровых доноров. Функциональная реактивность эффекторов врожденного иммунитета оценивалась по уровню активности натуральных киллеров крови, поглотительной активности (стимуляция гранулами латекса), спонтанного и стимулированного НСТ-теста. Не выявлено достоверных отличий между уровнем функциональной активности лейкоцитов здоровых доноров и больных со злокачественными новообразованиями без признаков гнойно-септических осложнений. Однако при сепсисе у онкологических больных наблюдается гиперактивация клеток-эффекторов врожденного иммунитета, что можно рассматривать как важное звено в патогенезе органной и полиорганной недостаточности.
Ключевые слова: сепсис, цитотоксическая активность, фагоцитоз, натуральные киллеры, нейтрофилы.
CHARACTERISTICS OF FUNCTIONAL ACTIVITY OF EFFECTORS OF INHERENT IMMUNITY OF CANCER
PATIENTS WITH SEPSIS N.Yu. Anisimova, E.G. Gromova, L.S. Kuznetsova, N.A. Pluzhnikova, M.V Kiselevsky N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow 24, Kashirskoye Shosse, 115448-Moscow, e-mail: n.u.anisimova@gmail.com
The comparative assessment of cytotoxic and phagocytic activities of blood leukocytes for cancer patients with sepsis but without signs of systemic suppurative inflammation and for healthy donors was carried out. Functional reactivity of effectors of inherent immunity was estimated by the level of natural killer activity, absorbed activity (stimulated with latex particles) and by the spontaneous and stimulated HCT-test. No significant difference in the level of functional activity of leukocytes between healthy donors and cancer patients having no signs of suppurative-septic complications was found. However, cancer patients with sepsis had hyperactivation of effectors-cells of inherent immunity, that it can be considered as an important link in pathogenesis of organ and polyorgan insufficiencies.
Key words: sepsis, cytotoxic activity, phagocytosis, natural killers, neutrophils.
К настоящему времени накоплен обширный материал, характеризующий особенности иммунологического статуса онкологических больных с гнойно-септическими осложнениями [3, 5, 7]. Большинство их выявлено при изучении параметров гуморального иммунитета и, прежде всего, при оценке цитокинового статуса. В последние годы возрос интерес к изучению эффекторов врожденного иммунитета (натуральные киллеры (НК), гранулоциты и моноциты), играющих важнейшую роль в патогенезе сепсиса [12]. В частности, ряд исследователей указывает на нарастающую иммуносупрессию на фоне сепсиса, проявляющуюся снижением функ-
циональной активности иммунокомпетентных клеток вследствие повышения содержания в крови иммуносупрессивных агентов (ИЛ-10), и снижения регуляторных пептидов (ИЛ-12) [3]. С другой стороны, многие исследователи получили данные, свидетельствующие о повышенной продукции у больных с сепсисом провоспалительных цитокинов (^-8, ТОТа, ^-6, ^-ф), в десятки раз превышающих их уровень у здоровых доноров [7, 9]. Логичным следствием этого феномена должно быть повышение функциональной активности, в первую очередь, эффекторов врожденного иммунитета. В условиях бактериемии и бактериальной ток-
семии эти клетки обеспечивают естественную резистентность организма к инфекционным агентам. Однако их чрезмерная активация запускает каскадную гиперпродукцию медиаторов воспаления. Эти полипотентные биологически активные молекулы инициируют и опосредуют развитие системной воспалительной реакции [11].
Учитывая вышеизложенное, целью исследования явилась сравнительная оценка цитотоксической и фагоцитарной активности лейкоцитов крови онкологических больных с сепсисом, пациентов без признаков системного гнойно-воспалительного процесса и здоровых доноров.
