CC BY
26УДК 543.06 : 615.917
ОСОБЕННОСТИ АНАЛИЗА ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ОТРАВЛЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ, РЕАКТИВИРОВАННЫХ ИЗ СОСТАВА АДДУКТОВ С БЕЛКАМИ КРОВИ, ПРИ УСТАНОВЛЕНИИ ФАКТА ВОЗДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ
Н.Л. Корягина, Е.И.Савельева, Н.С. Хлебникова, В.А. Копейкин, В.Ю. Конева, А.С. Радилов
ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека.» ФМБА России, 188663, Ленинградская область, Всеволожский район, г.п Кузъшмовсхши Российская Федерация
Определение в образцах крови (плазмы, сыворотки) фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ) или их фторпроизводных, регенерированных из состава фосфилирован-ных аддуктов с белками крови действием фторид-иона, является общепризнанным методом установления факта воздействия ФОВ на организм человека. В настоящей работе показана возможность высокочувствительного определения ФОВ (зарин, зоман) и фторпроизводного российского VX-(RVX-G) путем оптимизации процедуры подготовки проб плазмы крови к анализу и использования газовой хроматографии в сочетании с высокоселективными детекторами. В анализе зомана успешно применен метод твердофазной микроэкстракции. Метод твердофазной экстракции полимерными сорбентами на основе сверхсшитого сополимера стирола и мета-крилата показал эффективность при анализе зомана, зарина и RVX-G. Продемонстрировано преимущество тандемной масс-спетрометрии и масс-спектрометрии высокого разрешения в детектировании ФОВ и их фторпроизводных, реактивированных из состава белковых аддуктов в плазме крови.
Ключевые слова: фосфорорганические отравляющие вещества, ретроспективный анализ, реактивирование, газовая хрома-то-масс-спектрометрия.
Введение. Чрезвычайно высокая токсичность ФОВ обусловлена их способностью ингибировать холинэстеразы (ХЭ), образуя ковалентные связи с серином. По своей природе и структуре ФОВ являются аналогами некоторых фосфорорганических пестицидов, однако многократно превосходят их по токсичности в силу ряда обстоятельств [1]:
• в отличие от пестицидов, ФОВ не должны трансформироваться in vivo, чтобы стать супертоксикантами - они априори таковыми являются;
• процесс спонтанного реактивирования ХЭ после интоксикации ФОВ протекает медленно и гораздо менее значителен,
чем в случае пестицидов;
• аддукты ФОВ с ХЭ подвержены «старению», что препятствует регенерации активных сайтов даже при воздействии таких эффективных реактивирующих агентов, как оксимы.
Возможные пути превращений ФОВ в живом организме представлены на рисунке 1.
Установление факта воздействия ФОВ на организм человека может быть ориентировано на 5 мишеней:
Ингибированные ацетилхолинэстераза (АХЭ) и бутирилхо-линэстераза (БХЭ). Свободные ФОВ.
Корягина Надежда Леонидовна (Koryagina Nadezhda Leonidovna), кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России, 188663, Ленинградская область, Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, koryagina@rihophe.ru
Савельева Елена Игоревна (Savelieva Elena Igorevna), доктор химических наук, заведующий лабораторией аналитической токсикологии ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России, 188663, Ленинградская область, Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский
Хлебникова Наталия Семеновна (Khlebnikova Nataliya Semenovna), кандидат химических наук, старший научный сотрудник ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России, 188663, Ленинградская область, Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский
Копейкин Владимир Александрович (Kopeikin Vladimir Aleksandrovich), кандидат химических наук, старший научный сотрудник ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России, 188663, Ленинградская область, Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский
Конева Вера Юрьевна (Koneva Vera Urievna), инженер ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России, 188663, Ленинградская область, Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский
Радилов Андрей Станиславович (Radilov Andrey Stanislavovich), доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом токсикологии, заместитель директора по научной работе ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России, 188663, Ленинградская область, Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, radilov@rihophe.ru
ИЮЛЬ - АВГУСТ 2014
ВЦСПШШЕЛНЗСП Cfnjl
[ЦМЩНК П1ДрС*|М 1Ч.1В О-цшлютилфа :фиилт и
<Х>В IHjiioi. ниш KVX>
Фмфн^ромя^в
ittCynlul
АУНПНЦПЙЛШККЩЙ»
Рис. 1. Пути превращения ФОВ в организме после интоксикации.
Продукты гидролиза ФОВ.
Фосфилированная БХЭ.
Фосфилированный сывороточный альбумин.
