CC BY
102
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 616.94-02:616-036.11]-092
Белобородова Н.В., Мороз В.В., Бедова А.Ю., Осипов А.А., Саршор Ю.Н., Черневская Е.А.
УЧАСТИЕ АРОМАТИЧЕСКИХ МИКРОБНЫХ МЕТАБОЛИТОВ В РАЗВИТИИ ТЯЖЕЛОЙ
ИНФЕКЦИИ И СЕПСИСА
ФГБНУ НИИ общей реаниматологии им. В.А. Неговского, 107031, Москва
Введение. Актуальность инфекции у больных в критическом состоянии остается высокой. Присоединение локальных инфекционных процессов имеет тенденцию к быстрой генерализации и сепсису. Нарушение функции нейтрофилов - один из ключевых моментов в патогенезе инфекционных осложнений и сепсиса. Гипотеза об участии микробных метаболитов в развитии иммуносупрессии, в частности в угнетении фагоцитарной активности нейтрофилов как первой линии защиты организма от бактерий, приобретает все больше сторонников. Среди микробных метаболитов особый интерес представляют ароматические соединения - фенил-карбоновые кислоты (ФКК), так как их концентрация в крови достигает максимума при генерализованной инфекции, коррелирует с летальностью у больных в критических состояниях, а биологическая активность ФКК подтверждена ранее в ряде инвитровых исследований.
Цель работы - выявить связь ФКК с тяжестью течения бактериальных инфекций и оценить влияние фенил-карбоновых кислот на фагоцитарную активность нейтрофилов.
Материал и методы. На первом этапе оценивали уровни ФКК (метод ГХ-ПИД) в сыворотке крови 57 больных с документированной бактериальной инфекцией разной степени тяжести, подтвержденной шкалами APACHE II и SOFA, сравнивая с показателем у здоровых доноров (n = 72), на втором этапе in vitro оценивали влияние установленных клинически значимых концентраций ФКК на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови.
Результаты. Уровни фенилуксусной (ФУК), фенилмолочной (ФМК), гидроксифенилуксусной (п-ГФУК) и гидрок-сифенилмолочной (п-ГФМК) кислот у больных были достоверно выше, чем у здоровых доноров, достигая наиболее высоких значений при тяжелом течении инфекции. Выявлена высокая прямая корреляция уровней ФКК с показателями шкал APACHE II и SOFA. В эксперименте in vitro выявлено достоверное снижение в среднем на 11% количества фагоцитирующих нейтрофилов под влиянием ФУК, п-ГФУК и ФМК. На интенсивность поглотительной способности нейтрофилов наиболее значимое влияние оказывали п-ГФУК, ФМК и п-ГФМК, снижая этот показатель в среднем на 26%. Также отмечено, что фенилпропионовая кислота (ФПК), характерная для крови здоровых доноров, практически исчезает у больных в критическом состоянии.
Заключение. Уровень ФКК в сыворотке крови отражает тяжесть бактериального воспалительного процесса. В эксперименте in vitro показано, что ФКК в клинически значимых концентрациях способны подавлять фагоцитарную активность нейтрофилов.
Ключевые слова: бактериальная инфекция; фенилкарбоновые кислоты; нейтрофилы; фагоцитоз; фенилуксусная кислота; фенилмолочная кислота; гидроксифенилуксусная кислота; гидроксифенилмолочная кислота; фенилпропионовая кислота.
Для цитирования: Белобородова Н.В., Мороз В.В., Бедова А.Ю., Осипов А.А., Саршор Ю.Н., Черневская Е.А. Участие ароматических микробных метаболитов в развитии тяжелой инфекции и сепсиса. Анестезиология и реаниматология. 2016; 61 (3): 202-208. DOI: 10.18821/0201-7563-2016-3-202-208
Beloborodova N.V., Moroz V.V., Bedova A.Yu., Osipov A.A., Sarshor Yu. N., Chemevskaya E.A. PARTICIPATION OF AROMATIC MICROBIAL METABOLITES IN THE DEVELOPMENT OF SEVERE INFECTION AND SEPSIS
Federal State Budgetary Institution "V.A.Negovsky Scientific Research Institute of General Reanimatology", 107031,
Moscow, Russian Federation
Background. Actuality of the problem of infection in critically ill patients remains high. Addition a local infectious processes have a tendency to rapid generalization and sepsis. Neutrophils function failure plays a key role in the pathogenesis of infectious complications and sepsis. The hypothesis about the role of microbial metabolites in the formation of immunosuppression, in particular in the inhibition of phagocytic activity of neutrophils as the first line of defense against bacteria is acquiring more and more supporters. Among the microbial metabolites aromatic compounds, such as phenylcarbinol acid (PCA) are of particular interest. Their concentration in the blood reaches a maximum in case of generalized infection, and correlates with mortality in patients in critical conditions, and PCA biological activity confirmed by earlier researches in vitro.
The purpose of the study was to reveal the relationship of the PCA with the severity of bacterial infections and to assess the effect of PCA on neutrophils phagocytic activity.
Materials and methods. At the first stage the levels of PCA (GCh-FID method) in the serum ofpatients (n=57) with a documented bacterial infection of varying severity, confirmed APACHE II and SOFA scales were analyzed comparing with healthy donors (n=72). During the second stage the effect of clinically-relevant concentrations of PCA on neutrophils phagocytic activity of peripheral blood was analyzed in vitro.
Results. The levels of phenylacetic (PAA), phenyllactic (PLA), hydroxyphenylacetic (p-HPAA) and hydroxyphenyllactic (p-HPLA) acids in patients were significantly higher than in healthy donors, reaching the highest values in severe infection. High direct correlation of PCA levels with the indicators of scales APACHE II and SOFA was detected. A significant decrease in the number of phagocytic neutrophils under the influence PAA, p-HPAA and PLA was identified in vitro experiment on average 11%. The most significant influence p-HPAA, PLA and p-HPLA have made on the intensity of the neutrophils absorption capacity reducing this parameter by an average of 26%. Also noted that phenylpropionic acid (PPC) which is in blood of healthy donors, disappears in critical ill patients.