Материал и методы
Были исследованы образцы крови 26 онкологических пациентов, из них 20 больных раком желудка и 6 - раком легкого П-Ш стадии, получивших радикальное хирургическое вмешательство в объеме гастрэктомии или пневмо-нэктомии с лимфодиссекцией. У 16 пациентов (8 женщин и 18 мужчин, средний возраст - 49 ± ± 1,3 года) на фоне послеоперационных осложнений был диагностирован сепсис на основании признаков системной воспалительной реакции (повышение температуры, лейкоцитоз и кардиореспираторные расстройства), наличия очага инфекции (поддиафрагмальный абсцесс, перитонит, пневмония) и повышения уровня прокальцитонина. В качестве референтного контроля использовали кровь 15 здоровых доноров (10 женщин и 5 мужчин, средний возраст - 27 ± 11 лет).
Забор крови у пациентов без осложнений (10 человек) проводили на 7-10-е сут после операции, у больных с сепсисом — после постановки соответствующего диагноза. Исследование клеточной активности начинали не позднее 30 мин после забора крови. У всех пациентов и доноров было получено информированное согласие на проведение научных исследований образцов крови.
НК-активность. Из крови на градиенте плотности фиколла - урографина выделяли моно-нуклеарные лейкоциты (МЛ), которые дважды отмывали центрифугированием в среде ЯРМ1-1640 (ПанЭко, РФ). В качестве клеток-мишеней (КМ) использовали клетки эритромиелолейкоза
К-562. Подсчитывали количество живых эф-фекторных и опухолевых клеток в суспензиях с использованием трипанового синего (Sigma, USA). Для коинкубации клеток использовали 96-луночные планшеты (Nung, USA, или Costar, France). Концентрация К-562 в среде составляла 500000 кл/мл. Соотношение К-562 и клеток-эффекторов МЛ (КЭ) в среде соответствовало 1/2; 1/5 и 1/10. После коинкубации в течение 20-24 ч определяли индекс цитотоксической активности (ИЦА) натуральных киллеров с помощью колориметрического МТТ-теста, основанного на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать 3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazyl)-2,5-Diphenyl-2H-Tetrazolium Bromide (MTT) до фиолетовых кристаллов формазана, растворимых в диметилсульфоксиде [4].
Поглотительная активность. В качестве объектов фагоцитоза использовали суспензии гранул латекса (ПанЭко, РФ). Коинкубацию крови, стабилизированной гепарином, и латекса осуществляли в течение 45 мин. Готовили мазок, окрашивали его по Романовскому-Гимзе и проводили микроскопию с иммерсией. В каждом мазке посчитывали не менее 100 нейтрофилов, вычисляя фагоцитарный индекс (ФИ) - процент клеток, содержащих фагоцитированные объекты, а также фагоцитарное число (ФЧ) — количество гранул латекса в одном фагоците.
Метаболическая активность. Для изучения респираторного взрыва нейтрофилов in vitro использовали реакцию восстановления клетками нитросинего тетразолия (НСТ-тест), результат учитывали в условных единицах (у.е.) [1]. В ходе реакции нитросиний тетразолий восстанавливается до нерастворимого диформазана, откладывающегося в клетках в виде темносиних гранул. НСТ-тест проводили как при стимуляции нейтрофилов латексом (индуцированный НСТ-тест), так и без нее (спонтанный НСТ-тест) [2].
Статистический анализ. Описательная статистика групп представлена в формате: значения медианы, 25-го и 75-го квартилей (медиана, 25 % ^ 75 %). Сравнительный статистический анализ значений изучаемых показателей опытной и контрольной групп проведен с использованием U-критерия Манна—Уитни. Различия считались статистически значимыми при
особенности функциональной активности эффекторов врожденного иммунитета ---------------------------------------------------------------------------- 53
70.0
60.0 ¿в 50,0
30,0 А
0,0
■ Здоровыедоноры
** ■ Больные без
осложнений
■ Больные с сепсисом
1/10 1/5 1/2
Соотношение клетки-мишени/ клетки-эффекторы
р<0,05. Расчеты проведены с использованием пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft, USA).
