Динамика функциональной активности эффекторов врожденного иммунитета у онкологичес- ких больных с сепсисом при проведении экстракорпоральной детоксикации

Анисимова Наталья Юрьевна; Громова Елена Георгиевна; Кузнецова Людмила Сергеевна; Андреевна Плужникова Наталья; Андрейчиков Антон Александрович; Андрейчиков Александр Владимирович; Киселевский Михаил Валентинович

8. Сорокин А.А., Лебединский В.Ю. Тканевое давление в оценке воспалительной реакции кожи при термическом ожоге // Управление морфогенезом тканей и органов в процессах адаптации. — Иркутск, 1989. — Ч. 1. — С. 118-119.

9. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Расулов М.Ф.,

Крашенинников М.Е., Зайденов В.А. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга эффективнее эмбриональных фибробластов стимулируют регенерацию глубоких ожоговых ран // Бюл. эксперим. биологии и медицины — 2003. — Т. 136, № 8. — С. 220.

Информация об авторах: 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 3. ИГМУ, кафедра анатомии человека, тел. (3952) 24-33-61. Буланкина Ирина Анатольевна — доцент, к.м.н. Лебединский Владислав Юрьевич — профессор, д.м.н. Изатулин Владимир Григорьевич — профессор, д.м.н.

УДК 616-002-008.953-092

ДИНАМИКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЭФФЕКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ С СЕПСИСОМ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЙ ДЕТОКСИКАЦИИ

Наталья Юрьевна Анисимова1, Елена Георгиевна Громова1, Людмила Сергеевна Кузнецова1, Плужникова Наталья Андреевна1, Антон Александрович Андрейчиков1, Александр Владимирович Андрейчиков2, Михаил Валентинович Киселевский1 ^Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина РАМН, директор — д.м.н., акад. РАН и РАМН М.И. Давыдов; 2Красноярский государственный медицинский университет имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого,

ректор — д.м.н., проф. И. П. Артюхов)

Резюме. Целью данного исследования являлась динамическая оценка цитотоксической и фагоцитарной активности лейкоцитов крови онкологических больных с генерализованными гнойно-септическими осложнениями на фоне проведения экстракорпоральной детоксикации. Были исследованы образцы крови онкологических больных, поступивших в отделение реанимации и интенсивной терапии с диагнозом сепсис, до начала процедуры ЭД и сразу после ее окончания, а также здоровых доноров в качестве контрольной группы. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что онкологические больные с сепсисом характеризуются гиперактивностью эффекторов врожденного иммунитета. Так, в сравнении со здоровыми донорами активность натуральных киллеров у больных была выше на 25-40%. Фагоцитарный индекс и фагоцитарное число превышали показатели контрольной группы в 2,7 и 3,2 раза соответственно.

Ключевые слова: лейкоциты, цитотоксичность, фагоцитарная активность, сепсис, экстракорпоральная деток-сикация.

THE DYNAMICS OF FUNCTIONAL ACTIVITY OF EFFECTORS OF INNATE IMMUNITY IN ONCOLOGICAL PATIENTS WITH SEPSIS DURING THE CONDUCTING OF EXTRACORPORAL DETOXIFICATION

Natalia Yurjevna Anisimova1, Elena Georgievna Gromova1, Ludmila Sergeevna Kuznetsova1, Anton Alexandrovich Andreychikov1, Natalia Andreevna Pluznikova1, Alexander Vladimirovich Andreychikov2, Mikhail Valentinovich Kiselevsky1 (1N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS ; Krasnoyarsk State Medical University named after

prof. V.F. Voyno-Yasenetsky)

Summary. The purpose of the work was the estimation of the dynamics of the cytotoxic and phagocytic activity of blood leukocytes of cancer patients with general septic complications during the extracorporal detoxification. The blood samples of patients, collected prior to the extracorporal detoxification and right after its termination, as well as healthy donor's blood samples (control group) have been investigated. As a result, it has been revealed that cancer patients with sepsis are characterized by hyperactivity of innate immunity effectors. Thus, in comparison with healthy donors the patient's natural killers activity was 25-40 % higher. The phagocytic index and phagocytic number exceeded the control group level 2,7 and 3,2 times respectively.

