CC BY
26МЕДИЦИНА. ПРИКЛАДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ
Особенности экспрессии HLA-DR в плаценте при развитии преэклампсии на фоне экстракорпорального оплодотворения с применением донорской яйцеклетки
Руденко Екатерина Евгеньевна,
аспирант, ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» E-mail: redikor2@yandex.ru
Коган Евгения Александровна,
доктор медицинских наук, профессор, ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» E-mail: koganevg@gmail.ru
Демура Татьяна Александровна,
профессор, ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» E-mail: uursula90@gmail.com
Трифонова Наталья Саятовна,
кандидат медицинских наук, доцент, ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» E-mail: trifonova.nataly@mail.ru
Жарков Николай Владимирович,
кандидат биологических наук, ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова»
E-mail: nickzharkov@mail.ru
Беременности, наступившие в результате применения ЭКО с донорскими ооцитами представляют интересную модель для изучения сложных иммунологических взаимодействий между плодом и беременной женщиной. Среди осложнений, развивающихся на фоне аллогенной беременности, большой процент занимают гипертензивные состояния, в частности, преэклампсия (ПЭ). Современный теории патогенеза ПЭ уделяют большое внимание иммунным механизмам и реакциям нарушения иммунологической толерантности в системе мать-плод. Данное исследование продемонстрировало формирование на фоне ПЭ иммунного повреждения структур плаценты, а также увеличение количества HLA-DR+ дендритных клетках в местах контакта материнских и плодовых тканей, что с одной стороны, подтверждает иммунные механизмы развития ПЭ, а с другой позволяет говорить об аллогенной беременности как о факторе риска развития ПЭ.
Ключевые слова: донорский ооцит, аллогенная беременность, дендритные клетки, HLA-DR, иммунологическая толерантность.
Введение
Беременности, наступившие в результате применения ЭКО с донорскими ооцитами являются уникальными, так как весь геном плода является полностью аллогенным для матери. Существуют две программы с донорскими ооцитами - суррогатное материнство (СМ) и донация ооцитов (ДО). Данные беременности представляют интересную модель для изучения сложных иммунологических взаимодействий между плодом и беременной женщиной. Несмотря на продолжающийся рост числа беременностей по программе донорства ооцитов, относительно мало известно о механизмах, лежащих в основе акушерских осложнений этих беременностей [1]. Среди них, большой процент занимают гипер-тензивные осложнения беременности, в частности, преэклампсия (ПЭ). Рядом авторов было показано, что частота развития ПЭ при донации ооцитов достигает 27,4% и 25,4% соответственно, а при суррогатном материнстве 6,4 и 7,6% соответственно^]. Возможно, высокий риск осложнений связан с нарушением иммунологической толерантности в системе мать-аллогенный плод.
Успех ЭКО с аллогенной яйцеклеткой напрямую связан с иммунологическими особенностями как материнского организма, так и переносимой бластоцисты [3]. В данном контексте представляет значительный интерес детектируемый рецептор HLA-DR+ на поверхности дендритных клеток, поскольку он отражает не только популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов, но и является «активационным» маркером, выражающим активный иммунный ответ на чужеродный антиген. По данным литературы, антигены HLA-DR, DQ и DP функционируют в генетическом ограничении иммунного ответа, подавлении функции CD8+-кле-ток, а также HLA-DR1 является маркером высокого уровня иммунных параметров патологии (E.H. Ба-раболова, 1994). HLA-DR+ клетки были идентифицированы в плаценте в трех областях: субэпителиальном слое амниона, децидуальной ткани и стро-ме ворсин хориона. Большинство дендритных клеток имеют характерную звездообразную форму за счет цитоплазматических выростов. В строме строме ворсин эти клетки можно отличить от клеток Гофбауэра (плацентарные макрофаги) по их морфологии, более выраженной экспресии HLA-
сз о
о Л о
о сз о в
в u
DR и отсутствию лизосомальной ферментативной активности [4]. Представляет особый интерес изучение степени экспресии HLA-DR в структурах плаценты на фоне аллогенной беременности, как показателя наряженности иммунных процессов в системе мать-плод.