С первой мишенью преимущественно связаны биохимические методы измерения уровня ингибирования ХЭ крови. Эти методы отличаются простотой выполнения, доступностью и высокой чувствительностью, однако они неспецифичны в отношении действующего ОВ и неспособны надежно выявлять воздействие при уровнях ингибирования менее 20%. Кроме того, эти методы неприменимы в ретроспективном анализе в связи с синтезом ферментов de novo. Проблемой также является высокая вариабельность базового уровня активности ХЭ на популяционном уровне.
Продукты гидролитического пути метаболизма ФОВ - ал-килметилфосфоновые кислоты (АМФК) - образуются в большом количестве и активно выделяются с мочой в течение первых двух недель после интоксикации. Единственная метрологически аттестованная в РФ методика, используемая для установления факта воздействия ФОВ на организм, основана на определении продуктов их гидролиза в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [2]. В то же время, в соответствии с международными критериями, предъявляемыми к надежности идентификации биомаркеров ксенобиотиков в биопробах, а также в целях установления дозы экспозиции требуется разработка аналитических методов, ориентированных на определение всех возможных биомаркеров в различных диагностических средах (моча, кровь).
Для ретроспективного анализа необходимы долгоживущие биомаркеры, детектируемые в низких концентрациях и специфичные в отношении данного ОВ. Фосфилированная БХЭ сохраняется в организме в течение длительного времени и является хорошим объектом для ретроспективного анализа.
Воздействие ФОВ сопровождается быстрым образованием ковалентной связи между атомом фосфора молекулы ФОВ и активным сайтом серина ХЭ крови. При этом в случае интоксикации ОВ G-типа выделяется фторид-анион, табуном - цианогруппа, ОВ V-типа - тиольная группа. Образующийся аддукт - специфический биомаркер для данного типа ФОВ. При воздействии высоких доз (0,01-400 мкг/мл плазмы) ФОВ образуют аддукты и с другими белками плазмы (сыворотки) крови, в частности альбумином [3] или
R О
карбоксилэстеразой [4]. Супертоксичность ФОВ связана с инги-бированием АХЭ, однако, как уже отмечалось, БХЭ также образует аддукты с ФОВ в активном сайте серина, и данные аддукты в высоких концентрациях (в среднем 80 нМ) могут быть обнаружены в сыворотке и плазме крови человека, в то время как аддукты с АХЭ - только в следовых количествах в эритроцитах [5, 6]. Таким образом, наиболее благоприятным объектом для ретроспективного установления факта воздействия ФОВ на организм являются аддукты ФОВ с БХЭ в плазме крови. По данным [7], факт воздействия может быть установлен даже в случаях, когда степень инги-бирования БХЭ соствляет 1%. Так же как и аддукты ФОВ с АХЭ, аддукты с БХЭ подвержены «старению» и спонтанному реактивированию. Образование аддуктов в результате ингибирования холинэстераз ФОВ, а также разрушение аддуктов в процессе «старения» и спонтанного реактивирования показаны на рисунке 2.
По существу, старение является деалкилированием, происходящим вследствие разрыва связи О-алкил, что приводит к образованию аддуктов, не поддающихся реактивированию - ни индуцированному, ни спонтанному. В плане биохимического статуса это приводит к необратимому инактивированию фермента, в химико- аналитическом аспекте «состарившиеся» биоаддук-ты перестают быть селективными биомаркерами в отношении определенного ФОВ. Спонтанное реактивирование приводит к восстановлению функции фермента, что также мешает ретроспективному анализу. Кроме того, на результаты реактивирования большое влияние оказывает применение оксимной терапии [8, 9].
К настоящему времени опубликован ряд работ [10, 11, 12], в которых продемонстрировано успешное определение фрагмента ингибированной БХЭ - нонапептида, содержащего фосфильную группу, в том числе и деалкилированную в процессе старения, методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием.
Для целей химического анализа реактивирование БХЭ, инги-бированной ФОВ, как правило, проводится с помощью фторид-иона. Продуктами реактивирования ингибированной БХЭ при действии фторид-иона являются алкилметилфторфосфонаты. В случае зарина, циклозарина и зомана при действии фторид-иона на аддукты выделяются сами ОВ, в случае табуна и ОВ ^типа - фторангидриды соответствующих метилфосфоновых кислот [13]. Схема реактивирования представлена на рисунке 3.
Следует отметить, что, несмотря на существующие ограни-
Инп[б1ф0Бэнне
Н С
3
+ ROHtHT
ЕОН>
OR
Спошанис* рнкт&тБировзнис
Рис. 2. Взаимодействие ФОВ с холинэстеразами. ЕОН - АХЭ или БХЭ.