Key words: leukocyte, cytotoxicity, phagocytic activity, sepsis, extracorporal detoxification.

Натуральные киллеры (НК), гранулоциты и моноциты, являющиеся эффекторами врожденного иммунного ответа, играют важнейшую роль в патогенезе сепсиса. В условиях, сопутствующих сепсису бактериемии и бактериальной токсемии, эти клетки, обеспечивают естественную резистентность организма к инфекционным агентам. Однако их чрезмерная активация запускает каскадную гиперпродукцию медиаторов воспаления. Эти полипотентные биологически активные молекулы инициируют и усиливают системную воспалительную реакцию.

Ранее было показано, что скорость развития и тяжесть клинических проявлений сепсиса не всегда коррелирует с фактическим наличием в крови больного бактериального агента, особенно в случае грамотри-цательного сепсиса [1]. Антимикробная терапия при лечении сепсиса не всегда приводит к улучшению физиологических и клинических показателей больного.

Поэтому представляется целесообразным удаление из крови не только триггерных факторов (бактериальных продуктов), но и медиаторов воспаления (цитокины и хемокины) в возможно более ранние сроки, до наступления необратимых патологических изменений в органах и тканях больного. Подобный терапевтический подход может быть реализован с использованием методов экстракорпоральной детоксикации (ЭД). В настоящее время для ЭД больных с сепсисом в основном применяют методы гемофильтрации, гемодиафильтра-ции и гемосорбции. В литературе имеется достаточное количество работ, характеризующих особенности гуморального иммунитета пациентов с сепсисом, а также изменение его параметров в процессе ЭД. Однако исследования, посвященные функциональной реактивности эффекторов врожденного клеточного иммунитета, малочисленны, а полученные результаты весьма противоречивы. Это утверждение в полной мере можно

Рис. 1. Динамика НК-активности лейкоцитов крови онкологических больных с сепсисом в процессе экстракорпоральной деток-сикации (ЭД), в сравнении с показателями здоровых. Приведены значения индекса цитотоксической активности (ИЦА) (медиана, 25%+75%) при различном соотношении клеток-мишеней и клеток-эффекторов (1:10; 1:5; 1:2; 1:1).

Примечание: * — значения, существенно отличающиеся от контрольной серии (p<0,05).

отнести к описанию функциональных характеристик иммунокомпетентных клеток крови онкологических больных с генерализованными гнойно-септическими осложнениями. С одной стороны, ряд исследователей указывает на нарастающий иммунопаралич организма больного, опосредуемый как большой концентрацией иммуносупрессивных агентов (IL-10), так и снижением синтеза белков, определяющих функциональную активность иммунокомпетентных клеток (IL-12) [2]. С другой стороны многие исследователи получили данные, свидетельствующие о повышенной продукции клетками органов и тканей больных с сепсисом провоспалитель-ных цитокинов (IL-8, TNFa, IL-6, IL-1ß), в десятки раз превышающих их уровень у здоровых доноров [6,8]. Логичным следствием этого феномена должно быть повышение функциональной активности, в первую очередь эффекторов врожденного иммунитета.

Учитывая вышеизложенное, целью данного исследования являлась динамическая оценка цитотоксиче-ской и фагоцитарной активности лейкоцитов крови онкологических больных с генерализованными гнойно-септическими осложнениями на фоне проведения экстракорпоральной детоксикации.