Материалы и методы
В ряд морфологических исследований были включены 59 пациенток, среди них 39 пациенток, беременность которых наступила в результате ЭКО с донорской яйцеклеткой с развитием ПЭ тяжелой и средней степени тяжести (18 в программе суррогатного материнства и 21 в программе дона-ции ооцитов), в группу сравнения вошло 20 пациенток, беременность которых наступила в результате ЭКО с донорской яйцеклеткой без осложнений (8 в программе суррогатного материнства и 12 в программе донации ооцитов). Критериями включения в группу исследования стали: одноплодная беременность, родоразрешение в сроки гестации более 34 недель, отсутствие тяжелых экстрагени-тальных патологий, клинически подтвержденная ПЭ тяжелой степени или средней степени тяжести, а также осложнений беременности с хорошо изученным патогенезом (антифосфолипидный синдром, наследственные формы тромбофилии и т.д.) Морфологическое исследование выполнено на материале плацент (плацентарный диск), полученных после родоразрешения путем кесарева сечения или через естественные родовые пути.
Гистологическое исследование проводилось на парафиновых срезах плацент и плацентарного ложа, окрашенных гематоксилином и эозином.
Иммуногистохимическое исследование выполнялось на парафиновых срезах, изготовленных из материала плацентарного диска и плацентарного ложа. Иммуногистохимические реакции проводились на депарафинированных срезах толщиной 4-5 мкм, расположенных на стеклах, покрытых по-лилизиновым слоем (Menzel Gtaser Polylisine, Германия). Демаскировку п роводили в водяной бане с микропроцессором PT Module (Thermo Scientific, США). Для блокировки эндогенной пероксидазы стекла инкубировали в течение 10 минут с ингибитором пероксидазы, после чего срезы ополаскивали в фосфатном буфере (рН 7,0-7,6) и для блокирования неспецифических белковых взаимодействий инкубировали с Ultra-V-Block ^bVision, USA) в течение 30 минут. По окончании инкубации излишки реагента аккуратно стряхивали со стекол и наносили первичные антитела. В качестве первичных антител использовали мышиные антитела к общему цитокератину (клон AE1/AE3) (Dako, разведение 1:50) и мышиные антитела к HLA-DR (клон TAL.1B5), (Dako, разведение 1:50).
Срезы инкубировали с первичными антителами в течение 30 минут согласно предусмотренной фирмой производителем спецификации к антителу. После завершения инкубации срезы тщательно отмывали в фосфатном буфере (рН 7,0-7,6)
от первичных антител, не связавшихся с эпито-пами. Для выявления первичных антител, связавшихся с соответствующими антигенами, использовали универсальную полимерную систему Histofine® Simple Stain MAX PO (MULTI) (Nichirei, Япония). По окончании инкубации срезы ополаскивали в фосфатном буфере (рН 7,0-7,6). Для визуализации места связывания антитела с антигеном использовали реакцию окисления субстрата 3,3-диаминобензидина (ДАБ) пероксидазой хрена в присутствии перекиси водорода (N-Histofine® DAB-2V, Nichirei, Япония). Стекла дегидратировали в батарее, состоящей из дистиллированной воды, спиртах восходящей концентрации (70%, 80%, 95%, абсолютный спирт) и 3-х ксилолов. После чего срезы покрывали покровными стеклами с использованием синтетической среды BioMount.
При постановке иммуногистохимических реакций в обязательном порядке ставили положительные и отрицательные контроли. В качестве отрицательных контролей брали образцы исследуемых срезов, которые подвергались стандартной процедуре ИГХ исследования, но без инкубации с первичными антителами. Положительный контроль для каждого антитела отбирали в соответствии с рекомендациями производителя антител.
Положительной считалась выраженная цито-плазматическая экспрессия маркера HLA-DR дендритными клетками, количество которых подсчи-тывалось на 10 полей зрения.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием непараметрических методов оценки статистической значимости, ориентированных на сравнение двух или более выборок между собой, такие как Критерий X2. Для определения статистической значимости различий средних величин в случаях сравнения независимых выборок применялся t-критерий Стью-дента, из непараметрических методов применялся критерий Манна-Уитни Утверждение о различии сравниваемых выборок считалось справедливым, если вероятность составляла *р<0,05.