Деалкшшроваше С старение")
чения (в частности, «старение» аддуктов, спонтанное реактивирование фермента), реактивирование фторид-ионом считается в настоящее время классическим методом установления факта воздействия ФОВ, позволяющим детектировать воздействие на уровне ингибирования БХЭ < 0,1% и идентифицировать действующий агент. Кроме того, известно [14], что реактивированию подвержены ФОВ, связанные не только с ХЭ, но и с другими белками, что повышает аналитические возможности метода. В связи с этим работа над оптимизацией методов химического анализа регенерированных ОВ продолжается.
Целью настоящей работы был выбор оптимальной процедуры пробоподготовки и инструментального анализа для определения ФОВ, регенерированных из состава белковых аддуктов в плазме крови.
Материалы и методы исследования. Зоман (ГСО 8247-2003), зарин (ГСО 8246-2003), RVX (ГСО 8249-2004), бромоформ (CAS 75-25-2, Aldrich Cat.:241032), калий фтористый 2-водный (CAS 7789-23-3, ГОСТ 20848-75), ацетонитрил (ТУ 6-09-5497-91), ацетат натрия (ГОСТ 199-78), уксусная кислота (ГОСТ 19814-74), дихлорметан (Supelco, кат. № 1.06044.2500), этилацетат (ГОСТ 22300-76), картриджи для твердофазной экстракции (ТФЭ) OASIS HLB, 60 мг фирмы Waters, кат. № WAT094226, картриджи для ТФЭ Supelclean L^18, 500 мг фирмы Supelco, № 57012, устройство для проведения ТФЭ «Манифолд» (Supelco, кат. № 57030-U).
Комплекс приспособлений для твердофазной микроэкстракции (ТФМЭ), включающий штатив, платформу для термостати-рования и перемешивания, держатель для фиксирования микроволокон, Supelco, кат. № 57333-U; микроволокна Carboxen/PDMS 75 цт (Supelco # 57344-U), Polyacrylate Coating 85um (Supelco # 57304-U), Carboxen/PDMS StableFlex 85 цт (Supelco # 57334-U).
Ацетатно-буферный раствор pH 3,2 готовили смешиванием
BuChE Scr19S -wv-BuChe
ÛJJM KF
-P—-OR
hxhJ—<
CH
OR
И- «nur
Рис. 3. Реактивирование БХЭ, ингибированной ФОВ, с помощью фторид-иона.
■ Иижчениг Tí-Э или ЯЫ 3 ■í»im ГХ-ЛФД iSMOSri ГХ-MCÏÏC ГХ-МЦчг)
0,189 М уксусной кислоты и 10,8ц М ацетата натрия.
Раствор фтористого калия 5,25 М готовили растворением в дистиллированной воде навески 49,5 г двугидрата фтористого калия в мерной колбе вместимостью 100 см3.
Оборудование и условия проведения газохроматографическо-го анализа
Исследования проводили методом ГХ в разных вариантах детектирования: пламенно-фотометрический детектор (ПФД); масс-спектрометрические детекторы: низкое разрешение (МСНР), высокое разрешение (МСВР), тандемное детектирование (МС/МС) с использованием капиллярной кварцевой колонки HP-5MS - 60мх0,25ммх0,25мкм с привитой неподвижной фазой (5% фенил, 95% диметилполисилоксан) ^ире1со, код по каталогу 1909^-436).
