CC BY
47
DOI: 10.24411/2074-5036-2019-10024 УДК 636.082.
Ключевые слова: крупный рогатый скот, иммуногенетика, группы крови, иммунизация, абсорбция, эллюция Key words: cattle, immunogenetics, blood groups, immunization, absorption, elution
Шаталина О.С.
ОСНОВЫ ПРОИЗВОДСТВА МОНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК - РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
FUNDAMENTALS OF PRODUCTION OF MONOSPECIFIC SERA - REAGENTS FOR THE PERFORMANCE OF IMMUNOGENETIC STUDIES
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук» Адрес: 620061, Россия, г. Екатеринбург, пос. Исток, ул. Главная, 21 Federal state budgetary scientific institution «Ural federal agrarian scientific research centre, Ural branch of Russian academy of science» Adress: 620061, Russia, Yekaterinburg, v. Istok, Glavnaya st., 21
Шаталина Ольга Сергеевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела животноводства.
E-mail [email protected], тел. 89222058396 Shatalina Olga Sergeevna, candidate of biological sciences, senior research associate of the department of animal
breeding. E-mail [email protected], tel. 89222058396
Аннотация. Проведение иммуногенетической экспертизы важная составляющая грамотной племенной и селекционной работы. Определение групп крови невозможно без использования специфических реагентов (моноспецифических сывороток), их получение - это важная работа, проводимая сотрудниками лаборатории иммуногенетической экспертизы Уральского научно-исследовательского института сельского хозяйства - филиала ФГБНУ «УрФАНИЦ УрО РАН». В связи с сокращением количества и объема реагентов возникла необходимость их изготовления в лаборатории. Целью работы являлось пополнение банка реагентов необходимыми моноспецифическими сыворотками. Существуют три способа получения моноспецифических сывороток: иммунизация, абсорбция и эллюция. Методом иммунизации изготовлено 15 реагентов. За счет использования абсорбции очищено 94 полиспецифических сыворотки до моноспецифических, произведено 20 видов реагентов. С помощью метода эллюции полиспецифическая сыворотка разделена на два моноспецифических реагента. Так, в лаборатории иммуногенетической экспертизы в 2017 г. изготовлен 41 реагент, титр которых варьируется от нативного (1:1) до 1:512.
Summary. Conducting immunogenetic expertise is an important component of literate pedigree and breeding work. Determination of blood groups is impossible without the use of specific reagents (monospecific sera), their preparation is an important work carried out by the laboratory staff of immunogenetic expertise of the Ural Scientific Research Institute of Agriculture, branch FSBSI UrFASRC, UrB of RAS. In connection with the reduction in the quantity and volume of reagents, it became necessary to make them in the laboratory. The purpose of the work was to replenish the reagent bank with the necessary monospecific sera. There are three ways to obtain monospecific sera: immunization, absorption and excretion. The method of immunization produced 15 reagents. Due to the use of absorption, 94 polyspecific sera were purified to monospecific sera, 20 kinds of reagents were produced. Using the method of exclusion, the polyspecific serum is divided into two monospecific reagents. Thus, in the laboratory of immunogenetic examination, in 2017 41 reagents were made, the titer of which varies from native (1:1) to 1:512.
Введение
Определение групп крови крупного рогатого скота необходимо для следующих целей: установление достоверности происхождения, изучения генофонда популяций крупного рогатого скота, исследование взаимосвязи антигенов крови с хозяйственно-полезными признаками [6]. Иммуногенетический анализ проводится с помощью РСК (реакции связывания комплемента) [5]. При данной реакции происходит гемолиз антигенов, находящихся в крови крупного рогатого скота, которые
42
вступают в реакцию с антителами (реагентами) в присутствии катализатора - комплемента (сыворотки крови кроликов) [7]. В основу метода иммунологического контроля положен метод кодоминантного наследования животными групп крови и неизменности в течение онтогенеза. Потомки имеют только антигены, полученные по наследству от родителей [4]. Антигенный состав групп крови крупного рогатого скота определяют с помощью моноспецифических сывороток [3]. Моноспецифическая сыворотка - это сыворотка
крови, которая содержит антитела к одному антигену и не реагирует с другими антигенами. Сыворотки крови иначе называют реагенты. П. Эрлих и Моргентрот установили, что антитела образуются при введении крови одного животного другому того же вида [2]. Изготовление реагентов производится из иммунных сывороток, которые получают от животных донорского стада [1], [8]. Большое значение при этом уделяется специфичности реагентов [2]. Сыворотка считается специфичной в том случае, если она выявляет только соответствующее ей антитело и не реагирует с другими антигенами [9].