Результаты исследования
Изменения характерные для плацент при развитии преэклампсии были обнаружены как в исследуемых группах, так и в группе сравнения. К ним относились выраженные компенсаторно-приспособительные реакции (синцитиальные узелки, повышенная ка-пилляризация терминальных ворсин, гиперплазия синцитио-капиллярных мембран), а также признаки материнской мальперфузии (афункциональные зоны, ишемические инфаркты, диссоциированное развитие котиледонов, гипоплазия терминальных ворсин), наибольшую выраженность эти признаки имели в группе сравнения, т.е. симптомы преэклампсии в группе аллогенной ЭКО-СМ и ЭКО-ДО протекали на фоне более благополучного состояния плаценты. Для пациенток с преэклампсией тяжелой степени были характерны выраженные признаки декомпенсации плацентарных функций: резко вы-
раженные инвлютивно-дистрофические изменения (массивные отложения перивиллезного фибринои-да с формированием псевдоинфарктов, кальциноз, склероз ворсин, редукция кровеносных сосудов). Также нами были обнаружены признаки постплацентарной гипоксии, клинически соответствующие тяжелой преэклампсии в виде ангиоматоза терминальных ворсин, гиперплазии синцитальных узелков, а также утолщения синцитио-капиллярных мембран (изменения Tenny Parker).
Основным отличием плацент в группах исследования стала высокая выраженность иммунных поражений: лимфоплазмацитарный базальный децидуит, хронический париетальный децидуит, перивиллезный фибриноид с лимфо-гистиоцитар-ными клетками, виллит неизвестной этиологии и массивные отложения фибриноида в структурах плаценты. Было показано достоверное изменение указанных выше признаков для подгрупп с развитием ПЭ (табл. 1).
Таблица 1. Полуколичественная оценка выраженности воспалительных процессов структурах плаценты в группах СМ и ДО (U-критерий Манна-Уитни)
СМ норма n=18 ДО норма n=21 СМ ПЭ n=8 ДО ПЭ n=12
Лимфоплазмацитарный децидуит 1,54±0,66 1,67±0,78 2,25±0,96* 2,3±0,48*
Хронический париетальный децидуит 1,46±0,52 1,3±0,9 2,1±0,58* 2,6±0,53*
Перивиллезный фибриониод с ЛГИ 1,38±0,51 0,75±0,75 2,75±0,5* 1,8±0,79*
Виллит неизвестной этиологии 0,17±0,51 0,19±0,34 1,25±0,89* 1,0±0,95*
Массивные отложения фибриноида в маточно-плацен-тарной области 1,62±0,5 1,76±0,65 2,6±0,55* 2,8±0,92*
* Различия, статистически достоверные по сравнению с группами без ПЭ, р<0,05
В плацентах HLA-DR определялся в децидуаль-ной ткани, а также в строме ворсин. По данным литературы [3] дендритные клетки ворсин имеют плодовое происхождение. HLA-DR положительные клетки ворсин определялись как многоотро-осчатые клетки с крупным просветленным ядром, с диффузным коричневым цитоплазматических окрашиванием, располагающиеся в строме промежуточных ворсин. В терминальных ворсинах дендритные клетки не были определены. Также увеличенное количество дендритных клеток определялось в очагах перивиллезного фибри-ноида. В децидуальной ткани дендритные клетки располагались диффузно, с незначительной концентрацией в очагах нарушения целостности де-цидуа, участках кровоизлияний. Однако отличить дендритные клетки от резидентных макрофагов
в этой области весьма затруднительно. Было показано достоверное увеличение количества HLA-DR положительных клеток в группах с развитием ПЭ (табл. 2).
