CC BY
182
УДК 538.9:577.352.332/.335:577.175.5:577.31
Основы многоуровневой мезомеханнкн наноструктурных переходов в мембранах эрнтроцнтов н нх разрушення прн взанмодействнн
с гормонамн стресса
Л.Е. Панин, П.В. Мокрушников, В.Г. Куницын, В.Е. Панин1, Б.Н. Зайцев2
Научно-исследовательский институт биохимии СО РАМН, Новосибирск, 630117, Россия
1 Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, Томск, 634021, Россия
2 ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»,
пос. Кольцово, Новосибирская обл., 630559, Россия
Гормоны стресса (кортизол, адреналин, норадреналин) могут неспецифически связываться с мембранами эритроцитов, вызывая в них структурно-фазовые переходы. Константы связывания для кортизола, адреналина и норадреналина составляют соответственно 1.23 • 106, 6.3 • 106 и 1.7 • 106 М-1. Количество связанного гормона варьирует в пределах 10-10—10-11 моль/мг белка. В механизме связывания принимают участие водородные связи, гидрофобные и электростатические взаимодействия. Активные группы гормонов (метиламин-, амино-, имино-, кето- и гидроксигруппы) одновременно взаимодействуют с CO- и NH-группами как белков, так и фосфолипидов. Данные процессы лежат в основе структурно-фазовых переходов в мембране при взаимодействии ее с гормонами стресса. Это приводит к образованию в мембране сложных белок-липидных доменов, в которых происходит возрастание структурного порядка. В то же время диполи воды из доменов вытесняются в смежные области и способствуют разрыхлению мембраны. При этом микровязкость мембран существенно возрастает как в области белок-липидных, так и в области липид-липидных взаимодействий. Возрастание вязкости мембран эритроцитов затрудняет их продвижение по мелким капиллярам и при превышении определенного критического значения способствует развитию тканевой гипоксии. Мезомеханика структурно-фазовых переходов и процессов разрушения во внешних полях биологических мембран и наноструктурных твердых тел качественно одинакова.
Ключевые слова: плазматические мембраны, гормоны стресса, флуоресцентный анализ, инфракрасные спектры, структурнофазовые переходы
Fundamentals of multilevel mesomechanics of nanostructural transitions in erythrocyte membranes and their destruction in interaction with stress hormones
L.E. Panin, P.V. Mokrushnikov, V.G. Kunitsyn, V.E. Panin1 and B.N. Zaitsev2
Scientific Research Institute of Biochemistry SB RAMS, Novosibirsk, 630117, Russia
1 Institute of Strength Physics and Materials Science SB RAS, Tomsk, 634021, Russia 2 State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”, Koltsovo, Novosibirsk region, 630559, Russia
Stress hormones (cortisol, adrenaline, noradrenaline) are capable for nonspecific binding with erythrocyte membranes thus initiating structural-phase transitions in the membranes. The binding constants for cortisol, adrenaline and noradrenaline are respectively 1.23 • 106, 6.3 • 106 and 1.7 • 106 M-1. The amount of bound hormones varies in the range 10-10-10-11 mole/mg protein. The binding mechanism involves hydrogen bonds, hydrophobic bonds and electrostatic bonds. Active groups of hormones (methylamine-, amino-, imino-, keto-and hydroxy-groups) interact simultaneously with CO- and NH-groups of both proteins and phospholipids. These processes underlie structural-phase transitions in an erythrocyte membrane in its interaction with stress hormones. This results in complex protein-lipid domains of increasing structural order in the membrane. At the same time, water dipoles are displaced from the domains to adjacent regions and promote membrane loosening. The membrane microviscosity thus greatly increases in the regions of both protein-lipid interactions and lipid-lipid interactions. The increase in erythrocyte membrane viscosity hampers the motion of erythrocytes through capillaries, and as a certain critical threshold is approached, this contributes to the development of tissue hypoxia. The mesomechanics of structural-phase transitions and destruction in external fields of biological membranes and nanostructured solids are qualitatively alike.
Keywords: plasma membranes, stress hormones, fluorescence analysis, infrared spectra, structural-phase transitions
© Панин Л.Е., Мокрушников П.В., Куницын В.Г., Панин В.Е., Зайцев Б.Н., 2011
1. Введение
Клетка — это сложная иерархическая система, в структурно-функциональной организации которой важную роль играют биологические мембраны. Именно мембраны разделяют клетку на функциональные отсеки и одновременно определяют интегральный характер поведения ее как целого.
Системообразующими связями в биологических мембранах как жидких кристаллах являются ковалентные и водородные связи, гидрофобные и электростатические взаимодействия. Самая сильная из них — ковалентная связь. Ее энергия колеблется в пределах 50100 ккал/моль. Энергия водородной связи равна ~6 ккал/моль. Близка к этим величинам энергия гидрофобных и электростатических взаимодействий. Низкоэнергетические связи определяют такое понятие, как «жидкостность» мембран. Это дает возможность мембраносвязанным белкам участвовать в латеральном смещении, что очень важно при формировании кластеров, участвующих в трансмембранном переносе различных соединений (эндоцитоз, фагоцитоз).