По способности вызывать образование антител различают антигены сильные и слабые. В EAA- системе антигены A1, A2 и Z1 -сильные, D1, D2 и H - более слабые. В других системах к сильным антигенам относятся B (B1, B2), I1, Y2, B', I', B", C1, C2, R1, W, U, Z, остальные факторы обладают меньшей способностью индуцировать выработку антител. Антитела против слабых антигенов, за редким исключением, вырабатываются медленно после продолжительной иммунизации, их титр обычно невысок [3].
Цель работы - создание банка моноспецифических сывороток - реагентов для использования в определении групп крови и достоверности происхождения крупного рогатого скота.
Материалы и методы
Исследование выполнено в отделе животноводства и иммуногенетической экспертизы Уральского НИИСХ - филиала ФГБНУ «УрФАНИЦ УрО РАН», в соответствии с темой «Совершенствование уральского типа черно-пестрого скота. Изучение генетической структуры популяции черно-пестрого скота с использованием ДНК-технологий» (№ государственной регистрации 0772-20180005). Изготовление моно специфических сывороток-реагентов выполнено согласно методическим рекомендациям П.С. Вере-вочкина, Н.Н. Едренина [1]. Иммунизация и взятие крови крупного рогатого скота проводилось в 2017 году в донорских стадах крупного рогатого скота СПК «Колхоз имени Свердлова» и ЗАО «Агрофирма «Патруши», составляющих 50 голов каждое. Для центри-
фугирования крови и сыворотки крупного рогатого скота использовали центрифуги centrifuge 5810R фирмы Eppendorf, РС-6МЦ фирмы Дастан.
Результаты исследований
В течение 2017 года в ЗАО «Агрофирма Патруши» проведено 64 отбора крови по одному литру для пробных и массовых аб-сорбций и 50 проб по 10 мл - на аттестацию донорского стада и проверку титра вырабатываемых антител. В СПК «Колхоз имени Свердлова» взято 19 литров крови для больших абсорбций.
В таблице 1 приведены основные данные по итогам и объему проведенной работы.
В СПК «Колхоз имени Свердлова» осуществили три цикла иммунизаций. Для первой и второй иммунизации взято 9 пар «донор-реципиент». Проведен забор крови у доноров и трехкратное прилитие ее реципиентам. Образование антител по окончании первой иммунизации отмечено у 4 реципиентов, т.е. 44 %, второй - от 3 реципиентов, т.е. 30 %. Изготовлены реагенты: E'3 Т1:4, X2 Т 1:125, B' Т 1:4 и Y2 Т 1:32, H' Т 1:8, E'3 Т 1:16 и смесь реагентов.
Для третьей иммунизации подобрано 8 пар «донор-реципиент». По окончании иммунизации выявлены антитела трех реципиентов, т.е. 30 %. Изготовлены реагенты: F'2 Т 1:16, A1 Т 1:32, F Т 1:8.
В ЗАО «Агрофирма «Патруши» проведено две серии иммунизаций. Донорские стада крупного рогатого скота составили по 30 голов в каждой группе. Для первой иммунизации подобрано 8 пар «донор-реципиент». По окончании иммунизации отмечено антитело-образование от 4-х реципиентов, что составляет 50 %. Выработаны реагенты: B2 Т 1:16, H' Т 1:4, A1 Т 1:4 и смесь реагентов.
Вторую иммунизацию проводили на 7 парах «донор-реципиент». По окончании иммунизации все реципиенты проверены на наличие антител. Выработано три реагента: A2 Т 1:16, Y' Т 1:8, A2 Т 1: 16 и смесь реагентов.
Всего при иммунизации в ЗАО «Агрофирма «Патруши» получено 6 реагентов, каждый из которых позволяет аттестовать от 35 000 до 82 000 голов.
43
Таблица 1
Полученные реагенты
Полученный реагент Сыворотка
название титр объем, гол.