Результаты и обсуждение
Исследование НК-активности МЛ крови. В ходе данного исследования проводилась сравнительная оценка НК-активности МЛ крови здоровых доноров и онкологических больных с сепсисом и без признаков гнойно-септических осложнений. Определение значений индекса цитотоксической активности (ИЦА) осуществляли при различном соотношении КМ/КЭ: 1/10; 1/5; 1/2.
Полученные данные (рис. 1) свидетельствуют о том, что статистически значимых различий значений НК-активности здоровых доноров и пациентов со злокачественными новообразованиями без осложнений не выявлено (р>0,05). Медианные показатели ИЦА МЛ в обеих группах соответствовали 57 % и 58 %, р=0,902 (соотношение КМ/КЭ - 1/10); 36 % и 32 %, р=0,862 (соотношение КМ/КЭ - 1/5); 17% и 20 %, р=0,890 (соотношение КМ/КЭ - 1/2). Однако у больных с сепсисом было отмечено существенное повышение цитотоксической активности МЛ. Значения ИЦА в этой группе соответствовали 67 (48—82) % при соотношении КМ/КЭ 1/10, 53 (33-74) % при соотношении КМ/КЭ 1/5, 44 (23-70) % при соотношении КМ/ КЭ 1/2. Различия с соответствующими показателями здоровых лиц и пациентов без осложнений были статистически значимыми.
Фагоцитарная активность. Показатели поглотительной активности нейтрофилов (ФИ, ФЧ) онкологических больных с сепсисом были значимо выше соответствующих показателей здоровых доноров - р=0,021; р=0,015 соответственно (таблица). Функциональная активность нейтрофилов онкологических больных без
Рис. 1. Параметры НК-активности онкологических больных без признаков гнойно-септических осложнений и на фоне сепсиса в сравнении со здоровыми донорами. Приведены значения индекса цитотоксической активности (ИЦА)
(медиана, 25 %^75 %) при различном соотношении клеток-мишеней и клеток-эффекторов (1/10; 1/5; 1/2). Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой (р<0,05);
** - различия статистически значимы по сравнению с группой пациентов без осложнений (р<0,05)
осложнений по этим показателям не отличались от таковой для доноров.
Аналогичные результаты были получены при проведении НСТ-теста, характеризующего метаболическую активность гранулоцитов. По данному показателю базальная активность нейтрофилов крови больных с сепсисом, исследованная в спонтанном НСТ-тесте, была значительно выше, чем у больных без осложнений (р=0,014) и здоровых доноров (р=0,001). Параметры индуцированного НСТ-теста у больных с осложнениями также повышены, но различия между группами не столь велики (р=0,0401 в сравнении с показателями больных без осложнений, р=0,034 в сравнении с контролем). В то же время способность клеток к активации у больных с сепсисом снижена, так как различие значений результатов индуцированного и спонтанного теста в этой группе не достоверно
Таблица
Параметры с эагоцитарной активности в сравниваемых группах
Параметры фагоцитарной активности Здоровые доноры (контроль) Онкологичесі Без осложнений сие больные С сепсисом
ФИ, % 28 (21-33) 30 (20-46) 76* (72-97)
ФЧ, гранулы латекса 6 (3-7) 7 (5-15) 38* (29-52)
НСТ-тест спонтанный, у.е. 0,15 (0,09-0,32) 0,52 (0,28-0,70) 2,35* (1,90-2,50)
НСТ-тест индуцированный, у.е. 1,20** (1,10-1,31) 1,41** (1,28-1,60) 2,50* (2,20-2,81)
Примечание: * - статистически значимые отличия по сравнению с контрольной группой (р<0,05); ** - результаты индуцированного НСТ-теста статистически значимо отличаются от результатов спонтанного НСТ-теста (р<0,05).
(p=0,072), тогда как у здоровых доноров и у больных без осложнений метаболическая активность после стимуляции достоверно возрастает (медиана увеличилась в 7,7 раза (р=0,039) и 2,8 раза (р=0,045) соответственно).