202
АНЕСТЕЗИОЛОГИЯ И РЕАНИМАТОЛОГИЯ. 2016; 61(3)
Conclusion. Phenolcarbonic acids level in the blood serum shows the severity of bacterial inflammatory process. Experiment in vitro shows that the PCA in clinically-relevant concentrations is able to suppress the neutrophils phagocytic activity.
Keywords: bacterial infection; phenolcarbonic acids; neutrophils; phagocytosis; phenylacetic acid; phenyllactic acid;
hydroxyphenylaacetic acid; hydroxyphenyllactic acid; phenylpropionic acid. For citation: Beloborodova N.V., Moroz V.V., Bedova A.Yu., Osipov A.A., Sarshor Yu. N., Chernevskaya E.A. Participation of aromatic microbial metabolites in the development of severe infection and sepsis. Anesteziologiya i reanimatologiya (Russian journal ofAnаеsthesiology andReanimatology) 2016; (3): 202-208. (In Russ.). DOI: 10.18821/0201-7563-2016-3-202-208 Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Funding. This research was supported by Russian Science Foundation grant No. 15-15-00110. Received 15.11.2015 Accepted 18.01.2016
Введение. На сегодняшний день актуальность проблемы инфекции у больных в критическом состоянии остается высокой, несмотря на прогресс в медицинской науке. Более чем у 50% больных отделений реанимации регистрируется инфекционный процесс [1], вызванный грамотрицательными и грамположи-тельными бактериями [2], а риск летального исхода увеличивается в несколько раз [3]. Большое количество инвазивных процедур, проведение ИВЛ; применение лекарственных препаратов, обладающих иммуносупрессивным действием, повышает риск инфицирования больных госпитальными штаммами [4]. Снижение иммунореактивности, особенно в условиях нарушения микроциркуляции, способствует транслокации микроорганизмов как госпитальных полирезистентных штаммов, колонизирующих слизистые, так и представителей собственно микробио-ты больных, находящихся в отделениях реанимации и интенсивного лечения (ОРИЛ) [5, 6]. Присоединение локальных инфекционных процессов имеет тенденцию к быстрой генерализации [3, 4, 6].
Нейтрофилы - первая линия защиты организма от бактерий [7-10], оперативно мигрируя к очагу инфекции или воспаления, сдерживают и обезвреживают чужеродные частицы. Полиморфно-ядерные лейкоциты также передают сигналы другим клеткам неспецифической иммунной системы о внешней угрозе вторжения чужеродных агентов. Основная часть нейтрофилов находится в тканях и не более 1% их постоянно циркулирует в крови. Достаточно много данных свидетельствует, что именно нарушение функции нейтрофилов у больных в критическом состоянии приводит к развитию инфекционного процесса и длительному течению инфекции [11-14], что способствует неблагоприятному исходу [15-17].
Неслучайно такие гематологические показатели, как выраженный лейкоцитоз/лейкопения (4 • 109/л < показатель > 12 • 109/л) и/или сдвиг в сторону незрелых форм (> 10%), являются ведущими признаков системной воспалительной реакции [18]. Пока-
Для корреспонденции:
Белобородова Наталья Владимировна, д-р мед. наук, профессор, рук. лаб. метаболизма критических состояний ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей реаниматологии им. В.А. Не-говского», 107031, Москва, E-mail: [email protected] For correspondence:
Nataly V. Beloborodova, professor, MD, PhD, The Head of laboratory of metabolism of critical ill patients, Federal State Budgetary Institution "V.A.Negovsky Scientific Research Institute of General Reanimatology", 107031, Moscow, Russian Federation; E-mail: [email protected]
зано, что фагоцитарная активность незрелых форм нейтрофилов в 2 раза ниже, чем у полноценных полиморфно-ядерных лейкоцитов [16]. Снижение экспрессии рецепторов CD11b (миграция нейтрофилов из кровеносных сосудов в ткани), CD16 (процесс фагоцитоза, опосредованного IgG) [19], рецепторов к комплименту С5а (хемоаттрактант) у больных с сепсисом ассоциировано с неблагоприятным исходом [17, 20]. При этом на ранних стадиях сепсиса наблюдается гиперфункция нейтрофилов с развитием чрезмерной воспалительной реакции, приводящей к повреждению тканей и развитию дисфункции органов, но на более поздних стадиях тяжелого сепсиса происходит обратная реакция, а именно недостаточность миграции нейтрофилов, обусловливающая их неспособность контролировать инфекционный процесс [14, 15].
Активация процесса поглощения происходит при контакте рецепторов нейтрофила с опсонизи-рованной поверхностью бактериальной клетки или собственными молекулами микроорганизма, например ЛПС с Толл-подобными рецепторами [21, 22]. При длительном воздействии ЛПС наблюдается угнетение провоспалительной активности ней-трофилов [23].
Интересно, что характерной особенностью ней-трофилов при сепсисе является значительное повышение продолжительности их жизни. В норме зрелые нейтрофилы циркулируют в крови не более 6-10 ч, а затем мигрируют в ткани, где создают значительный по численности пул. Без активации в ре-тикулоэндотелиальной системе нейтрофилы живут еще сутки, а затем вступают в апоптоз. При септическом процессе синтез водородных радикалов и ци-токинов нейтрофилов снижен, а процессы, приводящие к вступлению в апоптоз, ингибированы [4], что приводит к их длительной циркуляции в кровотоке и проявляется высоким лейкоцитозом. Применение лекарственных препараторов (глюкокортикостерои-ды, цитостатики, антибиотики) также может влиять на изменение количества циркулирующих грануло-цитов и их дисфункцию [24].
