ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© КОЛЕНЧУКОВА О.А., САВЧЕНКО А.А., РОЖКОВА О.А., ЛУЗАН Н.А.
УДК 612.017.1:616.323-007.61 ОСОБЕННОСТИ СОСТОЯНИЯ ИММУННОГО СТАТУСА И УРОВНИ АКТИВНОСТИ НАД(Ф)-ЗАВИСИМЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ ЛИМФОЦИТОВ У ДЕТЕЙ С ХРОНИЧЕСКИМ АДЕНОИДИТОМ
О.А. Коленчукова, А.А. Савченко, О.А. Рожкова, Н.А. Лузан НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, директор - член.-корр.
В. Т. Манчук; лаборатория молекулярно-клеточной физиологии и патологии,
рук. - д.м.н., проф. А.А. Савченко;
Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П. Артюхов; кафедра физиологии им. проф. А.Т. Пшоника, зав. - д.м.н., проф. А.А. Савченко.
Резюме. Целью исследования явилось изучение особенностей иммунного статуса и метаболизма лимфоцитов у детей с хроническим аденоидитом. Установлено, что состояние иммунного статуса у детей с хроническим аденоидитом характеризуется повышением количества и функциональной активности В-лимфоцитов, а также увеличением содержания цитотоксических Т-лимфоцитов и ИК-клеток на фоне сниженного количества общих Т-лимфоцитов. Метаболизм лимфоцитов при хроническом аденоидите характеризуется низким уровнем анаэробного и аэробного дыхания, а также липидного анаболизма и субстратного взаимодействия цикла трикарбоновых кислот с реакциями аминокислотного обмена. Предполагается, что восстановление метаболического статуса лимфоцитов повысит реактивность клеток и определит благоприятный исход хронического воспалительного процесса.
Ключевые слова: иммунный статус, метаболизм, ферменты, лимфоциты, аденоидит.
Коленчукова Оксана Александровна - к.б.н., доц., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярно-клеточной физиологии и патологии НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН; e-mail: Kalina-chyikova@mail.ru.
Савченко Андрей Анатольевич - д.м.н., проф., зав. каф. физиологии им. проф. А. Т. Пшоника КрасГМУ, рук. лаб. молекулярно-клеточной физиологии и патологии НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН; е-mail: aasav-chenko@yandex.ru
Рожкова Олеся Анатольевна - младший научный сотрудник лаборатории молекулярно-клеточной физиологии и патологии НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН; тел.: 8(391) 2220209.
По данным ряда авторов, хронические аденоидиты (ХА) составляют 2056% от всех заболеваний верхних дыхательных путей. В возрасте от 3 до 14 лет хроническими аденоидитами страдает 4,3% детей. Несмотря на многочисленные работы по изучению хронического аденоидита, остаются актуальными проблемы выявления дефектов системного и местного иммунитета при хроническом воспалении глоточных миндалин [1,4,6].
Г лоточная миндалина лимфоэпителиального глоточного кольца в составе единой иммунной системы формирует иммунологическую резистентность организма. Основными функциями лимфоэпителиальных органов являются: барьерная функция, местный иммунитет, а также участие в системном иммунном ответе [1,6]. При этом только на основе знания механизмов, приводящих к различным изменениям иммунореактивности, возможно совершенствование диагностики и разработка адекватных методов терапии.
Состояние иммунной системы у больных хроническим аденоидитом изучалось многими авторами. Однако выявленные в этих исследованиях изменения в ту или иную сторону показателей иммунной системы является отражением состояния иммунной системы как системы гомеостаза и адаптогенеза [3,7].
Необходимо отметить важную роль метаболических процессов в клетках иммунной системы для обеспечения гомеостаза организма. Доказано, что метаболическая реакция лимфоцитов на воздействие антигена зависит от исходного уровня внутриклеточного обмена, который характеризуется активностью и соотношением энергетических и пластических процессов в клетках [3,4,11].
Таким образом, целью работы явилось исследование особенностей иммунного статуса и метаболизма лимфоцитов периферической крови у детей с хроническим аденоидитом.
Материалы и методы
Под наблюдением находилось 55 детей в возрасте 3 - 5 лет больных хроническим аденоидитом. Контрольную группу составили 53 практически здоровых детей аналогичного возрастного диапазона. Родители всех обследованных детей давали письменное информированное согласие на исследование.
Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов крови оценивали с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител к CD3, CD4, CD8, CD16, CD72 (ТОО «Сорбент», Москва). Для дополнительной характеристики Т-клеточного звена иммунной системы вычисляли соотношение CD4+/CD8+. Определение иммуноглобулинов А, М и G проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини [14]. Концентрацию циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли по общепринятой методике [10]. Состояние гуморального иммунитета характеризовали также уровнем относительного синтеза Ig A (Ig A/CD72+), Ig M (Ig МОТ72+) и Ig G (Ig G/CD72+) [2].
Определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови и лимфоидной ткани проводили биолюминесцентным методом [5]. Данным методом определялась активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), малик-фермента (НАДФМДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции лактатдегид-рогеназы (ЛДГ и НАДН-ЛДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции малатдегид-
рогеназы (МДГ и НАДН-МДГ), НАДФ- и НАДФН-зависимой глутаматдегид-рогеназы (НАДФГДГ и НАДФН-ГДГ), НАД- и НАДН-зависимой глутаматде-гидрогеназы (НАДГДГ и НАДН-ГДГ), НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратде-гидрогеназ (НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ, соответственно) и глутатионредуктазы (ГР). Активность дегидрогеназ в лимфоцитах крови выражали в ферментативных единицах (1 Е=1 мкмоль/мин [9]) на 104 клеток.
Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Ме) и ин-терквартильного размаха в виде 25 и 75 процентилей (С25 и С75). Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакета прикладных программ Statistica v. 7.0 (StatSoft, Inc., 2004).
Результаты и обсуждение
При исследовании состояния иммунного статуса у детей с хроническим аденоидитом обнаружено снижение абсолютного количества лимфоцитов, что, соответственно, и привело к статистически достоверному понижению абсолютного уровня CD3+-клеток (табл. 1). Кроме того, у детей с хроническим аденоидитом увеличивается процентное содержание CD8+-, CD16+- и CD72+-лимфоцитов, повышается концентрация Ig A и Ig G, а также увеличиваются уровни относительного синтеза всех основных классов иммуноглобулинов.
При определении уровней активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови у детей с хроническим аденоидитом установлено статистически достоверное снижение активности НАДФМДГ (0,18 мкЕ, 0,11-14,14 мкЕ; в контроле: 8,58 мкЕ, 0,41-29,86 мкЕ; р<0,001), НАДФИЦДГ (0,06 мкЕ, 0,0123,15 мкЕ; в контроле: 7,48 мкЕ, 1,15-39,87 мкЕ; р<0,001) и НАДФН-ГДГ (6,86 мкЕ, 0,41-34,08 мкЕ; в контроле: 21,05 мкЕ, 7,59-77,15 мкЕ; р<0,001) относительно контрольных диапазонов. Исследование уровней активности НАД-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови позволило обнаружить, что при хроническом аденоидите активность МДГ (рис. 1, а), НАДГДГ (рис. 1, б) и НАДИЦДГ (рис. 1, в) статистически значимо ниже, чем в лимфоци-
тах крови у детей контрольной группы. Кроме того, у детей с хроническим аденоидитом в лимфоцитах крови относительно контрольных уровней в 24,9 раза снижена активность НАДН-ЛДГ (рис. 1, г), в 7,0 раза - НАДН-МДГ (рис. 1, д) и в 14,3 раза - НАДН-ГДГ (рис. 1, е).
Исследуемые ферменты занимают ключевые позиции на разных метаболических путях клетки. Так, снижение активности анаэробной реакции ЛДГ и НАДН-зависимых реакции МДГ в лимфоцитах у детей больных хроническим аденоидитом может осуществляться за счет низкой активности анаэробного окисления глюкозы и, соответственно, пониженного уровня наработки НАДН в гликолизе [9,12]. В условиях аэробного гликолиза пируват поступает на цикл трикарбоновых кислот. В связи с этим, недостаточность терминальных реакций гликолиза соответственно определяет низкую активность НАДИЦДГ и МДГ -дегидрогеназ лимонного цикла [9,15]. Более того, при хроническом аденоидите в лимфоцитах крови также снижена активность НАДФИЦДГ - вспомогательной дегидрогеназной реакции цикла Кребса, значимость которой для поддержки субстратного потока повышается при высоком уровне НАДН в митохондриальном компартменте [13].
