CC BY
14
УДК 636.22/28.082.12
С. Л. Гридина, О. С. Шаталина, Г. Ф. Палий, Т. М. Сайранова
ОСОБЕННОСТИ ПРОИЗВОДСТВА МОНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК-РЕАГЕНТОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «УРАЛЬСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА»,
ЕКАТЕРИНБУРГ
S. L. Gridina, O. S. Shatalina, G. F. Paly, T. M. Sayranova
THE PRODUCTIVE FEATURES OF MONOTYPIC WHEY REAGENT OF CATTLE FEDERAL STATE BUDGETARY RESEARCH INSTITUTION OF AGRICULTURE, EKATERINBURG
Аннотация: Для сохранения племенной ценности животных необходим иммуногенетический контроль стад, который проводится с использованием реакции связывания комплемента. Реагенты для данной реакции изготовляются методом иммунизации крупного рогатого скота и последующим взятием крови. Существует около 100 антигенов групп крови крупного рогатого скота, для иммуногенетической экспертизы достаточно 36 моноспецифических сывороток. Увеличение количества изготовленных реагентов позволяет более качественно определить родителей племенного животного, и полно раскрыть его фенотип группы крови.
Ключевые слова: крупный рогатый скот; иммуногенетика; реагенты; титр.
Abstract: To save the breeding value of animals the immunoge-netic control of herds IS NESESSARY, which takes place with the use of complement fixation. The reagents for this reaction are produced by immunization of cattle and the following blood taking. There are about 100 cattle blood group antigens, for the immunogenetic examination enough 36 monotypic whey. The increasing number of produced reagents permits to identify better the parents of the animal breeding and fully disclose his blood group phenotype.
Key words: cattle; immunogenetics; reagents; titer.
Светлана Леонидовна Гридина
Svetlana Leonidovna Gridina доктор сельскохозяйственных наук, доцент
uralselex@mail.ru
Я
f
mgr* j
Ольга Сергеевна Шаталина
Olga Sergeyevna Shatalina кандидат биологических наук shatalinao@list.ru
Галина Федоровна Палий
Galina Fiodorovna Paly uralselex@mail.ru
Татьяна Макаровна Сайранова
Tatyana Makarovna Sayranova uralselex@mail.ru
Введение. В племенной работе и селекции крупного рогатого скота очень важно получить потомство от генетически ценных родителей [1]. Для этого необходима экспертиза достоверности происхождения. Соответствие потомков родителям возможно установить двумя методами: фрагментарным анализом ДНК и иммуноге-нетической экспертизой. Второй метод появился раньше, но является точным (до 99 %) и используется до сих пор. При введении иммуногенетической экспертизы племенных животных установлено, что доля животных с неточными записями происхождения составляла 70-100 %, после введения контроля до 5 % и менее [2]. Причинами ошибок в записях родословных племенных животных могут быть: использование спермы нескольких быков для осеменения одной коровы, подмена те-
лят при одновременных родах коров, несвоевременное мечение телят, замена спермы на пунктах искусственного осеменения, неточные записи в программу ИАС «Селэкс» - Молочный скот и др. [3].
Материалы и методы исследования. Иммуногенетический анализ проводили с помощью РСК (реакции связывания комплемента), в которой антигены крови взаимодействовали с антителами, и происходил лизис эритроцитов [4]. В основу метода иммунологического контроля положен метод кодоминантного наследования животными групп крови и неизменности в течение онтогенеза [5]. Потомки имеют только антигены, полученные по наследству от родителей. При выявлении антигенов потомства, отсутствующих у родителей, делали заключение о неправильности регистрации про-
исхождения [6]. Изготовление реагентов для постановки реакции проводили в донорских стадах ООО «Мезенское», ООО «Бородулинское» и СХПК «Первоу-ральский». Выборка животных в каждом донорском стаде составляла 50 голов, аттестованных по группам крови. В стаде выбирали животных-доноров, содержащих антигены, антитела к которым нужно получить, и животных-реципиентов, не содержащих их, но близких по антигенному составу к донорам [7].
Забор крови проводили у донора. Взятую кровь вводили реципиенту. После трехкратного введения крови донора вырабатывались необходимые антитела. Взятую кровь реципиента отстаивали до получения сыворотки, которую разделяли на фракции, центрифугируя ее при 3500 оборотов в минуту для отделения от эритроцитов. Проводили проверку наличия антител в сыворотке. Получаемый реагент сравнивали при помощи иммуногенетической экспертизы с нужным, при взаимодействии антигена с антителом происходил гемолиз эритроцитов. В случае положительной реакции антигена с антителом антитело считали реагентом.
При иммунизации реципиента обычно образовывалось не одно, а несколько антител, которые устанавливали путем сравнения с готовыми реагентами. Ненужные антитела «истощали». Из донорского стада подбирали животных, у которых
Результаты исследования и их обсуждение.
В таблице 1 представлен перечень реагентов, имеющихся в лаборатории ФГБНУ «Уральский НИИСХ». Данные реагенты относятся к 12 системам локусов групп крови. Многие реагенты имеют подтипы, позволяющие более точно составить аллели групп крови, полученные от родителей. На основании соответствия аллелей потомка родителям делается заключение о достоверности происхождения.
есть антигены к тем антителам, которые не требуются для получения реагента, но отсутствует антиген к получаемому реагенту. У этих животных брали кровь, центрифугировали ее для получения эритроцитов. Затем с эритроцитами центрифугировали получаемый реагент. При этом лишние антитела «истощались», оставался только полученный реагент. Сыворотку центрифугировали с кровью нескольких животных (до 15 голов). При постановке реакции с донорским стадом сопутствующие антитела давали реакцию, которая не соответствует получаемому реагенту, поэтому при центрифугировании сыворотки с кровью животных, которые давали эту реакцию, убирали лишние антитела.