Ранее нами было показано снижение фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) при увеличении бактериальной нагрузки у новорожденных, поступавших в реанимационное отделение по поводу врожденных пороков сердца при документированной инфекции, подтвержденной уровнем про-кальцитонина > 2 нг/мл, зафиксировано снижение ФАН в среднем на 35-47% по сравнению с ФАН при нормальном (0-0,5 нг/мл) уровне прокальцитонина.
203
Адекватная антибиотикотерапия приводила к восстановлению фагоцитарной активности, что может указывать на потенциальную роль метаболитов бактерий [13].
Среди метаболитов бактерий, входящих в состав микробиоценоза человека, особый интерес представляет изучение роли фенилкарбоновых кислот (ФКК) [25-29]. Потенциальными участниками в патогенезе бактериальных инфекционных процессов могут являться следующие кислоты: фенилмолоч-ная (ФМК), фенилпропионовая (ФПК), фенилуксус-ная (ФУК), п-гидроксифенилуксусная (п-ГФУК) и п-гидроксифенилмолочная (п-ГФМК) [30-32]. Экспериментальные и клинические исследования подтверждают биологическую активность ФКК, особый интерес вызывает способность ФКК влиять на функции митохондрий (продукцию активных форм кислорода и скорость окисления NAD-зависимых субстратов) [33] и нейтрофилов [34]. Нарушения, вызванные воздействием ФКК, были аналогичны тем, что обнаруживаются у больных с сепсисом, на основании чего одной из причин митохондриальных дисфункций при сепсисе авторы называют повышение уровня этих кислот [33].
Существует предположение, что нарушение естественных и гармоничных взаимоотношений бактерий с организмом человека, опосредованное через низкомолекулярные метаболиты, максимально проявляется при критических состояниях, приводя к полиорганным нарушениям и фатальному исходу [35].
Таким образом, поиск новых механизмов нарушения ФАН с участием низкомолекулярных метаболитов бактерий является актуальной задачей и целью данного исследования.
Материал и методы. Работа проводилась в 2 этапа: на I этапе оценивали уровни ФКК в сыворотке крови больных с документированными очагами инфекции разной локализации и степени тяжести; на II этапе in vitro оценивали влияния установленных клинически значимых концентраций ФКК на поглотительную функцию нейтрофилов периферической крови.
I этап (клинический)
Характеристика больных. Обследовано 57 взрослых больных и 72 здоровых донора (контроль).
1-я группа - больные ОРИЛ. В исследование включены образцы сыворотки крови 42 больных (мужчин было 50%), поступивших в ОРИЛ с документированной тяжелой инфекцией и сепсисом. Возраст больных составил 67 (ИР 57-75) лет. Локализация очагов инфекции: пневмония (у 25), перитонит (у 12), перитонит в сочетании с пневмонией (у 5). Наличие абдоминальных гнойно-воспалительных очагов инфекции подтверждено в протоколе операции, наличие пневмонии -рентгенологическим исследованием. Продолжительность пребывания в ОРИЛ до взятия образца сыворотки крови составила 3 (ИР 2-5) дня. У 2 (60%) из 42 больных бактериальный воспалительный процесс сопровождался двумя и более клиническими признаками системной манифестации инфекции, что по международным критериям [18] дает основание говорить о наличие сепсиса. Больные обследовались и получали лечение в соответствии с протоколами заболевания, проводилась оценка состояния по шкалам APACHE II, SOFA.
2-я группа - 15 амбулаторных пациентов с локальными гнойно-воспалительными заболеваниями кожи и мягких тканей (мужчин было 50%) до хирургической санации гнойно-воспалительного очага. Медиана возраста составила 48 (ИР 31-64) лет. В группу включены больные со следующими 204
нозологическими формами: абсцедирующий фурункул (у 9), абсцесс мягких тканей (у 5), абсцедирующий гидраденит (у 1). Продолжительность заболевания до хирургической санации очага инфекции составила 5 (ИР 4-7) дней.
Критерии исключения: в исследование не включались больные моложе 18 и старше 80 лет, больные с хронической почечной недостаточностью, хронической печеночной недостаточностью, беременные, больные, находящиеся на имму-носупрессивной терапии.
Все образцы сыворотки крови для определения уровня ФКК были получены при заборе крови для клинических и биохимических исследований; для ГХ-ПИД-анализа использовали остаточные сыворотки в объеме 0,5 мл.
3-я группа (контроль) - образцы сывороток крови 72 здоровых доноров с соблюдением регламентирующих документов, санитарных и этических требований, подробно описанных нами ранее [36].
У всех больных определяли уровни ФКК в сыворотке крови методом ГХ-ПИД [37] для выявления клинически значимых концентраций при локальном и генерализованном течении бактериальной инфекции.
II этап (экспериментальный - исследования in vitro)
Для изучения влияния ФКК на поглотительную функцию нейтрофилов периферической крови использовали образцы цельной гепаринизированной крови здоровых добровольцев. В качестве добровольцев в исследовании участвовали научные сотрудники института.
Методы лабораторного исследования. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов проводили с помощью модифицированного метода [13, 38], определяли поглотительную функцию нейтрофилов периферической крови 30 здоровых доноров, оценивали влияние добавок ФКК в разных концентрациях, выбранных с учетом результатов первого этапа исследования, сравнивали с контролем (физиологический раствор) и с эффектом добавки индуктора фагоцитарной активности (ЛПС).
В конической пробирке при 37oC в течение 30 мин инкубировали смесь: 0,1 мл гепаринизированной крови, 0,1 мл суспензии латекса (частицы латекса d = 1,5 мкм); 10 мкл добавки физиологического раствора или раствора индуктора с итоговой концентрацией в образце 0,1 и 0,01 мкг/мл (ли-пополисахарид (ЛПС) Klebsiella pneumoniae Sigma-Aldrich, Швейцария) или раствора ФКК (ФПК, ФУК, п-ГФУК, ФМК, п-ГФМК производства Sigma-Aldrich, Швейцария). Далее готовили мазки инкубационной смеси на стекле, которые после высыхания фиксировали в пламени горелки. Окрашивали 1% раствором метиленового синего, микроскопия под иммерсией при увеличении 100. Просматривали не менее 10 полей зрения, осуществлялся подсчет 100 полиморфно-ядерных лейкоцитов.