Цикл трикарбоновых кислот является центральным метаболическим процессом, который объединяет углеводный, липидный и белковый обмены [8,9]. Нами исследованы уровни активности НАД- и НАДФ-зависимых глутаматде-гидрогеназ, характеризующих взаимосвязь между лимонным циклом и реакциями аминокислотного обмена. Обнаружено, что при хроническом аденоидите в лимфоцитах крови снижены уровни активности НАД- и НАД(Ф)Н-зависимых реакций глутаматдегидрогеназ, что определяет низкий уровень субстратного обмена между данными метаболическими процессами. Низкая активность НАДФМДГ - фермента, осуществляющего шунтирование медленных реакций цикла Кребса и занимающего ключевое положение в системе липидного анаболизма [9], также влияет на пониженный уровень субстратного потока по циклу и определяет недостаточность синтеза липидов.
Таким образом, состояние иммунного статуса у детей с хроническим аде-ноидитом характеризуется повышением количества и функциональной активности В-лимфоцитов, а также увеличением содержания цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток на фоне сниженного количества общих Т-лимфоцитов. Метаболизм лимфоцитов крови при хроническом аденоидите характеризуется низким уровнем анаэробного и аэробного дыхания и снижением, липидного анаболизма и субстратного взаимодействия цикла трикарбоновых кислот с реакциями аминокислотного обмена. Можно предположить, что восстановление метаболического статуса лимфоцитов крови повысит реактивность клеток и определит благоприятный исход хронического воспалительного процесса.
Исследование выполнено при поддержке федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 20092013 годы, № НК-481 П.
CHARACTERISTICS OF IMMUNE STATUS AND LEVELS OF ACTIVITY NAD (P)-DEPENDENT DEHYDROGENASES LYMPHOCYTES IN CHILDREN WITH CHRONIC
ADENOIDITIS
O.A. Kolenchukova, A.A. Savchenko, O.A. Rozhkova, N.A. Luzan
Institute of Medical Problems of the North, Siberian Division, Russian Academy of Medical Sciences, Krasnoyarsk State Medical University named after prof. V.F.
Voyno-Yasenetsky.
Abstract. The aim of the study was to investigate the characteristics of the immune status and metabolism of lymphocytes in children with chronic adenoiditis. It is established that the state of the immune status of children with chronic adenoiditis is characterized by increasing the quantity and functional activity of B-lymphocytes, as well as increasing the content of cytotoxic
T-lymphocytes and NK-cells against a background of reduced number of total T-lymphocytes. The metabolism of lymphocytes in chronic adenoids is characterized by low levels of anaerobic and aerobic respiration, as well as lipid anabolism and substrate interactions with the citric acid cycle reactions of amino acid metabolism. It is assumed that the recovery of the metabolic status of the lymphocytes increases the
reactivity of the cells and determines the favorable result of the chronic inflammatory
process.
Key words: immune status, metabolism, enzymes, lymphocytes, adenoiditis.
Литература
1. Белова Е.В., Капустина Т. А., Манчук В. Т. и др. Эпидемиологическая и клинико-патогенетическая характеристика хронического аденоидита, ассоциированного с хламидийной инфекцией //Бюл. СО РАМН.-2008.-№ 1 .-С. 101105.
2. Земсков А.М., Земсков В.М. Дополнительные методы оценки иммунного статуса //Клинич. лабораторная диагностика .-1994.-№ 3.-С. 34-35.
3. Козлов В. А., Борисов А.Г., Смирнова С.В. и др. Практические аспекты диагностики и лечения иммунных нарушений: Руководство для врачей. -Новосибирск: Наука, 2009. -274 с.
4. Куртасова Л.М., Савченко А.А., Манчук В.Т. Метаболические аспекты иммунореабилитации детей с атопическими заболеваниями. -Новосибирск: Наука, 2006. -222 с.
5. Савченко А. А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови биолюминесцентным методом // Лабораторное дело. -1989. -№ 11. -С. 23-25.
6. Хасанов С.А., Бабаханов Г.К., Хасанов М.С. Совершенствование диагностики и хирургического лечения аденоидов у детей // Вестн. оториноларингологии. -2008. -№1. -С.55-57.
7. Ярилин А.А. Иммунология. -М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. -752 с.
8. Bowtell J.L., Marwood S., Bruce M. et al. Tricarboxylic acid cycle intermediate pool size: functional importance for oxidative metabolism in exercising human skeletal muscle // Sports Med. -2007. -Vol. 37, № 12. -P. 1071-1088.
9. Elliott W. Biochemistry and Molecular Biology. Second edition. -Oxford: University Press, 2001. -586 p.
10. Haskova V., Kaslik J., Riha J. et al. Simple method of circulating immune complex detection in human sera by polyethylene glycol precipitation // Z. Immuni-tatsforsch. Immunobiol. -1978. -Vol. 154, № 4. -P. 399-406.