В результате проведенных исследований не было выявлено статистически значимых отличий между уровнем функциональной активности НК и нейтрофилов здоровых доноров и больных со злокачественными новообразованиями без признаков гнойно-септических осложнений. В обеих этих группах отмечалась сходная реактивность нейтрофилов на индукцию фагоцитоза - наблюдалось значительное возрастание метаболической активности гра-нулоцитов, свидетельствующее о готовности клеток к завершенному фагоцитозу. Однако если у здоровых доноров соотношение значений индуцированного НСТ-теста к спонтанному соответствовало 7,7, то у онкологических больных без осложнений этот показатель был ниже и соответствовал 2,2.
Проведенное исследование позволило установить, что активность эффекторов врожденного иммунитета у пациентов с сепсисом значительно отличалась по исследованным параметрам от групп сравнения. В частности, было установлено значительное повышение НК-активности МЛ (до 39 %) по сравнению со здоровыми донорами и больными без осложнений. Эти данные соответствуют результатам других авторов, сообщавших ранее о повышении уровня активности НК у больных с сепсисом [5]. Отмеченное явление связывалось с повышением в крови больных с тяжелым сепсисом и септическим шоком уровня IL-12, усиливающего цитотоксичность НК-клеток и T-киллеров, и индукцию гранзимов А и В - эффекторных молекул, опосредующих цитотоксичность [12].
Показатели поглотительной активности ней-трофилов онкологических больных с сепсисом (ФИ и ФЧ) также были достоверно выше соответствующих показателей здоровых доноров (в 2,6 раза и в 6,3 раза соответственно). Было установлено, что результаты спонтанного НСТ-теста, позволяющего оценить степень активации кислородзависимых механизмов киллинга фагоцитов in vitro, значительно выше, чем у
больных без осложнений и здоровых доноров (в 5-15 раз), и, следовательно, свидетельствуют о высокой степени активации внутриклеточных бактерицидных систем при сепсисе. Это может являться следствием увеличения продукции провоспалительных цитокинов, в особенности ИЛ-8 - ключевого цитокина, участвующего в рекрутировании нейтрофилов к месту воспаления и стимулирующего их активность [6]. Известно, что с помощью НСТ-теста регистрируется интенсивность кислородного (респираторного) взрыва, когда в фагоците инициируется кис-лородзависимый киллинг. Посредством этого механизма активируется НАДФ-Н -оксидаза, которая катализирует восстановление молекулярного кислорода до супероксидного радикала, что приводит к появлению в фагоците активных форм кислорода - чрезвычайно токсичных для клеток веществ (супероксид-анион радикал, перекись водорода, радикал гидроперекиси и др.). Перекись водорода в сочетании с миело-пероксидазой (ферментом первичных гранул нейтрофилов) и ионами галогенов образует мощную бактерицидную систему, убивающую бактерии за счет галогенирования их клеточной стенки [13]. Однако фагоциты секретируют эти эндогенные биологически активные вещества в межклеточную среду, где они оказывают повреждающее действие, в том числе и на собственные ткани, и, таким образом, участвуют в формировании органной (полиорганной) недостаточности [10]. Ряд проведенных ранее исследований позволяет сделать вывод о том, что в основе формирования синдрома полиорганной дисфункции при критических состояниях лежит повреждение эндотелия сосудов, вызванное биологически активными молекулами, высвобождаемыми иммунокомпетентными клетками, стимулированными микробными продуктами. Поэтому выявленную нами гиперактивацию клеток-эффекторов врожденного иммунитета (нейтрофилов, НК) можно рассматривать как важное звено в патогенезе органной и полиор-ганной недостаточности.