Оценивали следующие показатели: ФАН - количество лейкоцитов, поглотивших за время инкубации больше 3 частиц латекса и фагоцитарное число (ФЧ) - количество ней-трофилов, поглотивших за время инкубации больше 10 частиц латекса.
Для оценки результатов исходные ФАН и ФЧ (среднее 5 определений) принимали за 100%, при этом экспериментальные ФАН и ФЧ рассчитывали как процент от исходных показателей.
Определение сывороточной концентрации ФКК выполняли по описанной раннее методике с применением газового хроматографа «Кристалл 5000.2» (Хроматэк, Россия), оснащенного пламенно-ионизационным детектором [37].
Статистическая обработка результатов исследования выполнялась с использованием прикладного программного обеспечения Microsoft Excel и Statistica 10, StatSoft. Inc., использованы функции непараметрической статистики -медиана и интерквартильный размах (ИР 25-75 квартили). Сопоставление результатов выполнялось с использованием критерия Манна-Уитни и критерия Знаков.
АНЕСТЕЗИОЛОГИЯ И РЕАНИМАТОЛОГИЯ. 2016; 61(3)
DOI: 10.18821/0201-7563-2016-61-3-202-208 Оригинальная статья
Результаты исследования и их обсуждение. Этап I (клинический). У всех 57 больных с документированными очагами бактериальной инфекции обнаружены статистически значимые повышения в сыворотке крови уровней четырех ФКК (ФУК, ФМК, п-ГФУК и п-ГФМК) в сравнении со здоровыми людьми (табл. 1). Данные, приведенные в табл. 1, свидетельствуют о наличии лейкоцитоза и повышении температуры тела у больных в сравнении с нормой, однако между собой группы больных по этим показателям не различались. Следует отметить,
что наибольшие различия продемонстрировали ФКК, содержащие гидроксильную группу (п-ГФУК и п-ГФМК - производные тирозина), лучше отражают тяжесть течения бактериального воспалительного процесса.
В табл. 1 не включены данные по ФПК, так как она обнаружена у больных группы ОРИЛ всего в единичных случаях ниже предела обнаружения метода. В группе амбулаторных пациентов c локальными инфекциями ФПК выявлялась значительно чаще, у 12 (80%) из 15, а в крови здоровых доноров ФПК присутствовала практически всегда. Исчезновение ФПК в сыворотке крови больных с тяжелыми инфекционными процессами согласуется с полученными ранее данными [30, 35]. ФПК является конечным продуктом микробного метаболизма фенилалани-на кишечной микробиотой. Этот метаболит, а точнее факт его отсутствия в крови больного является наиболее "чувствительным" признаком нарушения метаболического равновесия в системе макроорга-низм-микробиота и, вероятно, может в перспективе служить ранним индикатором этих нарушений.
С целью объективного анализа тяжести течения бактериально-воспалительного процесса и степени органных дисфункций, реанимационные больные (группа ОРИЛ) были разделены на три 3 подгруппы в соответствии со шкалой SOFA:
1а (у 10) SOFA 0-2 балла - бактериальная инфекция средней степени тяжести: пневмония (у 3), перитонит (у 6), перитонит + пневмония (у 1); 1б (у 14) SOFA 3-7 баллов - бактериальная инфекция тяжелого течения: пневмония (у 8), перитонит (у 4), перитонит + пневмония (у 2). Более чем у половины больных этой подгруппы, а именно у 8 (57%) из 14 случаев регистрировались 2 или более общеклинических признаков системной манифестации ин-
Т а б л и ц а 1
Сопоставление клинико-лабораторных показателей и уровня ФКК между группами, медиана Ме и интерквартильный размах ИР 25%-75%
Ме (ИР 25-75) Р
Показатель 1-я - ОРИЛ тяжелая инфекция (n = 42) 2-я - амбулаторная локальная инфекция (n = 15) 3-я - здоровые доноры (П = 72) [36] 1-2 1-3 2-3
ФУК, мкМ 2,2 (0,8-5,3) 2,5 (1,6-3,1) 1,4 (0,9-2,2) 0,993 0,045 0,017
ФМК, мкМ 2,9 (1,6-9,9) 0,9 (0,7-1,6) 0,6 (0,5-0,8) < 0,001 < 0,001 0,005
п-ГФУК, мкМ 11,0 (3,2-43,0) 2,9 (2,3-3,4) 1,0 (0,7-1,5) 0,002 < 0,001 < 0,001
п-ГФМК, мкМ 7,4 (3,3-23,3) 3,2 (2,3-4,1) 1,5 (1,1-1,8) 0,006 < 0,001 < 0,001
WBC, .109/л 13,7 (9,2-19,3) 11,4 (10,1-12,3) 6,2 (5,3-7,5) 0,117 < 0,001 < 0,001
Температура, oC 37,7 (37,0-39,2) 37,3 (37,2-37,5) 36,6 (36,6-36,6) 0,332 < 0,001 < 0,001
ЧСС в 1 мин 100(84-111) 78 (72-82) н/д < 0,001 - -
Примечание. Н/д - нет данных, 1-я, 2-я, 3-я - группы больных.
фекции и полиорганной дисфункции, что согласно классификации 2012 г. [18] дает основание ставить диагноз сепсиса; 1в (у 18) SOFA > 8 баллов - бактериальная инфекция крайне тяжелого течения: пневмония (у 14), перитонит (у 2), перитонит+пневмония (у 2). Практически у всех больных этой подгруппы (в 90% случаев) регистрировались множественные признаки системной манифестации инфекции, что позволяет назвать эту подгруппу "больные с сепсисом".
