CC BY
51
УДК 616.155.32:616.998.161.22
н.Г. муравьева, A.A. савченко, В.Т. манчук
ОСОБЕННОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО СТАТУСА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ У ДЕТЕЙ С ДИСФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ РАССТРОЙСТВАМИ БИЛИАРНОГО ТРАКТА И ПРИ ИХ АССОЦИАЦИИ С ЛЯМБЛИОЗОМ
Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск)
При исследовании уровней активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у детей с дисфункциональными, расстройствами, билиарного тракта (ДРБТ) и. с ДРБТв ассоциации, слямблиозом установлены значительные изменения в системе внутриклеточного метаболизма. У детей с ДРБТ в лимфоцитах крови, снижены, уровни субстратного потока по терминальным, реакциям, гликолиза и. цикла трикарбоновых кислот, что определяет, ингибирование, соответственно, анаэробного и аэробного дыхания клеток. У детей с ДРБТ в ассоциации с лямблиозом. установлено, в лимфоцитах крови, при. сохранении, интенсивности, терминальных реакций анаэробного гликолиза на уровне нормы снижается, активность ферментов, определяющих состояние аэробного дыхания. Независимо от наличия, или. отсутствия, лямблиоза у детей с ДРБТ снижена активность пентозофосфатного цикла, что характеризует, ингибирование соответствующих реакций макромолекулярного синтеза. Ключевые слова: дисфункциональные расстройства билиарного тракта, лямблиоз, метаболизм, лимфоциты
THE ENZYMATIC STATUS FEATURES IN BLOOD LYMPHOCYTES IN CHILDREN WITH DYSFUNCTIONAL DISORDERS OF BILIARY TRACT AND THEIR ASSOCIATION WITH GIARDIASIS
N.G. Muravyeva, A.A. Savchenko, V.T. Manchuk Scientific Research Institute of Medical Problems of the North SB RAMS, Krasnoyarsk
In the study of NAD(P)-dependent dehydrogenases activity in blood lymphocytes in children with dysfunctional disorders of the biliary tract (DDBT) and DDBT in association, with giardiasis detected, significant changes in the intracellular metabolism.. In children with DDBT in blood lymphocytes the levels of substrate flow decreased at the terminal reactions of glycolysis and the tricarboxylic acid, cycle, which, determines the inhibition, respectively, anaerobic and. aerobic cellular respiration. It's been established, that in blood lymphocytes of children with. DDBT, associated, with, giardiasis, the activity of enzymes determining the state of aerobic respiration is reduced, while maintaining the normal level of intensity of the terminal reactions of anaerobic glycolysis. Regardless of the presence or absence of giardiasis in children with. DDBT the activity of pentose phosphate cycle is reduced, which characterizes the inhibition, of the reactions of macromolecular synthesis.
Key words: dysfunctional disorders of the biliary tract, giardiasis, metabolism, lymphocytes
Изучение патогенеза заболеваний билиарного тракта у детей сохраняет свою актуальность, что обусловлено высокой распространенностью и неуклонным ростом данной патологии. Так, по сравнению с 1999 годом общее количество детей, страдающих заболеваниями желчного пузыря и желчевыводящей системы, увеличилось с 9,9 до 14,4 % [1]. Наиболее распространенной патологией билиарного тракта у детей являются заболевания желчевыводящей системы функционального характера (50 — 95 %) [3]. Длительное их существование может приводить к органическим изменениям желчевыводящей системы: хронический холецистит — хронический холецистит с билиарным сладжем — хронический кальку-лезный холецистит, что происходит в результате нарушения коллоидной стабильности желчи и присоединения воспалительного процесса [6]. В формировании дисфункциональных расстройств билиарного тракта (ДРБТ) имеет значение нарушение механизмов нейрогуморальной регуляции. Вместе с тем иммунная система по своей природе является регуляторной и также может вносить свой вклад в патогенез ДРБТ. Кроме того,
нейроэндокринная и иммунная системы тесно взаимосвязаны и функционируют как единое целое, в связи с чем нарушение механизмов ней-рогуморальной регуляции должно быть отражено и на состоянии иммунной системы. С этой точки зрения наиболее информативными являются метаболические ферменты клеток иммунной системы, которые отражают не только функциональную активность лимфоцитов, но и основную стратегию нейрогуморальной регуляции организма. Часто ДРБТ сопутствует паразитарная инфекция — лямблиоз. Это заболевание является широко распространенным — 350 случаев на 100 тыс. детского населения. В Российской Федерации регистрируется около 150 тыс. случаев в год, из них 80 % составляют дети в возрасте до 14 лет [4]. Лямблии, попадая в организм, значительно изменяют состояние иммунной системы, что определяет актуальность изучения метаболизма лимфоцитов при данной сочетанной патологии.
Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей метаболического статуса лимфоцитов крови у детей с ДРБТ и при их ассоциации с лямблиозом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В детском гастроэнтерологическом отделении НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН проведено комплексное клинико-инструментальное обследование 75 детей с ДРБТ. Диагноз был выставлен в соответствии с диагностическими критериями, указанными в Римском консенсусе II. Сопутствующий диагноз — лямблиоз — поставлен на основании результатов дуоденального зондирования, копрологического исследования. В обследование были включены дети в возрасте от 7 до 11 лет. Всем детям при поступлении в стационар проводилось клинико-анамнестическое обследование, общий анализ крови и мочи, биохимическое исследование крови, эзофагогастродуоденоскопия, ультразвуковое исследование органов брюшной полости с определением моторной функции желчного пузыря и состояния сфинктера Одди, дуоденальное зондирование. В качестве контроля обследовано 100 детей I и II групп здоровья аналогичного возраста.
Определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови проводили био-люминесцентным методом [5]. Данным методом определялась активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогнезы (Г3ФДГ), малик-фермента (НАДФМДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции лактатдегидрогеназы (ЛДГ и НАДНЛДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции малатдегидро-геназы (МДГ и НАДНМДГ), НАДФ- и НАДФН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ, НАДФНГДГ), НАД- и НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ, НАДНГДГ), НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (НА-
ДИЦДГ и НАДФИЦДГ) и глутатионредуктазы (ГР). Показатели активности ферментов рассчитывались в мкЕД/104 клеток. Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартильного размаха в виде 25-го и 75го процентилей (С25 и С75). Достоверность различий оценивали по критерию Манна — Уитни. Статистический анализ осуществляли в пакете прикладных программ Statistica 8.0 (StatSoft Inc., 2007).
Проводимое исследование, согласно Хельсинской декларации, осуществлялось при подписании информированных согласий родителями, было одобрено этическим комитетом НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов периферической крови у детей с ДРБТ и при их ассоциации с лямблиозом установлено, что только у детей с ДРБТ относительно контрольных значений отмечается снижение активности НАДФГДГ (рис. 1а). В обеих группах больных статистически достоверно снижены уровни активности Г6ФДГ (рис. 1б), НАДФИЦДГ (рис. 1в).
На рис. 2 представлены уровни активности НАД-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови. Обнаружено статистически достоверное снижение активности Г3ФДГ (рис. 2а), ЛДГ (рис. 2б), МДГ (рис. 2в), НАДИЦДГ (рис. 2г) в обеих группах больных независимо от наличия лямблиоза. Уровень активность НАДН-ЛДГ в лимфоцитах крови относительно контроля статистически достоверно снижен только у больных с ДРБТ (рис. 2д).
7,0
5 6,0 0
0 5,0 0
ш 4,0
2
L_, 3,0
Е?
е 2,0
CI
1 1,0 0,0
Pi < 0,05
70,0
5
0 60,0 0
g 50,0
LU
| 40,0
Ej 30,0
0 20,0 cl
1 10,0
0,0
р1 < 0,01
р1 < 0,01
35,0 . 30,0
5
g 25,0
° 20,0 ш
S 15,0
L_~
L? 10,0
е
f? 5,0 0,0
р1 < 0,01
Р1 < 0,01
—
Рис. 1. Активность НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у детей с ДРБТ в зависимости от наличия лямблий: 1 - контроль; 2 - дети с ДРБТ; 3 - дети с ДРБТ в ассоциации с лямблиозом.