Работа выполнена на следующих приборных комплексах:
• газовый хроматограф с пламенно-фотометрическим детектором (ГХ-ПФД) Agilent 7890А. Условия ГХ анализа: температура испарителя 250°С; ввод пробы без деления потока (0,75 мин); температурная программа: 40°С (5мин) - 10°С/мин - 150°С - 30°С/ мин - 280°С (10 мин); газ-носитель азот, расход газа-носителя через колонку 1 см3/мин. Температура детектора 200°С, расход водорода 75 мл/мин, воздуха - 100 мл/мин;
• газовый хроматограф-масс-спектрометр низкого разрешения GCMS-QP2010 (Shimadzu), программное обеспечение GCMS solution. Условия ГХ-МС анализа: температура испарителя 250°С; ввод пробы без деления потока (0,5 мин); температурная программа: 40°С (1мин) - 10°С/мин - 280°С (10 мин); газ-носитель гелий, расход газа-носителя через колонку 1 см3/мин. Температура интерфейса и детектора 270 и 200°С, соответственно. Съемку масс-хроматограмм проводили в режиме СИД по m/z 99, 125, 126, 128;
• газовый хроматограф-масс-спектрометр высокого разрешения Thermo DFS, программное обеспечение Xcalibur 2.0. Условия ГХ-МС анализа: температура испарителя 250°С; ввод пробы без деления потока (0,75 мин); температура интерфейса и источника 280 и 300°С, соответственно. Газ-носитель гелий, расход газа-носителя через колонку 1 мм3/мин; температурная программа: 40°С (4 мин) - 10°С/мин - 280°С. Параметры электрического сканирования: калибровочный стандарт - перфтортретбутиламин (калибровки шкалы масс - 113,9961 и 175,9929; разрешение (на высоте 5%) - 6440); скорость сканирования - 1 сек/декаду; длительность цикла сканирования - 0,5 сек; ширина окна захвата - 0,1 amu; диапазон перемещения окна - m/z ± 0,3 amu. Режим сканирования
- СИД по m/z 99.00057, 125.01619, 126.02405, с 2,5 мин до 15 мин;
• газовый хромато-масс-спектрометрометрический комплекс фирмы «Agilent» (США), хроматограф модель 7890 А и масс-се-лективный детектор с тройным квадруполем фирмы «Agilent», модель 7000; программное обеспечение Masshunter (условия ГХ-МС/МС анализа: температура испарителя 250°С; ввод пробы без деления потока (1,0 мин); температурная программа: 40°С (1мин)
- 10°С/мин-250°С (2 мин), post-run280°C (5 мин); газ-носитель гелий, расход газа-носителя через колонку 1 см3/мин; температура интерфейса 280°С; температура источника ионов 150°С; температура масс-фильтра 150°С; скорость потока газов в ячейку столкновений азота 1,5 см3/мин; гелия 2,25 см3/мин; ток эмиссии на фила-менте 200 мкА; напряжение на умножителе (Gain Factor) 10; время задержки растворителя 3 мин. Детектирование осуществлялось в режиме мониторинга множественных реакций: (99 81(15эВ); 125 99 (5эВ), 126 82 (5эВ), 112 67 (15 эВ).
Пробоподготовка с использованием метода ТФМЭ
В виалу с плоским дном вместимостью 4 мл, содержащую 1 см3 плазмы крови, добавляли 2,5 см3 ацетатного буфера (рН 3,2), 0,17 см3 раствора фтористого калия (5,25 М).
Микроволокно 50/30 DVB Carboxen/PDMS StableFlex 30 минут кондиционировали в инжекторе хроматографа при 280°С, 60 минут при 20°С, при постоянном перемешивании выдерживали в пробе. Термодесорбцию уловленных соединений проводили в инжекторе хроматографа при указанных выше условиях ГХ-МС анализа.
Пробоподготовка с использованием метода ТФЭ
В пластиковую пробирку (эппендорф) вместимостью 2 мл, со-
держащую 0,5 мл плазмы крови, добавляли 1,2 мл 0,2 М ацетатного буфера (рН 3,5) и 0,2 мл раствора фтористого калия (5,25 М). Пробу выдерживали в течение 30 мин в термостате при 32±2°С, центрифугировали 15 мин при 14000 об/мин. Сорбент Oasis HLB (60 г) кондиционировали 1 мл метанола и 1 мл деионизованной воды. Подготовленный образец биопробы пропускали через сорбент со скоростью 1 капля/с. Затем сорбент сушили под слабым вакуумом в течение 15 мин. Элюирование целевого вещества проводили хлористым метиленом (3х0,5 мл). Элюат собирали в виалу с коническим дном вместимостью 2,0 мл через воронку с сульфатом натрия и затем концентрировали в токе азота до 100 мкл. 0,001 мл экстракта подвергали ГХ анализу.
Обсуждение результатов. Факторами, определяющими эффективность процедуры реактивирования, являются кислотность среды, концентрация фторид-иона и метод извлечения регенерированных ОВ из биопробы. Авторы [15] отмечают, что для реактивирования ФОВ оптимальным является рН 4, однако, из-за высокой концентрации фторида калия (< 2М KF, рН > 7) поддерживать рН на этом уровне достаточно сложно. Авторы [15] предлагают предварительно смешивать раствор KF с ацетатным буфером и только затем эту смесь вносить в анализируемую плазму. При таких условиях наблюдается максимальная гидролитическая стабильность регенерированных фторфосфо-натов и минимальная скорость реингибирования фторфосфо-натами. К сожалению, скорость «старения» также максимальна при этих условиях, хотя скорость «старения» ингибированных БХЭ меньше, чем скорость старения ингибированных АХЭ. Следует отметить, что не менее важной является стадия выделения, очистки и концентрирования регенерированных фторфосфона-тов из плазмы крови. В настоящих исследованиях для извлечения ФОВ из биопроб применяли методы ТФМЭ и ТФЭ.