Важно отметить, что в выделенных подгруппах (табл. 2) значения шкалы APACHE II, характеризующей тяжесть состояния больных, достоверно различались. При этом возрастных различий в подгруппах не было, что подчеркивает значимость различий, обусловленных не возрастом, а тяжестью инфекционного процесса. Уровни ФКК достоверно различались у больных, увеличиваясь практически в 2 раза в каждой последующей подгруппе по сравнению с предыдущей параллельно с нарастанием тяжести инфекционного процесса Другие клинико-лабора-торные показатели (лейкоцитоз, температура и ЧСС) были достоверно выше только в подгруппе SOFA > 8, т. е. у больных с манифестацией сепсиса.
В группе ОРИЛ (у 42 пациентов) проведена оценка корреляционной взаимосвязи уровней ФКК с ря-
Т а б л и ц а 2
Сопоставление клинико-лабораторных показателей между подгруппами больных ОРИЛ
Показатель Ме (ИР 25-75) Р
1а - SOFA 0-2 1б - SOFA 3-7 1в - SOFA 8-15 1-2 2-3 1-3
Возраст, годы 59(50-76) 69(63-77) 63 (57-74) 0,412 0,296 0,755
APACHE II, баллы 6 (4-9) 14 (9-16) 26 (24-29) 0,006 < 0,001 < 0,001
WBC, • 109/л 11,1 (9,7-14,7) 11,6 (8,5-14,9) 19,5 (12,9-21,7) 0,930 0,012 0,017
Температура, oC 37,2 (36,7-37,7) 37,4 (36,9-38,5) 39,4 (37,3-40,8) 0,279 0,081 0,017
ЧСС в 1 мин 85 (79-92) 95(81-115) 104(99-115) 0,254 0,124 0,002
ФУК, мкМ 0,5 (0,3-0,6) 1,6 (1,1-2,0) 4,8 (2,8-10,7) 0,001 0,001 < 0,001
ФМК, мкМ 1,0 (0,6-1,6) 1,9 (1,6-3,3) 8,7 (5,8-13,3) 0,007 0,001 < 0,001
п-ГФУК, мкМ 2,2 (0,6-4,7) 5,3 (2,6-26) 39,7 (16,6-77,7) 0,043 0,008 < 0,001
п-ГФМК, мкМ 2,3 (1,4-3,3) 5,9 (4,0-7,8) 26,9 (10,4-44,4) 0,002 < 0,001 < 0,001
205
Т а б л и ц а 3
Корреляционная взаимосвязь уровня ФКК в сыворотке крови с клинико-лабораторными показателями и шкалами тяжести состояния 42 больных
Показатель Значение показа- Коэффициент корреляции
геля Ме (25-75%) ФУК ФМК п-ГФУК п-ГФМК
Креатинин, мкМ 118(83-257) 0,689*** 0,643*** 0,674*** 0,754***
Общий билирубин, мМ 14,6 (10,6-25,0) 0,202 0,386* 0,037 0,302
Систолическое артериальное давление, мм рт. ст. 121 (112-130) -0,460** -0,484** -0,228 -0,588***
Диастолическое артериальное давление, мм рт. ст. 68 (60-73) -0,489** -0,338* -0,349* -0,555***
APACHE II, баллы 16 (9-26) 0,758*** 0,740*** 0,733*** 0,872***
SOFA, баллы 7 (3-12) 0,740*** 0,810*** 0,668*** 0,834***
корреляции Спирмена: * - p < 0,05
Примечание. Коэффициент ** -p < 0,01; *** -p < 0,001.
дом клинико-лабораторных показателей и шкалами оценки тяжести состояния больных, результаты отражены в табл. 3.
В соответствии со шкалой Чеддока корреляционная взаимосвязь в диапазоне от 0,7-0,9 считается высокой. Выявлена высокая прямая корреляция ФКК со шкалами APACHE II и SOFA (см. табл. 3), что свидетельствует о перспективности использования ароматических метаболитов (ФУК, ФМК, п-ГФУК, п-ГФМК) в качестве биохимических маркеров, объективно оценивающих тяжесть состояния больных. Высокая прямая корреляция ФУК, п-ГФУК и особенно п-ГФМК с уровнем креатинина указывает на целесообразность дальнейшего изучения роли этих метаболитов при почечной недостаточности и при проведении экстракорпоральной детоксикации, о чем сообщалось ранее [39].
Обращает на себя внимание обратная взаимосвязь уровней ФКК с показателями систолического и диастолического АД. Наиболее заметная обратная корреляция обнаружена для показателей АД с уровнем п-ГФМК (см. табл. 3). Это подтверждает предположение, высказанное в более ранних публикациях [40], о том, что критически низкие показатели АД, наблюдаемые у больных с инфекцией в состоянии септического шока, могут быть связаны с высокими уровнями ФКК, в том числе с п-ГФМК. Это наблюдение очень важно и требует дальнейшего изучения, тем более что в литературе накапливаются данные о связи уровня п-ГФМК в крови с летальностью у реанимационных больных [30, 40, 41].
Этап II (экспериментальный). На этапе II оценивали влияние ФКК на ФАН в эксперименте в соответствии с количеством добавок. Для каждого образца крови здоровых людей выполнялось по 17 исследований. Добавки были подобраны с учетом диапазона концентраций ФКК, определенных у больных на I этапе работы.
Добавки в образцы цельной крови каждого донора: 5 пациентам физиологический раствор -10 мкл; 2 пациентам ЛПС - 0,1 и 0,01 мкг/мл; 2 - ФУК - 0,7 и 7,3 мкМ; 2 больным ГФУК - 0,7 и 6,6 мкМ; 2 - ФМК - 0,6 и 6 мкМ; 2 - ГФМК - 0,5 и 5,5 мкМ; 2 пациентам ФПК - 0,6 и 6,7 мкМ.