Материалы и методы

Были исследованы образцы крови 10 больных раком желудка (6), легкого (4), подвергнутых радикальному хирургическому вмешательству в объеме гастрэктомии или пневмонэктомии с лимфодиссекцией. У пациентов (8 женщин и 2 мужчин со средним возрастом 42±15 года) на фоне послеоперационных осложнений был диагностирован сепсис на основании признаков системной воспалительной реакции (повышение температуры, ле-коцитоз и кардиореспираторные расстройства), наличия очага инфекции (поддиафрагмальный абсцесс, перитонит, пневмония) и повышение уровня прокальци-тона. Больным проводили 2-4 процедуры гемодиафиль-трации (F 60S, HF 80s, Fresenius, Germany) в сочетании с гемосорбцией (Adsorba 300С, Gambro, Sweden). Пробы крови отбирались до процедуры и сразу после ее окончания. В качестве референтного контроля использовали кровь 13 здоровых доноров (9 женщин и 4 мужчины со средним возрастом 29±11 лет). У всех пациентов и доноров было получено информированное согласие на проведение научных исследований.

НК-активность. Из крови на градиенте плотности фиколла-урографина выделяли мононуклеарные лейкоциты (МЛ), которые дважды отмывали центрифугированием в среде RPMI-1640 (ПанЭко, РФ). В качестве клеток-мишеней (КМ) использовали клетки линии К-562. Подсчитывали количество живых эффекторных и опухолевых клеток в суспензиях с использованием

трипанового синего (Sigma, USA). Для коинкубации клеток использовали 96-луночные планшеты (Nung, USA, или Costar, France). Концентрация клеток К-562 в среде составляла 500000 кл/мл. Соотношение КМ к клеткам-эффекторам МЛ (КЭ) в среде соответствовало 1:1; 1:2; 1:5 и 1:10. После коинкубации в течение 20-24 ч определяли индекс цитотоксической активности (ИЦА) натуральных киллеров [3].

Фагоцитарная активность. В качестве объектов фагоцитоза использовали суспензии гранул латекса (ПанЭко, РФ). Коинкубацию крови, стабилизированной гепарином, и латекса осуществляли в течение 40 минут. Готовили мазок, окрашивали его по Романовскому-Гимзе и проводили микроскопию с иммерсией. В каждом мазке посчитывали не менее 100 нейтрофилов, вычисляя фагоцитарный индекс (ФИ) — процент клеток, содержащих фагоцитированные объекты, а также фагоцитарное число (ФЧ) — количество гранул латекса в одном фагоците.

Статистический анализ. Описательная статистика групп представлена в формате: значения медианы, 25-го и 75-го квартилей (медиана, 25%^75%). Сравнительный статистический анализ значений опытной и контрольной групп проведен с использованием U-критерия

Фагоцитарная активность

а) Фагоцитарный индекс.

б) Фагоцитарное число.

Рис. 2. Показатели интенсивности фагоцитоза гранулоцитов крови онкологических больных с сепсисом до и после экстракорпоральной детоксикации (ЭД) в сравнении с показателями здоровых доноров (медиана, 25%+75%). Примечание: * — значения, значимо отличающиеся от контрольной серии (р<0,05).

Манна-Уитни. Определены показатели p, учитываемые как значимые при р<0,05. Расчеты проведены с использованием пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft, USA).

Результаты и обсуждение

Исследование НК-активности лейкоцитов крови. В ходе данного исследования мы проводили сравнительную оценку НК-активности МЛ крови здоровых доноров и онкологических больных с сепсисом. Определение значений индекса цитотоксической активности (ИЦА) осуществляли при различном соотношении КМ:КЭ: 1:10; 1:5; 1:2; 1:1.

Данные, приведенные на рисунке 1, свидетельствуют о том, что до ЭД у пациентов значительно повышены показатели НК-активности МЛ крови по сравнению со здоровыми донорами (от 2 до 20,5 раз, в зависимости от соотношения клеток— мишеней и клеток-эффекторов). В результате проведения экстракорпоральной детокси-кации наблюдалась нормализация данного показателя функциональной активности иммунокомпетентных клеток крови. Об этом свидетельствует тот факт, что ИЦА натуральных киллеров после ЭД существенно не отличались от значений соответствующих показателей здоровых доноров.