Изменение «жидкостности» мембран играет чрезвычайно важную роль в эритроцитах и других клетках крови во время прохождения ими через капиллярное русло. Гидродинамика перемещения эритроцитов в крупных кровеносных сосудах связана с закручиванием потока крови, что позволяет избежать турбулентности. В капиллярах этот механизм движения потока крови невозможен. Диаметры капилляра и эритроцита — сопоставимые величины, ~8-9 мкм. Вклад сил трения здесь выше. Эритроциты, имеющие жесткие клеточные мембраны, не способны пройти через капилляр. Для обеспечения такого движения необходимо повысить текучесть мембран, их «жидкостность». Нами было показано, что такой механизм реально существует. Он связан с удалением части молекул холестерина из мембран эритроцитов и других клеток. Оказалось, что в капиллярах часть холестерина покидает клеточные мембраны и переходит в плазму крови. Акцептором холестерина в данном случае являются белки — аполипопротеины А-1 [1]. Это повышает текучесть клеточных мембран, и эритроциты достаточно легко преодолевают капиллярное русло. В капиллярах эритроцит может принимать любую форму. В венах происходит обратный процесс. Холестерин переходит на клеточные мембраны, жесткость их возрастает, и эритроцит принимает типичную форму двояковогнутого диска. В результате работы этого механизма содержание холестерина в плазме капиллярной крови выше, чем в венозной.
В полях внешних воздействий под влиянием изменений температуры, рН среды, ионного состава, при действии химически активных соединений (гормоны, ионы тяжелых металлов) биологические мембраны ведут себя как термодинамически неравновесные систе-
мы. Обратимость формоизменения в таких мембранах нарушается, в них возникают наноструктурные переходы, внутренние напряжения, происходит разрушение мембран.
В настоящей работе основы мезомеханики таких переходов и связанного с ними нарушения сплошности мембран исследованы на эритроцитарных мембранах при действии на них гормонов стресса.
2. Атомно-силовая микроскопия поверхности эритроцитарных мембран при действии на них гормонов стресса
В работе исследовали действие на эритроцитарные мембраны трех гормонов: кортизола, адреналина, нор-адреналина (Amersham, UK), рис. 1.
Эритроциты получали из свежевыделенной крови после декапитации крыс линии Wistar под легким нем-буталовым наркозом. Кровь разбавляли вдвое изотоническим фосфатным буфером рН 7.35, содержащим по 0.18 М KH2PO4 и Na2HPO4. После осаждения клеток с помощью центрифугирования при 330g в течение 10 мин надосадочную жидкость сливали и процедуру промывки повторяли еще 2 раза.
Все процедуры проводили при 4 °С. Полученную взвесь эритроцитов обьемом 20 мкл наносили на предметное стекло, делали тонкий мазок и после предварительного подсушивания на воздухе просматривали в атомно-силовом микроскопе Solver Bio NT-MDT при температуре 24 °С [2].
Рис. 1. Гормоны стресса: кортизол, адреналин, норадреналин
/ -х / / 1 і
/ N \ / \ \
\ / V
\ 1. / / /
\ \ \ / / і
\ \ /
V Ї /
Длина, мкм
Рис. 2. Нормальный эритроцит крысы, атомно-силовая микроскопия, скан 9x9 мкм (а); профиль поперечного сечения (б)
Эритроциты здоровых животных в атомно-силовом микроскопе выглядели как крупные двояковогнутые диски диаметром -6 нм (рис. 2). При большем увеличении на их поверхности выявлялась более мелкая шероховатость, которая может быть связана с присутст-
Рис. 3. Поверхность эритроцита после взаимодействия с растворителем гормонов, атомно-силовая микроскопия, скан 1x1 мкм (а); профиль поперечного сечения (б)
вием мембраносвязанных белков. При добавлении к взвеси эритроцитов растворителя гормонов (диметил-сульфоксид плюс этанол, 10 % от объема смеси) шероховатость поверхности возрастала (рис. 3). При введе-
Рис. 4. Поверхность эритроцита после адсорбции на ней кортизола с концентрацией 10 М, скан 3x3 мкм, поверхность плоская, видны углубления размером 2 нм, разделяющие мембрану на домены (а); профиль поперечного сечения (б)
Рис. 5. Поверхность эритроцита после адсорбции на ней норадрена-лина с концентрацией 4 • 10-7 М, атомно-силовая микроскопия, скан 3x3 мкм, поверхность деформирована, видны домены размером 1.5 х 1.5 мкм2 и высотой 30 нм (а); профиль поперечного сечения (б)
нии во взвесь эритроцитов кортизола в конечной концентрации 10-6 М картина резко менялась. На ровной поверхности появлялись многочисленные мезополосы локального разрыхления структуры клеточной мембраны (рис. 4). Эти мезополосы представляли собой углубления (-2 нм) в мембране эритроцита. Они разделяли мембрану эритроцита на плоские домены.