Известно, что здоровые люди могут иметь характерный индивидуальный показатель ФАН и ФЧ - как высокий, так и низкий. В данном исследовании в 9 случаях исходная ФАН была низкой (п - количество фагоцитирующих клеток < 30), в 15 случаях - средней (30 > п < 60) и в 6 случаях - высокой (п > 60). Полученные данные согласуются с более ранними, где показано, что у здоровых людей с исходно высокой ФАН отмечается практически 2-кратное повышение уровней ГФУК и ГФМК, а при исходно низкой ФАН - низкие значения концентраций ФМК и ФПК по сравнению с показателями у доноров со средними значениями ФАН [42].
ФЧ >10 варьировало от 4 до 57 клеток и как ожидалось коррелировало с показателями исходной ФАН (гх = 0,905). Так, у добровольцев с исходно низкой ФАН медиана ФЧ составила 6 клеток, со средней ФАН - 10, а с исходно высокой - 35 клеток.
Для оценки поглотительной способности нейтро-филов контролем служило параллельное определение ФАН и ФЧ в пробирках с добавлением индуктора фагоцитарной активности, в обеих концентрациях наблюдали достоверное повышение ФАН (р < 0,0005 - критерий знаков), также отмечена тенденция к увеличению количества клеток, поглотивших более 10 частиц латекса.
Результаты экспериментального исследования эффектов ФКК на ФАН и ФЧ отражены на рисунке.
Обнаружено достоверное снижение в среднем на 11% количества фагоцитирующих нейтрофилов под действием ФУК, п-ГФУК и ФМК, при этом ФПК и п-ГФМК такого влияния не оказывали. Поглотительная способность нейтрофилов (ФЧ) статистически значимо снижалась в среднем на 26% при добавлении п-ГФУК, ФМК и п-ГФМК.
Дозозависимый отрицательный эффект на способность нейтрофилов к поглощению большого количества чужеродных частиц, наиболее ярко показан на примере п-ГФМК (см. рисунок).
Установлено, что более выраженный эффект на показатели ФАН и ФЧ ФКК оказывают у доноров с исходно высокими и средними показателями ФАН.
Обсуждая возможные механизмы воздействия ФКК на ФАН, можно предположить связь с химическими свойствами изучаемых ФКК. По аналогии с обнаруженным ранее эффектом ФУК на функционирующие лимфоциты [24], изучаемые ФКК потенциально способны ингибировать активность Са2+-АТФазы нейтрофилов, приводя к нарушению их функций. Вероятно, способность бактерий к продукции ФКК является одним из приспособительных механизмов в защите от эффекторных клеток иммунной системы человека.
Таким образом, в результате проведенного исследования подтверждено, что ряд ФКК в клинически значимых концентрациях неблагоприятно влияют на фагоцитарную функцию нейтрофилов, что может способствовать манифестации сепсиса у реанимаци-
206
АНЕСТЕЗИОЛОГИЯ И РЕАНИМАТОЛОГИЯ. 2016; 61(3)
ФУК
ГФУК
ФМК
120 -| 100 -80 -60 -4020 -0 -
120 100 80 60 40 20 О
0,7
7,1
0,7
6,6
0,6
6,0
п-ГФМК 100
ФПК
0,5
5,5
0,8
6,7
ФУК
ГФУК * *
ФМК
п-ГФМК
ФПК
100
0,7 7,1 0,7 6,6 0,6 6,0 0,5 5,5 0,8 6,7
Влияние фенилкарбоновых кислот на фагоцитарную активность (а; n = 30) и фагоцитарное число (б; n = 18).
онных больных. С тяжестью состояния больных в большей степени коррелируют уровни гидроксили-рованных ФКК: ФМК, п-ГФУК, п-ГФМК.
ВЫВОДЫ
1. Уровень ароматических микробных метаболитов отражает тяжесть бактериального воспалительного процесса: максимальные значения в сыворотке крови отмечаются при тяжелом течении инфекции и сепсисе.
2. В эксперименте in vitro показано, что ароматические микробные метаболиты способны подавлять фагоцитарную активность нейтрофилов Увеличение концентрации ФУК, п-ГФУК, ФМК приводит к уменьшению количества фагоцитирующих клеток. Повышение концентрации п-ГФУК, ФМК, п-ГФМК снижает поглотительную способность нейтрофилов.
3. Обнаруженная обратная корреляционная связь уровней ФКК с показателями систолического и диа-столического артериального давления у реанимационных больных с сепсисом может быть связана с участием этих метаболитов в развитии септического шока, что указывает на необходимость продолжения исследований в этом направлении.
Финансирование. Работа поддержана грантом Российского Научного Фонда № 15-15-00110
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Л И Т Е Р А Т У Р А
(пп. 1-3, 7-12, 14-20, 22-29, 32-34, 40-43 см. REFERENCES)
4. Белобородова Н.В., Дмитриева И.Б., Черневская Е.А. Сепсис-индуцированный иммунопаралич: патогенез, диагностика и возможные пути коррекции. Анестезиология и реаниматология. 2008; 6: 42-8.
5. Белобородова Н.В. Сепсис - новый взгляд на проблему. Терапевт. архив. 2013; 11: 82-90.
6. Мороз В.В., Голубев А.М. Сепсис: принципы диагностики. Общая реаниматология. 2013; 9(6): 5-7.
13. Черневская Е.А. Роль биохимических маркеров в периопе-рационном мониторинге инфекции у кардиохирургических пациентов: Дис. ... канд. биол. наук. М.; 2008. 111 с. 21. Сорокина, Е.В. Toll-подобные рецепторы и первичное распознавание патогена при дерматозах инфекционной и неинфекционной этиологии. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2012; 2: 6-15.