Данные, приведенные на рисунках 2 и 3, свидетельствуют о том, что показатели фагоцитарной активности нейтрофилов онкологических больных с сепсисом (ФИ и ФЧ) были существенно выше соответствующих показателей здоровых доноров (в 2,7 раза и в 3,2 раза соответственно). После процедуры ЭД наблюдалась очевидная тенденция нормализации исследуемых показателей.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что онкологические больные с сепсисом характеризуются гиперактивностью эффекторов врожденного иммунитета. Так, НК-активность у больных была выше на 25-40% по сравнению со здоровыми донорами. Ранее Zeerleder и соавт. [13] установили у 58% больных с тяжелым сепсисом и септическим шоком, сопровождающимися высокой частотой развития СПОН и смертностью, повышение уровня IL-12, а у 50 % — увеличение индукции гранзимов А и В. Известно, что IL-12 является ключевым цитокином, усиливающим цитотоксичность НК-клеток и T-киллеров [4], а гранзимы — эффектор-ные молекулы опосредующие цитотоксичность. О повышении уровня активности НК у больных с сепсисом сообщают также Toft и др. [5,11]. Выявленная нами ги-

перактивация эффекторов врожденного иммунитета

а) б)

Рис. 3. Микрофотографии нейтрофилов крови здорового донора (а) и онкологического больного с сепсисом (б) после инкубации с гранулами латекса (1=40 мин).

(НК и нейтрофилов) при сепсисе, может быть причиной повреждения эндотелия и клеток паренхиматозных органов, за счет воздействия ферментов, свободных радикалов и других секретируемых факторов (перфо-рины, гранзимы) и потому является важным звеном патогенеза органной и полиорганной недостаточности [12]. По нашим данным, фагоцитарная активность нейтрофилов крови больных также была повышенной: число активных фагоцитов в крови (ФИ) — в 2,7 раза, а количество объектов фагоцитоза, захваченных одной клеткой — в 3,2 раза выше, чем у здоровых доноров. Это может являться следствием увеличения продукции провоспалительных цитокинов, в особенности ИЛ-8 — ключевого цитокина участвующего в рекрутировании нейтрофилов к месту воспаления и стимулирующего их активность [13]. Кроме того, патоген-ассоциированные комплексы также могут активировать нейтрофилы [10]. При сепсисе нейтрофилы играют неоднозначную роль. С одной стороны они важны для уничтожения болезнетворных микроорганизмов, а с другой — чрезмерный выброс медиаторов воспаления и реактивных кислородных радикалов, может вызывать повреждение тканей, в частности, легкого, наблюдаемое при остром респираторном дистресс-синдроме или пневмонии. Активированные НК также способны выделять биологически активные вещества, вызывающие нарушения микроциркуляции, увеличивая проницаемость сосудистой стенки [7]. Очевидно, что гиперактивацию клеток-эффекторов врожденного иммунитета (НФ, НК) можно рассматривать как важное звено в патогенезе органной и полиорганной недостаточности. Применение ЭД, как было показано ранее [9], позволяет элиминировать из крови больных с сепсисом избыток медиаторов воспаления, что в свою очередь вероятно приводит к нормализации функциональной активности эффекторов врожденного иммунитета и может нивелировать их поражающее действие на органы и ткани.

ЛИТЕРАТУРА

1. Исаков Ю.Ф., Белобородова Н.В. Сепсис у детей. — М.: Мокеев, 2001. — 369 с.

2. Тугуз А.Р. Иммунопатогенез ранних послеоперационных осложнений у онкологических больных: Автореф. ... дисс. д-ра. биол. наук. — М., 2003. — 47 с.

3. Шпакова А. П., Павлова К. С., Булычева Т.И. МТТ-колориметрический метод определения цитотоксической активности естественных киллерных клеток // Клиническая лабораторная диагностика. — 2000. — №2. — С. 20-23.

4. Bermudez L.E., Wu M., YoungL.S. Interleukin-12-stimulated natural killer cells can activate human macrophages to inhibit growth of Mycobacterium avium // Infect. Immun. — 1995. — Vol. 63, № 10. — P. 4099-4104.