Более значительные изменения структуры эритро-цитарных мембран вызывал норадреналин (рис. 5). Поверхность мембраны перестала быть ровной, на ней появились выпуклые участки (домены), имеющие «твидовую» внутреннюю структуру, которые чередовались с участками значительного углубления поверхности. Нор-адреналин вызывал появление доменов размером
1.5 х 1.5 мкм2 и высотой 30 нм. При добавлении адреналина (рис. 6) также появились домены размером
1.5 х 1.5 мкм2 и высотой 30 нм, но при этом в них возникали внутренние домены меньшего размера (происходила фрактализация поверхности). Их линейные размеры на порядок меньше: 0.15x0.15 мкм2, однако высота почти такая же — 20-25 нм.
Рис. 6. Поверхность эритроцита крысы после адсорбции на ней адреналина с концентрацией 10-6 М, атомно-силовая микроскопия, скан 3x3 мкм, поверхность деформирована, видны домены размером 1.5 x 1.5 мкм2, на поверхности крупных доменов видны домены меньшего размера 0.15 x0.15 мкм2 высотой 20-25 нм (а); профиль поперечного сечения (б)
В организме в условиях стресса кортизол и адреналин действуют одновременно. В связи с этим оба гормона добавляли к взвеси эритроцитов в трех последовательностях: кортизол - адреналин, адреналин - кортизол и, наконец, смесь обоих гормонов. Конечная концентрация гормонов составляла для кортизола 3 • 10-8 М, для адреналина 5 -10-8 М. Показано, что при добавлении первым кортизола, а затем адреналина в структуре доминировало влияние первого гормона. В структуре мембраны формировались крупные домены, на границе которых видны поры, проникающие на всю глубину мембраны (рис. 7). При добавлении первым адреналина, а затем кортизола в структуре мембран формировались мелкие домены с проникающими сквозными порами на их границах (рис. 8). При одновременном добавлении обоих гормонов в картине доминировало влияние кортизола. Механизм формирования доменной структуры биологических мембран был вскрыт на основе результатов инфракрасной спектроскопии и флуоресцентного анализа.
Г]
Рис. 7. Изображение поверхности эритроцита крысы после адсорбции на ней сначала кортизола, затем адреналина (концентрация кортизола — 3 -10 8 М и адреналина — 5 -10 8 М), поверхность деформирована, видны крупные домены размером 0.4 x 0.4 мкм2, высотой 30-35 нм, атомно-силовая микроскопия (а); профиль поперечного сечения (б)
Ш
А
Рис. 8. Изображение поверхности эритроцита крысы после адсорбции на ней сначала адреналина, затем кортизола (концентрация кортизола — 3 -10 8 М и адреналина — 5 -10 8 М), поверхность деформирована, видны домены, атомно-силовая микроскопия (а); профиль поперечного сечения (б)
3. Инфракрасная спектроскопия теней эритроцитов
Тени эритроцитов получали после их гемолиза в гипотоническом фосфатном буфере рН 7.35, содержащем по 0.01 М КН2Р04 и Ка2НР04. Тени осаждались с помощью центрифугирования при 5500§. Надосадоч-ная жидкость сливалась. Процедура промывки повторялась еще 4 раза [3]. Все операции и дальнейшее хранение теней осуществлялись при 4 °С.
Пленку для снятия инфракрасных спектров теней эритроцитов готовили в кювете с флюоритовой подложкой путем медленного испарения воды в слабом вакууме при давлении порядка 0.1 атм (~ 0.5 -104 Н/м2) и 4 ± 1 °С [4]. Высушивание проводили в течение 180 мин. Взвесь теней эритроцитов в 0.001М-фосфат-ном буфере рН 7.35 объемом 60 мкл вносили в кювету. Затем добавляли 3 0 мкл того же буфера и 1 мкл раствора гормона с концентрацией 10- М. Перемешивали и инкубировали в течение 10 мин при температуре 16-17 °С.
Кювету располагали строго горизонтально на специальном столике вакуумной установки.
После приготовления пленки кювету переносили в оптическую камеру, продували сухим воздухом в течение 30 мин, а затем включали сканирование прибора. Инфракрасные спектры снимали на спектрометре Specord-M80 (Германия), последовательно опыт и контроль относительно флюоритовой подложки, либо опыт и контроль при получении дифференциального спектра. Интегрирование, определение частоты полос спектров и математическую обработку проводили с помощью специальных программ, прилагаемых к прибору.