В полученном реагенте проверяли титр, т. е. концентрацию антител. Для этого проводили имму-ногенетическая реакцию с реагентом в различных разведениях (таблица 2).
Таблица 1 - Перечень имеющихся реагентов
Номер системы Название системы Антигены
1 А А1, А2, Н, Б, Ъ1
2 В Вр в* ^ о^ 1р к ор оу о^ о^ т^ т* уР уу А1р ^ ^ Б1, Б:2, Е11, Б:2, Б:3, О, 111, Р2, I, К1, о:2, Р1, О1, У1, О^, О^, Ап2, В11, Бп, о11,
3 С С1, С2, Е, Яр Я2, W, Х1, Х2, С1, Ь1, X1, С111, С112
4 Б Б1, Б2, У1, У2, К1, V1
5 I I
6 Ь Ь
7 М М
8 82, Н1, ц, и, и:2, нп, и11
9 Ъ Ъ
10 N К1
11 Я' Я1
12 Т' Т1
Таблица 2 - Определение титра антител
№ животного Предполагаемый реагент
N 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:125 1:256 К
1 44 44 44 44
2 22
3 44 44 44 44
4 44 44 44 44
5
6 44 44 44 44 44
7
8 22 22
9
10 44 44 44
11
12 44 44 44 44
13 23 33
14
Титр реагентов варьирует от нативного до 1:512. Чем выше титр, тем больше антител содержится в сыворотке. Высокий титр позволяет использовать полученный реагент на определение групп крови большего количества голов крупного рогатого скота. Изготовленные реагенты необходимо фасовать: сыворот-
ку разводить физиологическим раствором до нужного объема и замораживать при температуре -20 оС до использования в реакции.
В 2009-2014 гг. изготовлены 25 реагентов, ко -торые пополнили запас банка реагентов (таблица 3). Для их изготовления использована 52 сыворотка.
Реагент Титр Количество
Грамм Аттестуемое поголовье
1:8 1400 40 000
С2 1:4 2485 35 400
1:64 645 161 250
1:32 155 17 200
1:8 520 14 800
1:2 150 2 100
№ 1:16 595 35 000
Ь 1:4 1040 14 800
1:2 195 2 800
1:16 1365 80 300
и 1:16 95 5 600
и1 1:4 805 11 500
N 215 3 000
1:4 130 1 800
Ь1 1:8 625 17 800
Б N 175 2 500
1:4 1405 20 000
1:2 325 4 600
М N 190 2 700
о1 1:4 440 6 300
Таблица 3 - Реагенты, полученные из сывороток
Продолжение таблицы 3
1:4 660 9 400
Ъ 1:2 2000 28 600
Х2 1:8 585 16 700
1:32 145 16 100
1:16 195 11 500
W 1:32 135 15 000
н1 1:4 2555 36 400
1:256 500 500 000
О2 1:64 1170 292 500
1:4 95 1 300
О1 1:2 250 3 600
1:4 550 7 800
А! 1:512 2705 5 410 000
У2 1:4 1120 16 000
1:8 245 7 000
о! 1:8 150 4 300
А2 1:4 2235 32 000
1:64 920 230 000
В1 1:4 965 13 800
№ 1:2 1815 26 000
Е, 1:8 360 10 300
Получено реагентов: О1 ,У2 - двух сывороток, Ь, Б:2, Х2, в2, А2 - из трех сывороток, Б, Н1 - из четырех сывороток, С2 - из 10 сывороток. Все реагенты являются моноспецифичными. Наивысший титр имеет реагент А1 - 1:512, также реагент Н1 - 1:256. Большинство изготовленных реагентов обладают титром 1:4.
В ходе иммунизации получено 3 реагента: в3, А2 и Б. Наибольшее количество получено реагента Б. Высокий титр отмечен реагентов в3 и А2 - 1:125.
При помощи изготовленных реагентов проведена аттестация групп крови и определение достовер-
Список литературы
1 Гридина С. Л., Петров В. А., Романенко Г. А. Иммуногенетический контроль происхождения племенного крупного рогатого скота в Свердловской области. - Нивы Урала, 2009. - С. 116-117.
2 ГридинаС. Л., Романенко Г. А. Иммуногенетические исследования в селекции уральского черно-пестрого скота // Аграрный вестник Урала. - 2011. -№ 1. - С. 34.
3 Лазарева Ф. Ф., Сагитдинов Ф. А. Перспективы использования групп крови при селекции уральского черно-пестрого скота // Материалы международной научно-практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки». - Дубровицы, 2004. - С. 56-58.
4 Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Д. Антитела. Методы. - М. : Мир, 1991. - 288 с.
ности происхождения. В 2014 году по Свердловской области аттестовано 5002 животных крупного рогатого скота, а уровень ошибок в среднем по исследуемым животным не превышает 1 %.
Вывод. Для пополнения банка реагентов при больших объемах иммуногенетических исследований необходимо регулярное производство моноспецифических сывороток. Проведение иммуногенетического анализа возможно при наличии 36 реагентов, но при большем количестве можно выявить больше аллелей и точнее определить достоверность происхождения.
5 Временная инструкция по генетическому контролю достоверности происхождения сельскохозяйственных животных. Методические рекомендации / П. Ф. Сороковой [и др.]. - М. : Агропромиздат, 1985. - 40 с.
6 Веревочкин П. С., Едренин Н. Н. Иммуногенети-ка в селекции крупного рогатого скота : Методические рекомендации. - Куйбышев : Куйбышевское книжное изд-во, 1988. - 103 с.
7 Шаталина О. С. Образование антител при введении в организм чужеродной крови как проявление иммунитета // Материалы седьмой всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». - Новосибирск, 2015. - С. 319-320.