5. Giamarellos-Bourboulis E.J., Tsaganos T., Spyridaki E., et al. Early changes of CD4-positive lymphocytes and NK cells in patients with severe Gram-negative sepsis // Crit. Care. — 2006. — Vol. 10. — P. 166.

6. Kumar A. T., Sudhir U., Punith K., et al. Cytokine profile in elderly patients with sepsis // Indian J. Crit. Care. Med. — 2009. — Vol. 13. — P. 74-78.

7. Kumar V., Sharma A. Is neuroimmunomodulation a future

therapeutic approach for sepsis?// Int. Immunopharmacol. — 2010. — Vol. 10, №1 — P. 9-17.

8. Rigato O., Ujvari S., Castelo A., at al. Tumor necrosis factor alpha (TNF-a) and sepsis: Evidence for a role in host defense // Infection. — 1996. — Vol. 24. — P. 314-318.

9. Sakata H., Yonekawa M., Kawamura A. Blood purification therapy for sepsis// Transfus. Apher. Sci. — 2006. — Vol. 35, №3. — P. 245-251.

10. Shimizu T., Tsuchihashia Y., Akabori H., at al. Endotoxin apheresis for sepsis// Transfus. Apher. Sci. — 2006.— Vol. 35, №3. — P. 271-282.

11. Toft P., Dagnxs-Hansen F., Tonnesen E., at al. The effect of surgical stress and endotoxin-induced sepsis on the NK-cell activity, distribution and pulmonary clearance of YAC-1 and melanoma cells // Apmis. — 1999. — Vol. 107, Issue 1-6. — P. 359-364.

12. Yoneda O., Imai T., Goda S., et al. Fractalkine — mediated endothelial cell injury by NK cells // J. Immunol. — 2000. — Vol. 164. — P. 4055-4062.

13. Zeerleder S., Hack C.E., Caliezi C., et al. Activated cytotoxic T cells and NK cells in severe sepsis and septic shock and their role in multiple organ dysfunction // Clin. Immunol. — 2005. — Vol. 116, № 2. — P. 158-165.

Информация об авторах: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, e-mail: n.u.anisimova@gmail.com

Анисимова Наталья Юрьевна — с.н.с., к.б.н. Громова Елена Георгиевна — заведующая, д.м.н., e-mail: e_gromova05@mail.ru Кузнецова Людмила Сергеевна — врач, Плужникова Наталья Андреевна — аспирант, Андрейчиков Антон Александрович — стажер, Андрейчиков Александр Владимирович — профессор, д.м.н., Киселевский Михаил Валентинович — заведующий лабораторией, д.м.н., профессор, e-mail: kisele@inbox.ru.

ФИБРИНОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ А-ДЕФЕНЗИНОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПАРОДОНТА

Елена Товьевна Доманова, Намжил Нанзатович Цыбиков, Валерий Валерьевич Зобнин (Читинская государственная медицинская академия, ректор д.м.н., проф. А.В. Говорин, кафедра патологической физиологии, зав. — д.м.н., проф. Н.Н. Цыбиков, кафедра стоматологии ФПК и ППС, зав. — к.м.н. В.В. Зобнин)

Резюме. Изучали фибринолитическую активность а-дефензинов у лиц со здоровым пародонтом, хроническим гингивитом, хроническим генерализованным пародонтитом. В ходе опытов установлены корреляционные взаимосвязи между уровнем а-дефензинов в смывах десневой борозды, кармана и фибринолизом. При воспалительных заболеваниях пародонта дефензины способны ингибировать фибринолиз, что помогает избежать микробной инвазии, однако при длительном процессе подавляется репарация тканей, развивается хроническое течение заболевания.

Ключевые слова: заболевания пародонта, а-дефензины, фибринолиз.

FIBRINE ACTITY OF А — DEFENSINES IN CHRONIC PERIODONTAL DISEASES

E.T. Domanova, N.N. Tsybikov, V.V. Zobnin (Chita State Medical Academy)

Summary. Fibrine activity of а-Defensines in patients with healthy teeth, with chronic gingivitis, with chronic generalized periodontitis was studied. In the experimental course the correlation interactions between the а-Defensine level in the washing of the gum line, of the pocket and fibrinolysis have been revealed. In case of Slammatory periodontal diseases defensines, can inhibit fibrinolysis, which assists in prevention of microbe invasion, however, tissue restoration is suppressed in the long-lasting process, the chronic course of the disease is developed.