Определение регенерированных ФОВ методом ГХ в сочетании с ТФМЭ
Опыт применения ТФМЭ для концентрирования и ввода пробы в хроматограф описан только для зомана и лишь в одном из доступных источников [16].
Метод ТФМЭ основан на сорбционном извлечении аналита из жидкой или газообразной пробы на микроволокне, представляющем собой жидкий или твёрдый сорбент, нанесённый на микропористый носитель, с последующей десорбцией аналита в инжекторе хроматографа. В отличие от некоторых родственных технологий, ТФМЭ на микроволокне предоставляет уникальную возможность экспериментировать с различными типами микроволокон, отличающихся химической природой сорбирующей фазы и размерами микропор. Эффективность того или иного микроволокна для определения конкретных органических соединений в значительной степени зависит от качественного и количественного состава анализируемой пробы в целом. Большое значение имеет уровень фонового сигнала в ГХМС анализе, который очень высок в случае полярных микроволокон (Carbowax, Polyacrylate). Кроме того, анализируемые вещества конкурируют между собой и с матричными компонентами в процессе сорбции. Итоговый результат этих процессов заранее непредсказуем и может быть получен лишь в эксперименте с реальными пробами. В рамках настоящих исследований для извлечения зарина и зомана была протестирована эффективность 5 типов коммерчески доступных микроволокон различной полярности: 85цт Carboxen/PD-MS StableFlex, 50/30 цт DVB Carboxen/PDMS StableFlex, 70 цт
Carbowax DVB, 85 цт Polyacrylate, 100 цт PDMS. Как следует из рисунка 4, для извлечения зомана из водной среды при рН 3,5 оптимальным является микроволокно 50/30um DVB/ Carboxen/ PDMS StableFlex, в то время как для зарина применение данного метода на уровне микроконцентраций пока не обеспечено селективным микроволокном.
После выбора эффективного микроволокна были подобраны экспериментально остальные параметры метода ГХМС-ТФМЭ на образцах, полученных в опыте in vitro. Процедура ГХМС-ТФ-МЭ была апробирована на образцах плазмы крови крыс, экспонированных подкожно зоманом дозой 0,045 мг/кг (% ЛД50). Результаты исследований, представленные на рисунке 5, получены при анализе аликвотных частей одной пробы на каждую точку отбора - одну аликвоту анализировали без добавки фторида калия, другую - с добавкой. В пробе без добавки фторида калия определяли интактный зоман и получаемый в результате спонтанного реактивирования, в пробе с добавкой фторида калия -еще и зоман, регенерированный избытком фторид иона из состава аддуктов.
Методика ТФМЭ-ГХМС позволила детектировать свободный зоман, а также суммарно свободный и полученный в результате реактивирования в плазме крови в течение 48 часов после отравления крыс зоманом дозой 0,045 мг/кг. Предел обнаружения разработанной процедуры составил 0,5 нг/мл.
Несмотря на привлекательность использования для пробопод-готовки метода ТФМЭ, отличающегося меньшей трудоемкостью и позволяющего снизить матричный эффект, в наших дальнейших исследованиях предпочтение было отдано методу ТФЭ. В сравнении с методом ТФМЭ, метод ТФЭ оказался эффективным не только в отношении зомана, но и зарина и RVX, что позволило разработать универсальную методику определения ФОВ, реактивированных из состава белковых аддуктов. Метод ТФЭ позволил анализировать не только плазму крови, но и цельную кровь.
Определениерегенерированных ФОВ методом ГХ в сочетании с ТФЭ
В работах [7,17] реактивированные ОВ извлекали на картриджах с силикагелем C18. Абсолютный предел детектирования VX-G был оценен как 10,5 пг. В работе картриджи [7] с силика-гелем-С18 были заменены на картриджи с полимерным сорбентом (сверхсшитый сополимер стирола и метакрилата, картриджи Nexus, Varian). При этом пределы детектирования методом ГХ-МС(НР) составили 10 пг/мл для VX-G и 6 пг/мл для зарина, методом ГХ-МС(ВР) - 6 пг/мл для зарина, 3 пг/мл для VX-G, 17 пг/мл для циклогексилзарина и 11 пг/мл для фтортабуна.