Механизм кислородзависимого киллинга более сложный и энергозатратный, чем кисло-роднезависимого [8]. Поэтому неудивительно, что бактерицидный потенциал клетки может быть исчерпан довольно быстро. Это является
ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЭФФЕКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА
-------------------------------------------------------------------------------- 55
одним из возможных объяснений установленного в настоящей работы снижения способности к дополнительной стимуляции in vitro кислород-зависимого фагоцитоза нейтрофилов больных с сепсисом. Очевидно, что в этих условиях на фоне сохранения поглотительной способности будет наблюдаться эффект незавершенного фагоцитоза. Подобная иммунокомпрометирован-ность организма на фоне наличия бактериемии вследствие транслокации микроорганизмов из очага воспаления или желудочно-кишечного тракта создает условия для быстрого развития септицемии и повышает вероятность летального исхода.
Таким образом, представленные материалы дают основания считать, что при развитии сепсиса наблюдается 2 этапа состояния эффекторов врожденного иммунитета: 1) начальный период повышенной активности, направленный на удаление микроорганизмов, при этом чрезмерная активация иммуноцитов может приводить к повреждению клеток самого организма и, следовательно, способствовать развитию органной и полиорганной недостаточности; 2) период истощения активационных механизмов, вероятным итогом которого может явиться иммунопаралич и присоединение вторичной инфекции.
ЛИТЕРАТУРА
1.ВиксманМ.Е., Маянский А.Н. Способ оценки функциональной активности нейтрофилов человека по реакции восстановления нитросинего тетразолия: Методические рекомендации. Казань: Казанский НИИЭМ, 1979. 11 с.
2. Герасимов И.Г., Калуцкая О.А. Кинетика реакции восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами крови человека // Цитология. 2000. Т. 42, № 2. С. 160-165.
3. Тугуз А.Р. Иммунопатогенез ранних послеоперационных осложнений у онкологических больных: Дис. ... д-ра биол. наук. М., 2002. 240 с.
4. Шпакова А.П., Павлова К.С., Булычева Т.И. МТТ-колориметрический метод определения цитотоксической активности естественных киллерных клеток // Клиническая и лабораторная диагностика. 2000. № 2. С. 20-23.
5. Giamarellos-Bourboulis E.J., Tsaganos T., Spyridaki E. et al. Early changes of CD4-positive lymphocytes and NK cells in patients with severe Gram-negative sepsis // Crit. Care. 2006. Vol. 10. R. 166.
6. Henkels KM., Frondorf K., Gonzalez-MejiaM.E. et al. IL-8-induced neutrophil chemotaxis is mediated by Janus kinase 3 (JAK3) // FEBS Letters. 2011. Vol. 585 (1). P. 159-166.
7. Kumar A.T., Sudhir U., Punith K. et al. Cytokine profile in elderly patients with sepsis // Indian J. Crit. Care Med. 2009. Vol. 13. P. 74-78.
8. Murphy R., DeCoursey T.E. Charge compensation during the phagocyte respiratory burst // Bioenergetics. 2006. Vol. 1757 (8). P. 996-1011.
9. Rigato O., Ujvari S, Castelo A. et al. Tumor necrosis factor alpha (TNF-a) and sepsis: Evidence for a role in host defense // Infection. 1996. Vol. 24 (4). P 314-318.
10. Thomas S., Balasubramanian KA. Role of intestine in post-surgical complications: involvement of free radicals // Free Rad. Biol. Med. 2004. Vol. 36 (6). P. 745-756.
11. Wang H., Sui M. The cytokine storm and factors determining the sequence and severity of organ dysfunction in multiple organ dysfunction syndrome // Am. J. Emerg. Med. 2008. Vol. 26 (6). P 711-715.
12. Zeerleder S., Hack C.E., Caliezi C. et al. Activated cytotoxic T cells and NK cells in severe sepsis and septic shock and their role in multiple organ dysfunction // Clin. Immunol. 2005. Vol. 116 (2). P. 158-165.
13. Zychlinsky A., Weinrauch Y., Weiss J. Introduction: Forum in immunology on neutrophils // Microbes and Infection. 2003. Vol. 5 (14). P. 1289-1291.
По ступила 26.01.11