30. Белобородова Н.В., Оленин А.Ю., Ходакова А.С., Черневская Е.А., Хабиб О.Н. Происхождение и клиническое значение низкомолекулярных фенольных метаболитов в сыворотке крови человека. Анестезиология и реаниматология. 2012; 5: 65-72.
31. Белобородова Н.В., Оленин А.Ю., Ходакова А.С. Способ лабораторной диагностики сепсиса. Патент РФ № 2423704; 2009.
35. Белобородова, Н.В. Интеграция метаболизма человека и его микробиома при критических состояниях. Общая реаниматология. 2012; 8(4): 42-54.
36. Белобородова Н.В., Мороз В.В., Осипов А.А., Бедова А.Ю., Оленин А.Ю., Гецина М.Л. и др. Нормальный уровень сепсис-ассоциированных фенилкарбоновых кислот в сыворотке крови человека. Биохимия. 2015; 3: 449-55.
37. Мороз В.В., Белобородова Н.В., Бедова А.Ю., Ревельский А.И., Гецина М.Л., Осипов А.А. и др. Разработка и адаптация к условиям клинической лаборатории методик газохроматографического определения фенилкарбоновых кислот в сыворотке крови. Журнал аналитической химии. 2015; 70(4): 418-25.
38. Гордиенко Г.И., Бородина Т.М., Дудина Т.А., Самсыгина Г.А. Исследование поглотительной и метаболической активности нейтрофилов переферической крови у детей раннего возраста. Педиатрия. 2003; 5: 1-4.
39. Хорошилов С.Е., Белобородова Н.В., Никулин А.В., Бедова А.Ю., Гецина М.Л., Осипов А.А. Элиминация низкомолекулярных ароматических метаболитов во время экстракорпоральной детоксикации у больных ОПН при сепсисе. В кн.: Сборник материалов Девятой международной конференции «Актуальные аспекты экстракорпорального очищения крови в интенсивной терапии». М.; 2014; 44-45.
R E F E R E N C E S
1. Alberti C., Brun-Buisson C., Burchardi H., Martin C., Goodman S., Artigas A. et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive Care Med. 2002; 28(2): 108-21.
2. Vincent J.L., Sakr Y., Sprung C.L., Ranieri V.M., Reinhart K., Gerlach H. et al. Sepsis in European intensive care units: results of the SOAP study. Crit. Care Med. 2006; 34(2): 344-53.
3. Vincent J.L., Rello J., Marshall J., Silva E., Anzueto A., Martin C.D. et al. EPIC II Group of Investigators. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 2009; 302(21): 2323-9.
4. Beloborodova N.V., Dmitriyeva N.B., Chernevskaya Ye.A. Sepsis-induced immune paralysis: pathogenesis, diagnosis, and
207
possible modes of correction. Anesteziologiya i Reanimatologi-ya. 2008; 6: 42-8. (in Russian)
5. Beloborodova N.V. Sepsis - a new look at the problem. Tera-pevt. arhiv. 2013; 11: 82-90. (in Russian)
6. Moroz V.V., Golubev A.M. Sepsis: Principles of Diagnosis. GeneralReanimatology. 2013; 9(6): 8-10.
7. Borregaard N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 2010; 33(5): 657-70.
8. Kolaczkowska E., Kubes P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat. Rev. Immunol. 2013; 13(3): 159-75.
9. Summers C., Rankin S.M., Condliffe A.M., Singh N., Peters A.M., Chilvers E.R. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 2010; 31(8): 318-24.
10. Segal A.W. How neutrophils kill microbe. Ann. Rev. Immunol. 2005; 23: 197-223.
11. Hogg N., Stewart M.P., Scarth S.L., Newton R., Shaw J.M., Law S.K. et al. A novel leukocyte adhesion deficiency caused by expressed but nonfunctional beta2 integrins Mac-1 and LFA-1. J. Clin. Invest. 1999; 103(1): 97-106.
12. Vento S., Cainelli F. Infections in patients with cancer undergoing chemotherapy: aetiology, prevention, and treatment. Lancet Oncol. 2003; 4(10): 595-604.
13. Chernevskaya E.A. The role of biochemical markers of infection in the perisurgical monitoring patients undergoing cardiac surgery: diss. Moscow; 2008. (in Russian)
14. Lerman Y.V., Kim M. Neutrophil migration under normal and sepsis conditions. Cardiovasc. Hematol. Disord. Drug Targets. 2015; 15(1): 19-28.
15. Sonego F., Alves-Filho J.C., Cunha F.Q. Targeting neutrophils in sepsis. Expert. Rev. Clin. Immunol. 2014; 10(8): 1019-28.
16. Taneja R., Sharma A.P., Hallett M.B., Findlay G.P., Morris M.R. Immature circulating neutrophils in sepsis have impaired phagocytosis and calcium signaling. Shock. 2008; 30(6): 618-22.
17. Xu, R. et al. Complement 5a receptor-mediated neutrophil dysfunction is associated with a poor outcome in sepsis. Cell. Mol. Immunol. 2015. Available at: http://www.nature.com/cmi/jour-nal/vaop/ncurrent/full/cmi2014136a.html (дата обращения: 05.01.2015).
18. Dellinger R.P., Levy M.M., Rhodes A., Annane D., Gerlach H., Opal S.M. et al. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock, 2012. Intensive Care Med. 2013; 39(2): 165-228.
19. Tansho-Nagakawa S., Ubagai T., Kikuchi-Ueda T., Koshio O., Koshibu Y., Kikuchi H. et al. Analysis of membrane antigens on neutrophils from patients with sepsis. J. Infect. Chemother. 2012; 18(5): 646-51.
20. Huber-Lang M., Sarma V.J., Lu K.T., McGuire S.R., Padga-onkar V.A., Guo R.F. et al. Role of C5a in multiorgan failure during sepsis. J. Immunol. 2001; 166(2): 1193-9.