Таблица 2. Экспрессия HLA-DR в структурах плацент в группах СМ и ДО А-критерий Стьюдента)
СМ норма n=18 ДО норма n=21 СМ ПЭ n=8 ДО ПЭ n=12
HLA-DR+ден-дритные клетки ворсин 9.25±4.65 8.75±2.99 21.20±1.64* 19.80±4.32*
HLA-DR+ден-дритные клетки decidua basalis 21.00±1.87 22.6±1.82 31.4±2.07* 32.5±2.07*
* Различия, статистически достоверные по сравнению с группами без ПЭ, р<0,05
Наиболее тесное иммунологическое взаимодействие материнских и плодовых структур происходит на так называемом материнско-плодном интерфэйсе [5]. Его элементами являются базаль-ная пластинка (место контакта гравидарного эндометрия и колонн цитотрофобласта), ворсины (контакт синцитиотрофобласта и материнской крови), структуры плацентарного ложа (интерстициаль-ный и эндоваскулярный цитотрофобласт и материнские ткани). Наше исследование подтвердило данные литературы о значительном скоплении HLA-DR+ клеток в местах контакта материнских и плодовых тканей, что говорит о напряженности иммунологических процессов и развертывании реакции «отторжения трансплантаната. HLA-DR -один из антигенов МНС класса II, участвующих в презентации потенциально чужеродных антигенов, при иммунофенотипировании может быть использован в качестве маркёра активированных клеток и индикации реакций отторжения трансплантанта. HLA-DR экспрессируется антигенпре-зентирующими клетками, такими как дендритные клетки, макрофаги, В-лимфоциты, а также активированные Т-лимфоциты и клетки эндотелия. Исследование дендритных клеток в структурах плацент и плацентарных площадках показало, что ал-логенная беременность сопряжена с увеличением HLA-DR+ на материнско-плодном интерфэйсе при неосложненном течении беременности, что говорит о выраженном иммунном ответе материнского организма на плодовые антигены. При этом увеличение количества дендритных клеток в ворсинах может отражать процессы повреждения син-цитиотрофобласта, усиленные при аллогенной беременности, и нарушениие проницемости плацентарного барьера. При развитии ПЭ количество было показано достоверное увеличение количества дендритных клеток в плаценте и плацентарном ложе в подгруппах аллогенной беременности. При исследовании случаев с развитие тяжелой ПЭ в 2х случаях нами было обнаружено резкое уменьшение количества дендритных клеток в структу-
сэ о
о Л о
о сз о в
рах плацент (децидуальная ткань и ворсины), что может говорить о тяжелом повреждении плаценты и длительном и интенсивном иммунологическом напряжении, т.к. по данным некоторых исследований снижение количества HLA-DR+-клеток свидетельствовало не только о наличии хронического воспалительного процесса, но и могло отражать истощение данного пула, связанного с длительностью патологии, поскольку HLA-DR+ является маркером как поздней, так и длительной активации клеток. Современные концепции развития преэклампсии учитывают в первую очередь иммунологические нарушения в системе мать-плод[6], результаты проведенного исследования подтверждают нарушение иммунологической толерантности при развитии ПЭ на фоне аллогенной беременности.
Заключение
При развитии преэклампсии на фоне аллогенной беременности в программах суррогатного материнства и донации ооцитов происходит нарастание тяжести иммуно-воспалительных поражений плаценты и увеличение количества дендритных HLA-DR+ клеток в местах контакта материнских и плодовых тканей.
Литература
1. Трифонова Н.С, Жукова Э.В., Ищенко А.И., Александров Л.С. Суррогатное материнство. Исторический обзор, особенности течения беременности и родов. Российский вестник акушера-гинеколога. 2015;15:2:49-55. [Trifonova N.S., Zhukova E.V., Ishchenko A.I., Aleksandrov L.S. Surrogate motherhood: A historic review. The specific features of the course of pregnancy and labor. Rossiiskii vestnik akushera-ginekologa. 2015;15:2:49-55. (In Russ)]. doi:10.17116/rosakush201515249-55
2. Trifonova N.S., Zhukova E.V., Grineva A.M., Alexandrov L.S., Ishchenko A.I., Nikonov A.P., Soboleva V.V. Clinical features of the course of pregnancy, labor, delivery, and perinatal outcomes in women after in vitro fertilization using donor oocytes. Rossiiskii vestnik akushera-ginekologa. 2017; 1:46-52. (In Russ)]. doi: 10.17116/ rosakush201717146-52
3. Van der Hoorn M-L, Helmerhorst F., Claas F. Preeclampsia in non donor IVF and egg donation pregnancy: is there a different pathophysiology? Fertility and Sterility 2011;95(2):805 e1-3. doi. org/10.1016/j.trim.2011.06.004