Анализ инфракрасных спектров теней эритроцитов крыс при добавлении к ним кортизола показал увеличение интенсивности полос поглощения СО- (1655.2 см-1) и !ЧН-связей (1548 и 3 290 см-1) примерно на 20 %, причем этот эффект возрастал с повышением концентрации гормона (табл. 1). Усиление интенсивности полосы 1655.2 см-1 свидетельствует об увеличении упорядочен-
Таблица 1
Инфракрасная спектроскопия эритроцитарных мембран после их взаимодействия с гормонами стресса
Название соединения vco,см 1 V nh вал., СМ 1 vc=o> см 1 Vp=о,см Vp-о-с>см 1 WO5C4 -C5O4, см 1 Vch вал., см 1 O C
Тени (контроль) 1 655.4 1 686.0 3 308.0 1 748 1 236 1 080.0 1 056.0 2 948.0 2 930.0 2 848.0 12.150
Тени + кортизол (А = 4.4 -10-8 М) 1 655.2 3 290.4 3 308.0 1 743 1 236 1 080.0 1 051.2 2 924.2 2 848.9 15.169
Тени + кортизол (А = 1.05 -10-7 М) 1 656.0 1 630.0 3 280.0 3 300.0 1 740 1 239 1 083.7 2 962.0 2 925.0 2 852.0 15.640
Тени + кортизол (А = 2-10-7 М) 3 280.0 3 296.0 2 952.5 2 931.4 2 920.0 2 853.8
Тени + норадреналин (А = 1.8-10-7 М) 1 654.0 3 271.0 3 300.0 1 730 1 246 1 096.0 1 072.0 2 952.0 2 928.0 2 852.0
Примечание. Лсо — интегральная интенсивность полосы поглощения vco пептидной связи в полулогарифмической форме.
ности в мембранных белках, обусловленным структурным переходом клубок ^ а-спираль [5].
Обнаружен сдвиг валентных колебаний пептидной связи (ЫН-связи) 3 308 ^ 3280 см-1 (Дv = 28 см-1), а также увеличение ее интенсивности, что обусловлено образованием водородной связи между кортизолом и ЫН-связью белков. Вероятнее всего она образуется между кетогруппой А-кольца гормона (С3 = 0) и ЫН-связью мембранного белка, хотя и кетогруппа при С20 Д-коль-ца, а также ОН-группа при С11 С-кольца тоже могут участвовать в образовании водородных связей. Кортизол является производным холестерина, но наличие двух кето- и трех гидроксигрупп существенно изменяет взаимодействие его с поверхностью мембраны эритроцитов по сравнению с холестерином [6]. Последний глубоко проникает в структуру мембраны и усиливает гидрофобные взаимодействия между цепями жирных кислот фосфолипидов. Кортизол действует на поверхности. Интерес представляют сдвиги валентных колебаний СН-связей: 2 848 ^ 2 852 см-1 (Ду = 4 см-1) и 2930 ^ 2925 см-1 (Ду = 5 см-1). Последняя увеличивала также свою интенсивность под влиянием гормона. Изменение интенсивности этой полосы подтверждает наличие структурного перехода порядок ^ порядок под влиянием кортизола, но не позволяет дифференцировать, где происходит такой переход: в мембранных белках или в фосфолипидах, т.к. СН-связь содержится как в белках, так и в фосфолипидах.
Наблюдали увеличение интенсивности полосы поглощения С=О-связи фосфолипидов, а также ее сдвиг 1748 ^ 1740 см-1. Это увеличение интенсивности полосы свидетельствует о повышении упорядоченности высших карбоновых кислот и снижении энтропии в фосфо-
липидах. Сдвиг полосы обусловлен образованием водородной связи между гормоном, возможно, ОН-группой при С21 и СО-связью фосфолипидов. Подобное взаимодействие гормона одновременно с белком и фосфолипидами происходит на границе раздела белков и фосфолипидов, что усиливает липид-белковые взаимодействия и приводит к образованию сложных доменов, обнаруженных с помощью атомно-силовой микроскопии (рис. 3-8). Выявлены сдвиг частоты Р=О-связи на 3 см-1 в коротковолновую область и некоторое увеличение ее интенсивности. Это объясняется дегидратацией мембран в процессе их деформации (сжатия) под влиянием гормона. Именно потеря связанной воды и приводит к увеличению частоты Р= 0-связи [7]. Вытеснение диполей воды из липид-белковых доменов в смежные участки объясняет появление в них мезополос с растягивающим гидростатическим напряжением (рис. 4).
Известно, что 30 % мембранных белков приходится на спектрин [8]. Можно считать, что дополнительная деформация мембран будет происходить за счет спект-рин-актин-анкериновой сети, способной к сокращению, которая имеется как на внутренней, так и на внешней поверхности мембраны [9].