Key words: the periodontal diseases, а-Defensins, fibrinolysis.

Дефензины — катионные пептиды молекулярной массой 3-4 кДа, представляющие собой генетически различные а и b подсемейства и циклические Q-формы. Молекула дефензина состоит из 29-35 аминокислот и содержит 3 внутримолекулярные дисульфидные связи. У человека а-дефензины (human neutrophil peptides, HNP-а), составляют около 30-50% общего клеточного белка и локализованы в азурофильных гранулах ней-трофилов [4, 7]. В норме концентрация HNP-а в плазме менее 15 нМ, но может увеличиваться до 50 мкМ в ответ на инфекционные и воспалительные стимулы [8]. При нарушении эпителиального барьера, микроорганизмы, проникающие в организм хозяина, стимулируют высвобождение нейтрофилами HNP-а, что ведет к активации врожденного иммунитета [6]. Эти пептиды способны комплексировать с белками и сохраняться в жидкостях организма [9]. В исследованиях Abd Al-Roof Higazi и Tomas Ganz (1996г) сообщалось, что последовательность аминокислот HNP-а напоминает Lys-связывающий участок в Крингл-доменах плаз-миногена. Дальнейшее изучение этих пептидов выявило двухфазное дозозависимое влияние на плазминоген-опосредованный фибринолиз. Ингибирующий эффект объясняется тем, что плазмино-ген, связанный с фибрином, в присутствии HNP-а менее восприимчив к активации тканевым активатором плаз-миногена (ТАП), а стимуляция фибринолиза — конкурентными отношениями между молекулами ТАП и HNP-а, за один сайт связывания [7]. В

физиологических условиях процессы фибринообразо-вания и фибринолиза взаимоуравновешены, в том числе и в полости рта. В ходе изучения фибринолиза при воспалительных заболеваниях пародонта (ВЗП) П.П. Беликов отметил, что добавление смешанной слюны до осаждения эуглобулиновой фракции плазмы увеличивает скорость растворения фибринового сгустка, противоположный эффект проявляется если внести секрет после выпадения эуглобулинов в осадок [3]. Было выдвинуто предположение, что в роли ингибиторов фибринолиза могут выступать вещества находящиеся в клетках. Возможно это дефензины, содержащиеся в нейтрофилах десневой жидкости (ДЖ). Изучению этого вопроса посвящено исследование.

Цель исследования — проанализировать влияние дефензинов на фибринолитическую систему в здоровом пародонте и при воспалительных заболеваниях: хронический гингивит и хронический генерализованный па-родонтит.

Таблица 1

Уровень дефензина и ИЛ-8, в смывах десневой борозды у лиц со здоровым пародонтом, пациентов с хроническим гингивитом, и в смывах пародонтального кармана при пародонтите

Н — норма смывы из десневой борозды здоровых Г — смывы из десневой борозды больных хроническим гингивитом П — смывы из пародонтального кармана больных пародонтитом

Дефензины (пг/мл) Mе±SD (процентили 25-75) 946,3 ± 16,74 (940,4 — 963,6) 900,6 ± 69,66 (823,8 — 917,8) Z= 3,55* 709,1 ± 229,46 (619,2 — 769,5) Z=4,11*, Z= 3,34**

ИЛ-8 пг/мл 18,56±8,89 (15,41 — 32,09) 434,80±27,68 (420,30 — 466,10) Z= 4,67* 106,0±25,24 (104,40 — 110,40) Z= 4,63*, Z= 4,63**

Примечание: Ъ — коэффициент Манна-Уитни (р <0,05), *— уровень значимых отличий между нормой, хроническим гингивитом и пародонтитом; ** — между хроническим гингивитом и пародон-титом.