21. Sorokina E.V. Toll-like receptors and the initial recognition of the pathogen in dermatoses infectious and noninfectious etiologies. Immunopatologija, allergologija, infektologija. 2012; 2: 6-15. (in Russian)
22. West M.A., Wallin R.P., Matthews S.P., Svensson H.G., Zaru R., Ljunggren H.G. et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via Toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 2004; 305(5687): 1153-7.
23. Monneret G. How to Identify Systemic Sepsis-Induced Immu-noparalysis. Advances in sepsis. 2005; 4(2): 42-49.
24. Zareckij M.M., Chernikova N.M. Agranulocytosis: from diagnosis to the choice of treatment strategy. Therapia. 2011; 1: 27-29. (in Russian)
25. Gao K., Xu A., Krul C., Venema K., Liu Y., Niu Y. et al. Of the major phenolic acids formed during human microbial fermentation of tea, citrus, and soy flavonoid supplements, only 3,4-di-hydroxyphenylacetic acid has antiproliferative activity. J. Nutr. 2006; 136(1): 52-7.
26. González-Barrio R., Edwards C.A., Crozier A. Colonic Catabo-lism of Ellagitannins, Ellagic Acid, and Raspberry Anthocya-
nins: In Vivo and In Vitro Studies. Drug Metab. Dispos. 2011; 39(9): 1680-8.
27. Lee H.C., Jenner A.M., Low C.S., Lee Y.K. Effect of tea pheno-lics and their aromatic fecal bacterial metabolites on intestinal microbiota. Res. Microbiol. 2006; 157(9): 876-84.
28. Russell W.R., Duncan S.H., Scobbie L., Duncan G., Cantlay L., Calder A.G. et al. Major phenylpropanoid-derived metabolites in the human gut can arise from microbial fermentation of protein. Mol. Nutr. Food Res. 2013; 57(3): 523-35.
29. Valerio F., Lavermicocca P., Pascale M., Visconti A. Production of phenyllactic acid by lactic acid bacteria: an approach to the selection of strains contributing to food quality and preservation. FEMS Microbiology Letters. 2004; 233(2): 289-95.
30. Beloborodova N.V., Olenin A.Yu., Khodakova A.S., Chernevs-kaya E.A., Khabib O.N. Low-molecular phenol metabolites in blood serum: origin and clinical significance. Anesteziologiya i Reanimatologiya. 2012; 5: 65-72.
31. Beloborodova N.V., Olenin A.Yu., Khodakova A.S. The method of laboratory diagnosis of sepsis. Patent RF N 2423704; 2009. (in Russian)
32. Khodakova A., Beloborodova N. Microbial metabolites in the blood of patients with sepsis. Crit. Care. 2007; 11(Suppl 4): P5.
33. Fedotcheva N.I., Kazakov R.E., Kondrashova M.N., Beloborodova N.V. Toxic effects of microbial phenolic acids on the functions of mitochondria. Toxicol Lett. 2008 ; 180(3): 182-8.
34. Beloborodova N., Bairamov I., Olenin A., Shubina V., Teplova V., Fedotcheva N. Effect of phenolic acids of microbial origin on production of reactive oxygen species in mitochondria and neutrophils. J. Biomed. Sci. 2012; 19: 89.
35. Beloborodova N.V. Integration of Metabolism in Man and His Microbiome in Critical Conditions. General Reanimatology. 2012; 8(4): 42-54.
36. Beloborodova N.V., Moroz V.V., Osipov A.A., Bedova A.Yu, Olenin A.Yu, Getsina M.L. et al. Normal Level of Sepsis-Associated Phenylcarboxylic Acids in Human Serum. Biochemistry (Moscow). 2015; 80(3): 374-378.
37. Moroz V.V., Beloborodova N.V., Bedova A.Yu, Revel'skii A.I., Getsina M.L., Osipov A.A. et al. Development of Methods of the Gas Chromatographic Determination of Phenylcarboxylic Acids in Blood Serum and their Adaptation to Clinical Laboratory Conditions. Journal of Analytical Chemistry. 2015; 70(4): 495-501.
38. Gordienko G.I., Borodina T.M., Dudina T.A., Samsygina G.A. Study absorption and metabolic activity of peripheral blood neutrophils in infants. Pediatria. 2003; 5: 1-4. (in Russian)
39. Horoshilov S.E., Beloborodova N.V., Nikulin A.V., Bedova A.Ju., Gecina M.L., Osipov A.A. The elimination of low molecular weight aromatic metabolites during extracorporeal detoxification in patients with acute renal failure in sepsis. In: The collection of materials of the Ninth International Conference "Actual aspects of extracorporeal blood purification in Intensive Care"Moscow; 2014; 44-45. (in Russian)
40. Sarshor Y.N., Beloborodova N.V., Bedova A.Y., Osipov A.A., Chernevskaya E.A., Getsina M.L. New criteria of bacterial load in critically ill patients. SHOCK. 2013; 40(Suppl.1): 31.
41. Rogers A.J., McGeachie M., Baron R.M., Gazourian L., Haspel J.A., Nakahira K. et al. Metabolomic Derangements Are Associated with Mortality in Critically Ill Adult Patients. PLoS ONE 2014; 9(1): e87538.
42. Chernevskaya E.A, Beloborodova N.V. The relation between phagocytic activities of neutrophils and microbial metabolites in blood. Gastroentology San.-Peter. 2009; 4: A5.
43. Jankowski J., Luftmann H., Tepel M., Leibfritz D., Zidek W., Schlüter H. Characterization of dimethylguanosine, phenyle-thylamine, and phenylacetic acid as inhibitors of Ca2+ ATPase in end-stage renal failure. J. Am. Soc. Nephrol. 1998; 9(7): 1249-57.
nociynuna 15.11.2015 npHHOTa b neHaTb18.01.2016
208
АНЕСТЕЗИОЛОГИЯ И РЕАНИМАТОЛОГИЯ. 2016; 61(3)