Этот механизм деформации эритроцитарной мембраны играет более существенную роль при взаимодействии ее с адреналином и норадреналином. Так, на поверхности эритроцитарных мембран ранее был обнаружен адренорецептор и холинорецептор [10]. С помощью спектроскопии электронного парамагнитного резонанса показано, что в эритроцитарных мембранах (тенях) под влиянием адреналина или карбохола (аналог холина) происходит деформация (сокращение) эритроцитарных мембран. Эффект сокращения снимался при действии
цитохалазина, стабилизирующего спектрин. Позднее с помощью инфракрасной спектроскопии было показано, что карбохол и адреналин вызывают изменение вторичной структуры этих белков. В данном исследовании мы также наблюдали подобный эффект на эритроцитарных мембранах, обусловленный действием адреналина и норадреналина. Суммарный эффект действия всех гормонов представлен в табл. 1.
Вклад белка в инициацию структурных переходов в эритроцитарных мембранах и их деформацию под влиянием гормонов удалось наблюдать с помощью флюоресцентного анализа. С этой целью в работе использовали эффект как поглощения света, так и тушения собственной флюоресценции триптофана при изменении вторичной структуры белков.
4. Флюоресцентный анализ теней эритроцитов
Измерения флюоресценции проводили на спектро-флюориметре Shimadzu RF-5301(PC)SCE. В кварцевую кювету размерами 1 х 1 х 4 см наливали 4 мл гипотонического фосфатного буфера, содержащего по 0.01 М KH2PO4 и Na2HPO4, рН 7.35, и тени эритроцитов. Концентрацию белков теней определяли методом Варбурга и Кристиана по изменению оптической плотности взвеси [11]. В среднем она колебалась в пределах 0.10-0.25 мг/мл.
Кювета со взвесью теней помещалась в термостат спектрофлюориметра на 1 ч. Выход температуры в кювете на стационарный режим контролировали электронным термометром. Во всех экспериментах температура в кювете была 36 °С. После выхода температуры в кювете на стационарный режим проводили контрольные измерения интенсивности собственной флюоресценции остатков триптофана в белках мембран. Спектр излучения триптофана снимали в диапазоне 300 нм < X < 400 нм при длине волны возбуждения 281 нм, при этом максимум интенсивности излучения приходился на X - 332 нм. Среднее значение интенсивности излучения получали графически после непрерывного измерения его в течение 4 мин. Спектральная ширина щелей составляла 1.5/10. Спектр поглощения триптофана снимали в диапазоне 220 нм < X < 300 нм при длине волны излучения X = 332 нм. Кортизол растворяли в смеси диметилсуль-фоксид-этанол (1:1 ). Концентрация гормона в исходном маточном растворе составляла 10-3 М. При необходимости данный раствор разбавляли фосфатным гипотоническим буфером до нужной концентрации.
Раствор адреналина и норадреналина с концентрацией 10-6 М готовили в гипотоническом фосфатном буфере. Время инкубации гормонов с тенями составляло 1 ч. Снимали спектры поглощения и излучения, измеряли среднее значение интенсивности излучения и поглощения. Для каждого гормона (кортизол, адреналин и
норадреналин) вычисляли константу связывания Ке по методике [12], стехиометрическую концентрацию связанного гормона Впгж и изменение свободной энергии системы ДG.
Измерения микровязкости мембран эритроцитов проводили также на сперктрофлюориметре Shimadzu RF-5301(PC)SCE. Опытный образец готовили следующим образом. В кварцевую кювету размером 1 х 1 х4 см3 наливали 4 мл гипотонического фосфатного буфера по 0.01 М KH2PO4 и Na2HPO4, рН 7.35, флюоресцентный зонд пирен, тени эритроцитов и необходимое количество гормона. Все компоненты до этого хранили при 4 °С.
Концентрация белка теней в кювете составляла
0.10-1.25 мг/мл, пирена — 7.76-10-6 М. Пирен разводили в этаноле, его исходная концентрация составляла
1.5 -10-3 М. Кювету помещали в термостат спектро-флюориметра на 10 мин, после этого проводили измерения флюоресценции при температуре 36 °С. Перед тем как поставить пробу в термостат спектрофлюориметра, ее энергично встряхивали в течение 1 мин. Для измерения флюоресценции теней при нагружении их другим количеством гормонов каждый раз точно также готовили новую пробу. Такая процедура связана с тем, что пи-рен способствует быстрой деградации мембран эритроцитов.
Для измерения вязкости липидного бислоя вблизи белков (область белок-липидного взаимодействия) использовали длину волны возбуждения X = 281 нм, спектральная ширина щелей была 1.5/5. Для измерения микровязкости липидного бислоя вдали от белков (область липид-липидного взаимодействия) использовали длину волны возбуждения X = 337 нм, спектральная ширина щелей составляла 1.5/3. При этом максимумы интенсивности излучения наблюдались при X = 333 нм (максимум излучения триптофана), X = 374 и 393 нм (виб-ронные пики излучения возбужденных мономеров пи-рена), X = 468 нм (максимум излучения возбужденного димера пирена).