Эффективность гидрофильно-липофильного сбалансированного обращенно-фазного сорбента Oasis HLB и силикагеля, модифицированного октадецильными группами С18, в рамках настоящей работы оценивали путем анализа образцов плазмы крови человека, экспонированной in vitro зарином, зоманом и RVX. Как следует из данных, представленных на рисунке 6, наиболее эффективным сорбентом оказался Oasis HLB.
Разработанная процедура была апробирована при анализе образцов биопроб, полученных в опытах in vrn. На рисунке 7 представлена диаграмма, иллюстрирующая изменение содержания реактивированного зомана в цельной крови и плазме, полученной в опыте in vivo через 1 сутки после введения крысам подкожно зомана в дозах 4, 8 и 16 мкг/кг.
Проведенные исследования показали, что для установления
факта воздействия зомана на организм по результатам анализа биосред предпочтительной матрицей является плазма крови. В то же время следует отметить, что в случае, когда нет возможности приготовить плазму сразу после отбора и цельную кровь приходится замораживать, или при летальных отравлениях, объектом анализа становится гемолизованная кровь. Важно отметить, что в доступных источниках мы не обнаружили примеров использования цельной и гемолизованной крови в качестве объектов анализа при обнаружении и идентификации метаболитов ФОВ. В наших экспериментах предел обнаружения зарина и зомана методом ГХМС/МС - ТФЭ в плазме крови составил 0,5 нг/мл, в цельной крови - 5,0 нг/мл.
Сравнительный анализ эффективности различных видов масс-спектрометрического детектирования для определения регенерированных ФОВ в плазме крови.
В таблице представлены результаты анализа плазмы крови, экспонированной in vitro ФОВ, методом ГХ в сочетании с ТФЭ с использованием разных способов детектирования.
Сравнение различных способов детектирования при определении ФОВ методом газовой хроматографии (ГХ) показало, что использование пламенно-фотометрического детектирования возможно, однако, в условиях анализа биопроб нельзя использовать для однозначной идентификации только один критерий - время удерживания. В ряду исследованных ФОВ зоман является самым высококипящим веществом, время выхода которого с хромато-графической колонки совпадает со временем выхода матричных компонентов. Пик зомана был перекрыт пиком матричного компонента в рамках метода ГХ-МС(НР), в случае высокого разрешения по m/z 126.02405 был размыт передний фронт хромато-графического пика (рис. 8а). Хроматографические пики гауссовой формы были получены по m/z 99.00056 [ГХ-МС(ВР)], a также методом ГХ-МС/МС (рис. 8,9).
Для определения зарина оказались пригодными все способы детектирования, но лучшие результаты были получены при реализации методов ГХ-МС(ВР) и ГХ-МС/МС с электронной ионизацией. Метод ГХ-МС/МС обеспечивает высокую точность и стабильность показаний в широком диапазоне измерений в течение длительного срока. В настоящее время приборы ГХ-МС/МС широко распространены в лабораторной практике, внесены в Федеральный реестр средств измерений, достаточно просты в обслуживании.
Метод ГХ-МС(ВР) позволяет проводить сверхвысокочувствительный и специфичный целевой анализ, дающий достаточную информацию для достоверной идентификации определяемого вещества. К ограничениям метода ГХ-МС(ВР) следует отнести высокую стоимость оборудования, сложности настройки прибора при детектировании легких масс, быстрое загрязнение ионного источника матричными компонентами. Метод ГХ-МС(ВР) может рассматриваться как метод арбитражного анализа для подтверждения результатов, полученных методом ГХ-МС/МС.
Заключение. Оптимальным подходом к анализу ФОВ (зарин, зоман) и фтор-производного RVX, регенерированных из состава фосфилированных аддуктов с белками крови действием фторид-иона, является использование для пробоподготовки метода твердофазной экстракции на полимерном сорбенте Oasis HLB и инструментальный анализ с использованием газовой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спетрометрией и масс-спектрометрией высокого разрешения в режиме электронной ионизации. Разработанная процедура пригодна как для анализа образцов плазмы крови, так и цельной крови на уровнях концентраций 0,5 и 5,0 нг/мл, соответственно.
ш
•Эф-
N14 BVB fW иге FDM4 um fo иге СоФеипи »Ь ЦП!
tprfKninrt"!)«» birt№i4iirf"t»i3 íHOtti*"!»
ÜUHlttlE Subllfltl
Гип ынкровапоння
Рис. 4. Эффективность различных микроволокон для извлечения зомана и зарина из водных сред.