4. Sutton L, Mason DY, Redman CW. HLA-DR positive cells in the human placenta. Immunology. 1983;49(1):103-112.
5. Kim CJ, Romero R, Kusanovic JP, et al. The frequency, clinical significance, and pathological features of chronic chorioamnionitis: a lesion associated with spontaneous preterm birth. Mod Pathol 2010;23:1000-11.
6. Le Bouteiller P, Pizzato N, Barakonyi A, Solier C. HLA-G, pre-eclampsia, immunity and vascular events. J Reprod Immunol 2003;59:219-234.
FEATURES OF HLA-DR EXPRESSION IN THE PLACENTA DURING THE DEVELOPMENT OF PREECLAMPSIA AGAINST THE BACKGROUND OF IN VITRO FERTILIZATION USING A DONOR EGG
Rudenko E.E., Kogan E.A., Demura T.A., Trifonova N.S., Zharkov N.V.
FGAOU VO "First Moscow State Medical University named after I.M. Sechenova"
Pregnancies resulting from the use of IVF with donor oocytes are an interesting model for studying complex immunological interactions between a fetus and a pregnant woman. Among the complications developing against the background of allogeneic pregnancy, a large percentage is occupied by hypertensive conditions, in particular, preeclampsia (PE). Modern theories of pathogenesis of PE pay great attention to the immune mechanisms and reactions of impaired immunological tolerance in the mother-fetus system. This study demonstrated the formation of immune damage to the placenta structures against the background of PE, as well as an increase in the number of HLA-DR + dendritic cells at the contact points of maternal and fetal tissues, which, on the one hand, confirms the immune mechanisms of PE development, and, on the other hand, allows talking about allogeneic pregnancy as risk factor for PE.
Keywords: donor oocyte, allogeneic pregnancy, dendritic cells, HLA-DR, immunological tolerance.
References
1. Trifonova N.S., Zhukova E.V., Ischenko A.I., Aleksandrov L.S. Surrogacy. Historical review, features of the course of pregnancy and childbirth. Russian Bulletin of the Obstetrician-Gynecologist. 2015; 15: 2: 49-55. [Trifonova N.S., Zhukova E.V., Ishchenko A.I., Aleksandrov L.S. Surrogate motherhood: A historic review. The specific features of the course of pregnancy and labor. Rossiiskii vestnik akushera-gine-kologa. 2015; 15: 2: 49-55. (In Russ)]. doi: 10.17116 / rosak-ush201515249-55
2. Trifonova N.S., Zhukova E.V., Grineva A.M., Alexandrov L.S., Ishchenko A.I., Nikonov A.P., Soboleva V.V. Clinical features of the course of pregnancy, labor, delivery, and perinatal outcomes in women after in vitro fertilization using donor oocytes. Rossiiskii vestnik akushera-ginekologa. 2017; 1: 46-52. (In Russ)]. doi: 10.17116 / rosakush201717146-52
3. Van der Hoorn M-L, Helmerhorst F., Claas F. Preeclampsia in non donor IVF and egg donation pregnancy: is there a different pathophysiology? Fertility and Sterility 2011; 95 (2): 805 e1-3. doi.org/10.1016/j.trim.2011.06.004
4. Sutton L, Mason DY, Redman CW. HLA-DR positive cells in the human placenta. Immunology 1983; 49 (1): 103-112.
5. Kim CJ, Romero R, Kusanovic JP, et al. The frequency, clinical significance, and pathological features of chronic chorioamnio-nitis: a lesion associated with spontaneous preterm birth. Mod Pathol 2010; 23: 1000-11.
6. Le Bouteiller P, Pizzato N, Barakonyi A, Solier C. HLA-G, pre-eclampsia, immunity and vascular events. J Reprod Immunol 2003; 59: 219-234.
e
u