Кортизол, как уже отмечалось, не может проникать глубоко в фосфолипидный бислой и взаимодействует с белками на поверхности клеточной мембраны. Это приводит к существенным изменениям их вторичной структуры и сопровождается снижением максимума поглощения при X = 228 нм. При добавлении гормона в среду инкубации в концентрации 1.82 • 10-7 М интенсивность поглощения снижалась на 30 у.е., что составляло 4.6 % по отношению к контролю (гипохромный эффект). Ги-похромный эффект связывают с переходом молекулы белка из статистического клубка в а-спираль [13], т.е. речь идет об увеличении упорядоченности его структуры.
Спектр поглощения макромолекул, имеющих упорядоченное строение в возбужденном состоянии, отра-
Таблица 2
Характеристики связывания гормонов стресса с эритроцитарными мембранами
Гормон Константа связывания Kс, M 1 Количество связанного гормона Bmax, моль/мг белка Изменение свободной энергии Гиббса AG, кДж/моль
Кортизол (1.23 ± 0.12) • 106 (4.69 ± 0.47) •Ю-10 -30.0
Адреналин (6.3 ± 0.63) •ІО6 (1.6 ± 0.16) • 10-11 -40.2
Норадреналин (1.7 ± 0.17) •ІО6 (8.10 ± 0.81) •Ю-10 -36.9
жает взаимодействие между возбужденными мономерными звеньями и существенно зависит от их пространственного расположения внутри молекулы.
О структурных переходах в белках при взаимодействии кортизола с эритроцитарными мембранами говорят также кривые тушения флюоресценции триптофана. Максимум снижения флюоресценции отмечался при концентрации гормона в среде инкубации 11.6 • 10-8 М при содержании белка 0.256 мг/мл, AF составляло 34 у.е., т.е. 11 % по отношению к контролю.
На основе данных тушения флюоресценции триптофана были рассчитаны константы связывания гормона Kc, количество связанного гормона Bmax и изменение свободной энергии AG при взаимодействии кортизола с эритроцитарной мембраной (табл. 2). Оказалось, что Kc для кортизола составляет (1.23 ± 0.12) -106 М-1. Аналогичная величина для транскортина (специфического рецептора) равна 3 • 107 М-1 [14], т.е. на порядок выше. Однако даже в норме 6-8 % гормона находится в связанном с клетками крови состоянии. Это, главным образом, эритроциты. В условиях стресса данная величина может существенно увеличиваться. Проведенные расчеты показали, что максимальное насыщение гормоном эритроцитарных мембран Bmax in vitro составляет (4.7 ± 0.47) • 10-10 моль/мг белка, т.е. достаточно низкая величина (табл. 2). При взаимодействии кортизола с эри-тоцитарными мембранами значение свободной энергии всей системы AG снижается на величину 30 кДж/моль. Это говорит о том, что под влиянием гормона степень упорядоченности структурных компонентов мембран эритроцитов возрастает, а их энтропия снижается.
Аналогичные результаты получены и для двух других гормонов стресса: адреналина и норадреналина. Ги-похромный эффект для обоих гормонов выражен даже в большей степени, чем у кортизола (табл. 2). Это говорит об увеличении упорядоченности структуры мембранных белков в связи с переходом клубок ^ Р-струк-тура ^ а-спираль. Снижение поглощения может быть связано с изменением направления дипольных моментов квантовых переходов мономерных остатков белков, сопровождающим переход их в другую конформацию.
В связи с высокой собственной флюоресценцией гормонов выяснить их влияние на тушение флюоресценции триптофана не представляется возможным. Однако на основе измерений эффектов поглощения для
Концентрация кортизола, 10-8 М
Концентрация адреналина, 10-9 М
Концентрация норадреналина, 10-8М
Рис. 9. Изменение относительной микровязкости мембран в области липид-липидного (1) и белок-липидного (2) взаимодействия теней эритроцитов под действием гормонов: кортизола (а), адреналина (б), норадреналина (в). Концентрация теней С = 0.128 мг белка/мл. Концентрация пирена во взвеси — 7.7 • 10-6 М, температура образцов — 36 °С, рН взвеси 7.35
адреналина и норадреналина рассчитаны Кс, Втах и ДG. В целом они оказались того же порядка, что и у кортизола. У адреналина выше оказалась Кс, ниже количество связанного гормона Втах и более значительные изменения ДG (-40.2 кДж/моль). Последний факт говорит о том, что адреналин в большей степени, чем другие гормоны, повышает степень упорядоченности структурных компонентов эритроцитарных мембран. Он обеспечивал также больший эффект деформации эритроцитарных мембран, что согласуется с данными атомно-силовой микроскопии (рис. 6).
Структурные переходы в эритроцитарных мембранах под влиянием гормонов стресса чрезвычайно важно было связать с изменением их эластичности и вязкости.