Благодарности
Авторы выражают благодарность кандидату химических наук Уколову А.И., старшему научному сотруднику Густылевой Л.К., научному сотруднику Сорокоумову П.Н. за помощь при проведении анализов методами ГХ-МС/МС и ГХ-ПФД; доктору биологических наук Гончарову Н.В. и кандидату биологических наук Войтенко Н.Г. за постановку и проведение токсикологических экспериментов на лабораторных животных. Работа выполнена в рамках государственного контракта по заказу ФМБА России.
4 <
i §
-^Свободный
i Реактивированный
J
б 24 48
время после интоксикации, час
Рис. 5. Динамика изменения содержания зомана в пробах плазмы крови во времени. Доза 0,045 мг/кг ЛД50).
2,0
I td
5 1,2
i ад
8 0,3
И" 0,6
а,4
0,0
14'
:r
— i-.
d i. 1 I
* Oti Ш Щ л Л
__ ш ШМ
Q0ASS воз
IdpHH
HVX 40 В
Рис. 6. Эффективность сорбентов OASIS HLB и С18 для извлечения ФОВ из плазмы крови.
Рис. 7. Диаграмма, иллюстрирующая изменение содержания реактивированного зомана в цельной крови и плазме, полученной в опыте in vivo через 1 сутки после подкожного введения крысам зомана.
Trvit-M
9 Ifli ИЗ Н» il«« К: 18,Т»
тТ* ч егл»«* [
bt«niltf I "л™ ТЬ"», Им» IMi»
Л.OODii 1HU.I lie.SO 'в. в» Ci Мл fi fi
Ш.ЦИО! 735J.D «Д1 Iji.lHltl ■а. оо гччигч:
Рис. 8. ГХ-МС(ВР) хроматограмма образца плазмы крови с внесением 3 нг/мл зомана.
tt'l HI ■ f| 4 ^ 9 l/j Ч. 41 It М 41 kH 41 HI 4 VP ЩЛ Wl
Рис. 9. ГХ-МС/МС хроматограмма образца плазмы крови с внесением 3 нг/мл зомана.
Таблица
Результаты определения реактивированных ФОВ в плазме крови методом ГХ с использованием
разных способов детектирования
Соотношение сигнал:шум
в плазму крови ГХ-ПФД ГХ-МС(НР) ГХ-МС(ВР) ГХ-МС/МС
Зоман (1,0 нг/мл) 5 <5 113 7
Зарин (0,5 нг/мл) 54 60 1209 600
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ/ REFERENCES:
1. Worek F., Koller M., Thiemann H., Szinicz L. Diagnostic aspects of organophosphate poisoning. Toxicology. 2005, 214: 182-189.
2. Каракашев Г.В., Криворотова Н.В., Морозова Т.Е., Корягина Н.Л., Савельева Е.И., Копейкин ВА. Методика измерений массовых концентраций О-алкилметилфосфонатов в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-селективным детектированием. Свидетельство об аттестации № 222.0183/01.00258/ /2012 от 02.08.2012. ФР.1.39.2012.13710 / Karakashev
G.V., Krivorotova N.V, Morozova T.E., Koryagina N.L., Savel'eva E.I., Kopeykin VA. Procedure for the Determination of Mass Concentrations of 0-Alkyl Methyl Phosphonates in Urine by High-Performance Liquid Chromatography with Tandem Mass -Selective Detection. Certificate of Attestation N 222.0183/01.00258//2012, August 02.08.2012, FR.1.39.2012.13710 (in Russian).
3. Black R.M., Harrison J.M., and Read R.W. The interaction of sarin and soman with plasma proteins: the identification of a novel phosphonylation site. Arch Toxicol. 1999, 73:123-126.
4. De Jong L.P., Van Dijk C. Formation of soman (1, 2, 2-trimethylpropyl
methylphosphonofluoridate) via fluoride-induced reactivation of soman-inhibited aliesterase in rat plasma. Biochem Pharmacol. 1984, 33: 663-669.
5. De Bischop H.C.J.V, Meeleer WA.P.D., Willems J.L. Stereoselective Phosphonylation of Human Serum Proteins by Soman. Biochem. Pharmacol. 1987, 36: 3587-3591.
6. Myers D.K. Studies on Cholinesterase. Determination of the Molar Concentration of Pseudo-cholinesterase in Serum. Biochem. J. 1952, 51: 303-311.
7. Degenhardt C.EA.M., Pleijsier K., van der Schans M.J., Jan P. Langenberg, Kerry E. Preston, Maria I. Solano, VL. Maggio, John R. Barr. Improvements of the Fluoride Reactivation Method for the Verification of Nerve Agent Exposure. J. Anal. Toxicol. 2004, 28: 364-371.