1
2
3
1
2
3
1
2
3
ш
*
2
1_”
С1
е
5.0
4.0
3.0
2.0 I- 1,0
0,0
50.0
Г 40,0
±2
0
о 30,0 0
т-
ш
2 20,0
1_"
С1 с 10,0
0,0
100.0
58°,° 0
§ 60,0 1
ш
2 40,0
С1 ^ 20,0
0,0
1 р-| < 0,05 р1 < 0,05 | . . .-ь . ч
р-1 < 0,05
р1 < 0,001
Р1< 0,05
Р1 < о ,0
^ ПИТ
30.0
25.0
20.0
15.0
10.0 5,0 0,0
Р1 < 0,05
Рис. 2. Активность НАД-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах у детей с ДРБТ в зависимости от наличия лямблий: 1 - контроль; 2 - дети с ДРБТ; 3 - дети с ДРБТ в ассоциации с лямблиозом.
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Исследуемые ферменты занимают ключевые позиции на разных метаболических путях клетки, которые в целом обеспечивают ее физиологические и функциональные потребности. Г6ФДГ является ключевым и инициализирующим ферментом пентозофосфатного цикла, продукты которого определяют широкий спектр реакций макромоле-кулярного синтеза [2, 8]. Следовательно, снижение активности данного фермента в лимфоцитах крови больных ДРБТ и ДРБТ в ассоциации с лямблиозом определяет ингибирование рибозо-5-фосфат- и НАДФН-зависимых пластических процессов. Г3ФДГ обеспечивает перенос продуктов катаболизма липидов на окислительно-восстановительные реакции гликолиза [2, 7]. Соответственно, снижение активности Г3ФДГ характеризует понижение уровня субстратного потока на окислительно-восстановительной стадии гликолиза.
Состояние цитоплазматического компартмен-та лимфоцитов у детей больных ДРБТ и ДРБТ в ассоциации с лямблиозом также характеризуется снижением активности аэробной реакции ЛДГ. При этом активность анаэробной реакции ЛДГ
снижена только при ДРБТ. Подобное состояние активности фермента позволяет сделать следующее заключение. В лимфоцитах крови детей с ДРБТ снижена интенсивность гликолиза и уровень окисления лактата до пирувата с последующим переносом последнего на реакции цикла трикарбо-новых кислот. В то же время при ДРБТ в ассоциации с лямблиозом в лимфоцитах крови активность терминальных реакций гликолиза соответствует уровню нормы.
Цикл трикарбоновых кислот является центральным метаболическим процессом, который объединяет углеводный, липидный и белковый обмены в клетках [9, 10]. Уровни активности исследуемых нами ферментов цикла трикарбоновых кислот — МДГ и НАДИЦДГ — у детей с ДРБТ и ДРБТ в ассоциации с лямблиозом снижены. Следовательно, интенсивность НАД-зависимого субстратного потока по циклу Кребса в лимфоцитах больных детей снижена. При этом необходимо отметить, что активность НАДФИЦДГ и НАДФГДГ при ДРБТ и ДРБТ в ассоциации с лямблиозом также снижены. Данные ферменты определяются как
вспомогательные, определяющие возможность поддержки субстратного потока по лимонному циклу с помощью НАДФ-зависимых реакций [2]. Соответственно, можно заключить, что интенсивность метаболических процессов, зависящих от состояния субстратного потока по циклу трикарбо-новых кислот, в лимфоцитах детей с ДРБТ и ДРБТ в ассоциации с лямблиозом снижена. В первую очередь это процесс аэробного дыхания, от состояния которого во многом зависит реактивность лимфоцитов [11]
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Исследование уровней активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов у детей с ДРБТ и ДРБТ в ассоциации с лямблиозом позволило обнаружить значительные изменения в системе внутриклеточного метаболизма. У детей с ДРБТ в лимфоцитах крови снижены уровни субстратного потока по терминальным реакциям гликолиза и цикла трикарбоновых кислот, что определяет ингибирование, соответственно, анаэробного и аэробного дыхания клеток. У детей с ДРБТ в ассоциации с лямблиозом установлено, что в лимфоцитах крови при сохранении интенсивности терминальных реакций анаэробного гликолиза на уровне нормы снижается активность ферментов, определяющих состояние аэробного дыхания. Независимо от наличия или отсутствия лямблиоза у детей с ДРБТ снижена активность пентозофосфатного цикла, что характеризует ингибирование соответствующих реакций ма-кромолекулярного синтеза. Подобное состояние метаболизма лимфоцитов у детей с ДРБТ и ДРБТ в ассоциации с лямблиозом, безусловно, будет отрицательно влиять на уровень реактивности клеток иммунной системы и тех компенсаторных и восстановительных процессов, которые связаны с функционально-регуляторным влиянием системы иммунитета.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баранов А.А., Щербаков П.Л. Актуальные вопросы детской гастроэнтерологии // Экспери-
ментальная и клиническая гастроэнтерология. — 2008. - № 1. - С. 102-106.
2. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. — М.: Медицина, 1998. — 704 с.
3. Запруднов А.М., Харитонова Л.А. Актуальные аспекты заболеваний билиарного тракта в детском возрасте // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. — 2010. — № 1. — С. 3 — 7.
4. Лямблиоз: Учебное пособие / Т.И. Авдюхи-на, Т.Н. Константинова, Т.В. Кучеря [и др.]. — М.: РМАПО, 2003. — С. 34.
5. Савченко А.А., Сунцова Л.И. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови биолюми-несцентным методом // Лабораторное дело. — 1989. — № 11. — С. 23 — 25.
6. Урсова Н.И. Дисфункциональные расстройства билиарного тракта у детей: клинические и фармакологические аспекты // Российский медицинский журнал. — 2003. — № 6. — С. 48 — 51.
7. Ikemoto A. Glycolysis and glutamate accumulation into synaptic vesicles. Role of glyceraldehydes phosphate dehydrogenase and 3-phosphoglycerate kinase // J. Biol. Chem. — 2003. — Vol. 278, N 8. — Р. 5929 — 5940.
8. Increase in glucose-6-phosphate dehydrogenase in adipocytes stimulates oxidative stress and inflammatory signals / I. Park, S.C. Choe, A.H. Choi [et al.] // Diabetes. — 2006. — Vol. 55. — P. 2939 — 2949.
9. Metabolomic analyses reveal profound differences in glycolytic and tricarboxylic acid cycle metabolism in glucose-responsive and -unresponsive clonal p-cell lines / P. Spegel, S. Malmgren, V.V. Sha-royko [et al.] // Biochem. J. — 2011. — Vol. 435, N 1. — P. 277 — 284.
10. Tricarboxylic acid cycle intermediate pool size: functional importance for oxidative metabolism in exercising human skeletal muscle / J.L. Bowtell, S. Marwood, M. Bruce [et al.] // Sports Med. — 2007. — Vol. 37, N 12. — P. 1071 — 1088.
11. Unal M., Erdem S., Deniz G. The effects of chronic aerobic and anaerobic exercises n lymphocyte subgroups // Acta Physiol. Hung. — 2005. — Vol. 92, N 2. — P. 163—171.
Сведения об авторах
Муравьева Наталья Георгиевна - аспирант Научно-исследовательского института медицинских проблем Севера СО РАМН (660022, Красноярск, ул. Партизана Железняка, 3Г; тел.: 8 (391) 212-52-63; e-mail: [email protected]) Савченко Андрей Анатольевич - доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории молекулярно-клеточной физиологии и патологии Научно-исследовательского института медицинских проблем Севера СО РАМН (660022, Красноярск, ул. Партизана Железняка, 3Г; тел.: 8 (391) 212-52-63; e-mail: [email protected])
МанчукВалерий Тимофеевич - доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, директор Научно-исследовательского института медицинских проблем Севера СО РАМН (660022, Красноярск, ул. Партизана Железняка, 3Г; тел.: 8 (391) 228-06-83; e-mail: [email protected])