При добавлении к теням эритроцитов кортизола, адреналина и норадреналина происходило увеличение микровязкости эритроцитарных мембран (рис. 9). Эффект был более выраженным в присутствии норадре-налина (на 60 %) и менее выраженным в присутствии адреналина (на 40 %) и кортизола (на 25 %). Однако у адреналина повышение микровязкости мембран отмечалось при значительно меньшей концентрации гормона в среде инкубации. В данном случае выход на плато происходил при концентрации адреналина 1.7 • 10-9 М, норадреналина и кортизола — 7 -10-8 М. Микровязкость в области липид-белковых взаимодействий для всех гормонов увеличивалась при меньших концентрациях и была более выраженной, чем в области липид-липидных взаимодействий (рис. 9). Увеличение микровязкости эритроцитарных мембран коррелировало с уменьшением поглощения триптофана в мембраносвязанных белках. Рассмотренные данные позволяют считать, что структурные переходы в эритроцитарных мембранах под влиянием гормонов стресса инициируются в большей степени в белках и в меньшей степени в липидах.
5. Общность структурных изменений в биологических мембранах и наноструктурных твердых кристаллах в полях внешних воздействий
Биологические мембраны — это жидкие кристаллы, обладающие низким уровнем межмолекулярных связей и низкой сдвиговой устойчивостью. При изменении температуры, pH среды, электролитного состава, под влиянием биологически активных соединений и других факторов в них возникают структурно-фазовые переходы типа смектик А ^ смектик С, смектик ^ холестерик, нематик ^ изотропное состояние. В мембраносвязанных белках важную роль играют переходы клубок ^ а-спираль, клубок ^ Р-структура. Эти структурные переходы отражаются не только на вязкоупругих характеристиках и физико-химических свойствах биологических мембран, но и на свойствах трансмембранных пере-
носчиков, рецепторов гормонов и мембраносвязанных ферментов, т.е. на жизненно важных функциональных характеристиках клетки.
Выше было показано, что при действии стероидных гормонов на эритроцитарные мембраны изменяются механизмы их структурной самоорганизации, присущие клеткам в нормальном функциональном состоянии. Активные СО-, ЫН- и ОН-группы гормонов стресса взаимодействуют с СО- и ЫН-группами как белков, так и фосфолипидов биологических мембран. При этом формируются сложные белково-липидные доменные кластеры, в которых усиливаются «сжимающие» гидрофобные взаимодействия. Молекулярно-связанная вода вытесняется в смежные области. Возникает доменная структура со слабыми границами раздела. Последние формируют подвижные наноструктурные границы, по которым происходит разрушение биологических мембран. В результате появляются многочисленные поры и мезополосы локализованной пластической деформации (рис. 4-6). Качественно подобная картина изменения структурных состояний наблюдается в наноструктурных твердых кристаллах в полях внешних воздействий [15-19].
В [15, 16] исследовано изменение структурного состояния тонких фольг высокочистого алюминия А999, закрепленных на плоских образцах технического алюминия А7, при интенсивной пластической деформации знакопеременным изгибом. В композите А999/А7 образец алюминия А7 деформировался упруго. При небольших степенях пластической деформации в образце А999 формировались обычные дислокационные сетки (рис. 10, а). Однако при N = 4 -105 циклов в сильнонеравновесном материале развивалась доменная структура (рис. 10, б), границы которой представляли собой наноструктурированные фазы, имеющие очень высокую подвижность. Ширина фазовых границ составляла 200-300 нм, размер структурных элементов внутри границы — 30-50 нм. В переменном градиентном поле внутренних напряжений наноструктурированные фазовые границы легко перемещались. Такая вязкоупругая среда при сопряжении с упругонагруженной подложкой испытывала упорядоченную экструзию в виде твидовой структуры (рис. 10, в). При N = 17.5 -106 циклов в полосах локализованной пластической деформации развивалась пористость, которая завершалась разрушением фольги А999 при ее откреплении от подложки (рис. 10, г).
Представленная на рис. 10 эволюция структуры кристаллической пленки алюминия А999 при циклическом нагружении композита А999/А7 качественно подобна изменению структуры биологической мембраны при ее взаимодействии с гормонами стресса (рис. 48). Это вполне понятно. Биологические мембраны разделяют гидростатически замкнутые жидкокристалли-
Рис. 10. Композит А999/А7, толщина фольги А999 h = 170 мкм, Т = 293 К: а — дислокационные сетки, просвечивающая электронная микроскопия, N = 103 циклов [16]; 6—доменная структура, темнопольное изображение в рефлексе [111], угол наклона фольги в гониометре равен 6.5°, N = 4-105 [16]; в — твидовая структура экструдированных шаровых выступов материала на лицевой поверхности фольги, N = 2.9 • 106 циклов, растровая электронная микроскопия [16]; г — образование микропор в мезополосах локализованной пластической деформации, N= 17.5 -106 циклов [15]
ческие среды. В нормальном состоянии клетки ее наружная мембрана имеет заданный объем, определяемый поверхностью гидростатически замкнутой жидкокристаллической плазмы. При проникновении в стенку мембраны гормонов стресса ее объем увеличивается. Это при неизменном объеме гидростатически замкнутой среды вызывает гофрирование мембраны с формированием твидовой структуры. Структурно-фазовое взаимодействие гормонов с белково-липидной стенкой мембраны формирует в ней доменную структуру с гидростатическим сжатием внутри доменов и гидростатическим растяжением на их границах. Учитывая гидро-фобность гормонов стресса и избыточное содержание на границах доменов молекулярно-связанной воды, гидростатическое растяжение вещества мембраны на границах ее доменной структуры может приводить к нарушению ее сплошности.