8. Kuca K. , Patocka J. R. A new group of Monoquaternary Reactivators of Acetylcholinesterase Inhibited by Nerve Agents. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2004, 19: 39-43.
9. Bartosova L., Kuca K., Jun D., Kunesova G. Bispyridinium oximes as antidotal treatment of cyclosarin poisoning-in vitro and in vivo testing. Int. J. Toxicol. 2005b, 24: 299-402.
10. Abney C. W., Knaack J. L. S.; Ali A. A. I., Johnson R. C. Novel dual-mode
immunomagnetic method for studying reactivation of nerve agent-inhibited butyrylcholinesterase. Chem. Res. Toxicol. 2013, 26: 775-782.
11. Sporty Jennifer L. S.; Lemire Sharon W., Jakubowski EdwardM., Renner Julie A., Evans RonaldA., Williams Robert F., Schmidt Jurgen G., Van der SchansM. J., Noort D., Johnson Rudolph. Immunomagnetic separation and quantification of butyrylcholinesterase nerve agent adducts in human serum. Anal. Chem. 2010: 82, 6593-6600.
12. Aryal U. K., Lin C.-T., Kim J.-S., Heibeck T. H., Wang Jun, Qian W.- J., Lin Yuehe. Identification of phosphorylated butyrylcholinesterase in human plasma using immunoaffinity purification and mass spectrometry. Anal. Chim. Acta., 2012: 723, 68-75.
13. Noort D., Benschop H.P., Black R. Biomonitoring of Exposure to Chemical Warfare Agents: A Review. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2002, 184: 116-126.
14. Holland K. E., Solano K. E., Johnson R. C., Maggio V. L., Barr J. R. Modifications to the Organophosphorus Nerve Agent-Protein Adduct Refluoridation Method for Retrospective Analysis of Nerve Agent Exposures. J. Anal. Toxicol. 2008, 32: 116-124.
15. Van der Schans M.J., Polhuijs M., Van
Dijk C., Caria E.A., Degenhardt C.EA.M., Pleijsier K., Jan P.Langenberg, Benschop H.P. Retrospective detection of exposure to nerve agents: analysis of phosphofluoridates originating from fluoride-induced reactivation of phosphylated BuChE. Arch. Toxicol. 2004, 78: 508-524.
16. Logue BA., Capacio B.R., Newberry J.M. Determination of soman in plasma by solidphase microextraction gaschromatography mass spectrometry following fluoride reactivation In: Abstracts of Papers. PITTCON 2006, Orlando, FL, 2006; 2100-2111. Available at: http://www. pittcon.org.
17. Jakubowski E.M., Heykamp L.S., Durst H.D., Thomson S.A. Preliminary Studies in the Formation of Ethyl Methylphosphonofluoridate from Rat and Human Serum Exposed to Vx and Treated with Fluoride Ion. Anal. Lett. 2001, 34: 727-737.
N.L. Koryagina, E. I. Savelieva, N. S. Khlebnikova, VA. Kopeikin, VU. Koneva, A.S. Radilov
ANALYSIS FEATURES OF ORGANOPHOPHORUS NERVE AGENTS REACTIVATED FROM BLOOD PROTEIN ADDUCTS
while identifying EXPOSURE TO CHEMICAL WEAPONS
Federal State Unitaiy Enterprise, «Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology» under Federal Medical Biological Agency, 188663 settlement Kuz'molovsky, Vsevolozhsky District, Leningrad Region, Russian
The detection of nerve agents or their fluorine derivatives, reactivated from phosphorylated adducts in blood (plasma, serum) with blood proteins using fluoride ion action, is a commonly recognized method to identify human exposure to nerve agents. In the present work, a highly sensitive detection of sarin and soman, as well as fluorine derivative of Russian VX (RVX-G) was obtained by optimization of sample preparation procedures and use of gas chromatography with high selective detectors. Solid-phase micro extraction was successfully used in the soman analysis. Solid-phase extraction with a highly cross-linked styrene and methacrylate copolymers was found effective in the analysis of soman, sarin, and RVX-G. Advantages of tandem mass spectrometry and high-resolution mass spectrometry in the detection of nerve agents and their fluorine derivatives reactivated from blood protein adducts were demonstrated.
Key words: organophosphorous nerve agents, retrospective analysis, reactivation, gas chromatography-mass spectrometry.
Материал поступил в редакцию 03.06.2014 г