89-06 1:8
Ш-1808 1:64
115-014 1:4
270-16 1:16
Б 234-137 1:8 2 147 700
388-168 1:32
63 1:8
3-08 N
250 1:8
123-678 1:8
659 1:16
43-6880 1:64
^ Ш-1808/С 1:125 2 703 900
604 1:4
669 1:256
290-4193 1:64
К 41-916 1:8 30 900
м 298-6620 1:8 111 700
321-152 1:8
Е'1 170 1:4 4 480
153-39 1:4
Z 84-02 1:32 808 500
29-4773 1:16
29-076 1:8 2 000
110-9 1:8
W 42-4280 1:4 10 624 100
43-011 1:512
81-21 1:4
87-920 1:32
1-96 1:16
167-65 1:32
Е'з 327-158 1:64 1 308 270
57-522 1:16
69 1:16
155 1:4
219 1:16
43 1:4
066 1:256
506-362 1:8
Y2 205-5006 1:8 9 672 300
452-490 1:32
36-280 1:32
328-74 1:4
174 1:32
103-010 1:8
С2 833 1:64 1 244 800
475-469 1:64
512-0827 1:8
11 143-712 1:8 1 066 300
11-678 1:32
611 1:8
01 868 1:8 140 170
227-4845 1:8
12 118 1:4 5 980
76 1:16
160-51 1:4
90-013 1:4
Н' 139-1151 1:4 905 180
135-1181 1:256
9945 1:4
201 1:8
Х1 874 1:16 23 500
Х2 803 1:32 520 000
154 1:125
39-019 1:8
L 261-6636 1:4 860 400
84-070 1:4
133-1190 1:4
G' 52-37 1:16 154 200
75-396 1:64
02 75-027 1:64 731 800
590 1:4
453-473 1:8
865 1:8
А'2 44-186 1:32 728 400
480-301 1:32
854 1:4
^ 113 1:8 70 400
46 1:8
Т1 56 1:4 34 300
467-457 1:4
S2 230-4836 1:512 5 652 000
55-1977 1:2
D' 181-21 1:4 5 600
75-392 1:8
646 1:64
R1 360-224 1:8 1 194 500
265-6629 1:64
А1 30107 1:4 135 000
243 1:32
83-07 1:8
А2 20-20 1:512 2 850 900
315 1:16
205 1:16
136 1:8
О' 65-254 1:16 483 100
29-06 1:8
Q' 635 1:8 140 670
У' 111 1:8 46 000
041 1:8 8 500
и 051 1:4 34 200
и' 320-145 1:8 137 070
672 1:2
102-952 1:32
В2 90-862 1:32 464 500
9823 1:16
854 1:64
В' 61-68 1:8 603 300
157 1:4
Р'2 246-146 1:4 20 000
234 1:16
В течение 2017 года проведена постановка иммуногенетической реакции с целью проверки наличия антител и титра с 200 ранее изготовленными сыворотками. Из них -20 сывороток не имеют антител, 94 успешно очищены, 86 - требуют дополнительных очисток. Сыворотки проверены на панельном стаде крупного рогатого скота ЗАО «Агрофирма «Патруши», аттестованном набором реагентов ФГБНУ «Смоленский НИИСХ» и имеющейся крови, привозимой из сельскохозяйственных организаций для имму-ногенетического анализа. Всего выполнено 20 постановок реакций.
Кровь крупного рогатого скота для абсорбции каждой сыворотки подбиралась с учетом отсутствия антигенов к необходимых нам антителам. Выполнено 30 пробных и 30 массовых абсорбций. Во время каждого цикла пробных абсорбций очищали несколько сывороток, затем проверяли наличие антител постановкой иммуногенети-ческой реакции. Методом абсорбции изготовлено 94 реагента, составляющие 20 видов реагентов. При этом изготовлено реагента Б -8 вариантов, W - 4, Е'3 - 7, Н' - 7, G2 - 6,
А1 - 2, А2 - 5, М - 3, Z - 2, Y2 - 6, С2 - 4, 11 - 2, 01 - 3, L - 3, ^ - 5, 02 - 2, А'2 - 4, ^ - 2 а, S2 - 2, D' - 3, R1 - 3, В2 - 3 варианта, О' -3 варианта, Х2 - 3 варианта, Б'2 - 2 варианта.
Титр изготовленных реагентов варьирует от нативного до 1:512. Объем реагентов позволяет аттестовать более 2000 голов.
Методом эллюции изготовлено 2 реагента. Сыворотка 854 содержала в себе антитела двух видов: В2 и А'2. При абсорбции сыворотки кровью крупного рогатого скота А1/- Y2A'1/ 12 Б/- Н'/- получен реагент В2, титр составил 1:64. Эритроциты, оставшиеся после сбора сыворотки, трижды очистили физиологическим раствором. Затем добавили равный объем физиологического раствора и поставили в водяную баню на 30 минут при 56 0С. При этом произошло разделение комплекса «антиген-антитело». После прогревания провели центрифугирование. Антитела перешли в физиологический раствор. В результате проведенной работы получен реагент А'2, титр 1:4.