11. Jacobs S.R., Rathmell J.C. Lymphocyte selection by starvation: glucose metabolism and cell death // Trends Immunol. -2006. -Vol. 27, № 1. -P. 4-7.
12. Jeong D.W., Cho I.T., Kim T.S. et al. Effects of lactate dehydrogenase suppression and glycerol-3-phosphate dehydrogenase overexpression on cellular metabolism // Mol. Cell. Biochem. -2009. -Vol. 284, № 1-2. -P. 1-8.
13. Kim S.Y., Park J.W. Modulation of hypoxia-inducible factor-1a expression by mitochondrial NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase // Biochimie. -2010. -Vol. 92, № 12. -P. 1908-19013.
14. Mancini G., Carbonaro A.O., Haremans J.F. Immunochemical quantitation of antigens by single radial diffusion // Immunochemistry. -1965. -Vol. 2, № 3. -P. 235-255.
15. Perez A., Centeno V.A., Tolosa de Talamoni N.G. Molecular mechanisms involved in the enhancement of mitochondrial malate dehydrogenase activity by calcitriol in chick intestine // Nutr. Biochem. -2010. -Vol. 21, № 12. -P. 12321237.
Таблица 1
Состояние иммунного статуса у больных хроническим аденоидитом
(Ме, С25~С75)
Показатели Контроль, n=73 ХА, n=76 Р
Me С25-С75 Me С25-С75
Лейкоциты, (109/л) 6,40 5,50-7,70 6,60 5,40-8,40
Лимфоциты, (%) 44,0 38,0-55,0 36,0 27,0-48,0
Лимфоциты, (109/л) 2,75 2,37-4,78 2,31 1,73-3,15 0,012
CD3+, (%) 60,5 57,0-67,0 62,0 54,5-70,0
CD3+, (109/л) 1,71 1,31-2,75 1,35 1,09-2,95 0,003
CD4+, (%) 32,0 26,0-39,0 34,5 30,0-40,0
CD4+, (109/л) 0,86 0,67-1,23 0,75 0,57-1,13
CD8+, (%) 22,0 18,0-26,0 28,5 23,5-33,0 <0,001
CD8+, (109/л) 0,56 0,41-0,83 0,65 0,45-0,93
CD16+, (%) 17,0 13,0-20,0 20,1 15,5-26,0 0,042
CD16+, (109/л) 0,51 0,34-0,72 0,50 0,27-0,68
CD72+, (%) 15,0 12,0-17,0 18,0 12,5-21,0 0,009
CD72+, (109/л) 0,45 0,32-0,56 0,36 0,25-0,61
CD4+/CD8+ 1,35 0,95-2,00 1,20 0,96-1,50
Ig A, (г/л) 0,70 0,51-1,04 2,52 0,91-3,03 <0,001
Ig M, (г/л) 1,52 1,21-2,01 1,43 1,04-2,01
Ig G, (г/л) 8,23 6,81-11,04 12,82 7,51-16,03 <0,001
Ig A/CD72+, (нг/клетку) 1,11 0,59-2,01 6,91 1,93-11,04 <0,001
Ig M/CD72+, (нг/клетку) 2,00 1,21-3,14 3,40 1,90-6,13 0,007
Ig G/CD72+, (нг/клетку) 17,93 11,24-37,05 32,71 19,92-61,02 0,006
ЦИК, (о.е.) 29,0 23,0-38,0 23,3 12,0-53,0
Активность НАДН-МДГ, мкЕ Активность НАДИЦДГ, мкЕ Активность МДГ, мкЕ
а.
б.
50.0
45.0
40.0
35.0
30.0
25.0
20.0
15.0
10.0 5,0 0,0
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0 1,0 0,0
р=0,012
Контроль
Хронический
аденоидит
в.
Контроль
Хронический
аденоидит
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0 1,0 0,0
р<0,001
р=0,003
160,0
140.0
120.0 100,0
80,0
60,0
40.0
20.0 0,0
Контроль
Хронический
аденоидит
г.
р=0,008
Контроль
Хронический
аденоидит
д.
200,0
180,0
160,0
140.0
120.0 100,0
80,0
60,0
40.0
20.0 0,0
р<0,001
N U =1
Контроль
Хронический
аденоидит
180,0
160,0
140.0
120.0 100,0
80,0
60,0
40.0
20.0 0,0
р<0,001
Контроль
Хронический
аденоидит
е
Рис. 1. Показатели активности НАД-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови у детей с хроническим аденоидитом.