Заключение
Банк реагентов, необходимый для определения групп крови, составляет 52 единицы.
46
За 2017 год в лаборатории иммуногенети-ческой экспертизы изготовлен 41 вид реагентов, что позволяет пополнять запас реагентов и проводить иммуногенетическую реакцию с целью определения групп крови и достоверность происхождения племенных животных крупного рогатого скота.
Список литературы
1. Веревочкин П.С. Иммуногенетика в селекции крупного рогатого скота / П.С. Веревочкин, Н.Н. Ед-ренин. Куйбышев: Куйбышевское книжное изд-во, 1988. - 85 с.
2. Гонтов М.Е. Аллелофонд крупного рогатого скота племенного репродуктора ОАО «Смоленское» и использование его для экспертизы породной принадлежности / М.Е. Гонтов, Д.Н. Кольцов, В.А. Онуфриев, Н.Н. Шумейко // Сборник научных трудов по материалам научно-практической конференции с международным участием «Достижения современной аграрной науки сельскохозяйственному производству», 2017. - С. 184-188.
3. Гридин В.Ф. Особенности антигенного состава крови крупного рогатого скота уральского типа / В.Ф. Гридин, И.В. Ткаченко, С.Л. Гридина // Вестник Курганской ГСХА, 2013. № 1. - С. 40-42.
4. Ильясова Э.И. Иммуногенетическое сходство родительских пар крупного рогатого скота и его влияние на продуктивность потомства / Э.И. Ильясова, Ф.Р. Валитов // Современное состояние, традиции и инновационные технологии в развитии АПК. Материалы Международной научно-практической конференции в рамках XXVII Международной специализированной выставки «Агрокомплекс-2017». Башкирский государственный аграрный университет, 2017. - С. 55-58.
5. Кэтти Д. Антитела. Методы / Д. Кэтти, Ч. Рай-кундалия, Д. Браун. М.: Мир, 1991. - 288 с.
6. Попов Н.А. Аллелофонд красно-пестрой породы по ЕАВ-локусу / Н.А. Попов, Л.К. Марзанова // Зоотехния, 2015. №8. - С. 2-5.
7. Романенко Г.А. Генетические маркеры в селекции уральского черно-пестрого скота / Г.А. Романенко, С.Л. Гридина // Аграрный вестник Урала, 2009. № 4. - С. 82-83.
8. Сороковой П.Ф. Методические рекомендации по исследованию и использованию групп крови в селекции крупного рогатого скота. Дубровицы: Отдел научно-технической информации, 1974. - 40 с.
9. Шукюрова Е. Достоверность происхождения скота в Хабаровском крае / Е. Шукюрова, Л. Колпа-кова, З. Гришина // Молочное и мясное скотоводство, 2006. № 6. - С. 31-32.
^\\НММ1111111М1111111М1111111М1111111М1111111ММ1111111М1111111М1111111М1111М
I КАК ОФОРМИТЬ ПОДПИСКУ НА ЖУРНАЛ? I
| А. Через подписной каталог =
| Индекс в каталоге «Газеты. Журналы» Агентства «Роспечать» - 33184 |
| Б. Через редакцию журнала |
= Банковские реквизиты для оплаты подписки |
| по безналичному расчету для юридических лиц: |
| ЧОУДПО «Институт Ветеринарной Биологии» |
| ИНН 7802196720 КПП 781301001 |
Щ Р/с 40703810400000000022 в АО «Горбанк», г. Санкт-Петербург |
| К/с 30101810200000000814 БИК 044030814 |
| В поле «Назначение платежа» указать: =
| «Предоплата за подписку на журнал «Актуальные вопросы |
| ветеринарной биологии» на 2017 г. согласно инф. письму б/н |
| от 03.09.18 г. НДС не облагается. Адрес подписки: ...» |
| Стоимость редакционной подписки на 2017 год: =
Щ 2000 рублей. |
Е Адрес редакции: Санкт-Петербург, ул. Ораниенбаумская, 3-Б. =
I Т./ф. (812) 232-55-92, т. 927-55-92. |
I E-mail: [email protected]; www.invetbio.spb.ru |