Таким образом, взаимодействие эритроцитарной мембраны с гормонами стресса оказывает двоякое влияние на их структуру: увеличение структурных связей (переход порядок ^ порядок) и усиление характеристик
упругости [18]. Однако возрастание вязкости эритро-цитарных мембран при их взаимодействии с гормонами стресса определяет верхний предел допустимых стрессовых воздействий. Выше этого предела высокая вязкость эритроцитов не позволяет им проходить через капиллярное русло, и при сильном формоизменении будут наблюдаться их остановка и частичное разрушение по границам доменной структуры.
Подробное термодинамическое обоснование подобия поведения алюминиевой фольги А999 в композите А999/А7 при интенсивной циклической деформации и биологических мембран при их взаимодействии с гормонами стресса приведено в [18].
Следует подчеркнуть, что в основе термодинамической общности структурно-фазового поведения биологических мембран и сильнонеравновесных наноструктурных пленок лежит общность их наноструктурного состояния. Согласно [19] в конденсированных системах вблизи нуля их термодинамического потенциала Гиббса Г(т>) = 0 (где V — молярный объем) возникает предпе-реходное двухфазное наноструктурное состояние, в ко-
тором под действием внешних полей или введения лигандов могут происходить структурно-фазовые превращения и возникать совершенно новые структуры.
Двухфазные жидкокристаллические биологические мембраны находятся в наноструктурном состоянии изначально. Это необходимо для обеспечения их высокой текучести («жидкостности»). Твердые тела характеризуются сильным межатомным взаимодействием и высокой стабильностью их кристаллической структуры. Это обеспечивается высоким значением их отрицательного термодинамического потенциала Гиббса. Однако если твердое тело сильно вывести из термодинамического равновесия и обеспечить близость к нулю его термодинамического потенциала Гиббса, то в нем также возникают предпереходные двухфазные наноструктурные состояния [19]. При механическом воздействии твердые тела в наноструктурном состоянии проявляют сверхпластичность.
В то же время конденсированная среда испытывает структурный распад, если в ней в локальных зонах термодинамический потенциал Гиббса оказывается больше нуля. Это определяется условием V > vcr, где vcr соответствует молярному объему, при котором Р (рст) = 0. Именно это условие лежит в основе разрушения биологических мембран по границам доменов при сильном воздействии гормонов стресса. Это же условие вызывает хрупкость наноструктурных материалов, если в них возникают локальные зоны с V > vcr.
Проведенный выше анализ общности структурного и механического поведения биологических мембран и наноструктурных материалов имеет важное методологическое значение: он позволяет использовать многоуровневые подходы физической мезомеханики для более глубокого понимания сложных процессов, постоянно протекающих в биологических мембранах, которые традиционно описываются только на основе физикохимических представлений.
Перечислим ряд положений физической мезомеха-ники, которые необходимо учитывать при описании влияния стероидных гормонов на функциональное поведение эритроцитов в кровеносной системе живого организма.
1. Встроенные в фосфолипидный бислой биологической мембраны белки в механике рассматриваются как армирующие элементы в композиционном материале. Их специфическая роль связана с возможностью изменения внутренней структуры белка и его упругих характеристик при взаимодействии с гормонами стресса (адреналин, норадреналин). Это позволяет гибко варьировать вязкоупругость эритроцитарных мембран в капиллярном русле.
2. Твидовая структура гофрированной поверхности биологических мембран с позиции мезомеханики многофункциональна: она повышает формоустойчивость
клетки, гибко меняется и обеспечивает модуляцию растягивающих гидростатических напряжений на интерфейсе «эндотелиальная клетка капилляра - закрученный эритроцит».
3. Формирование трансмембранных каналов и зигзагообразная структура хвостов жирных кислот в фосфо-липидном бислое обеспечивают каналированный мас-соперенос многих ингредиентов по схеме нелинейных волн в полях гидростатических напряжений.
Мы полагаем, что локальные структурные превращения в биологических мембранах не могут быть описаны только на основе физико-химических представлений. Они составляют самый низкий структурномасштабный уровень процессов, которые самосогласованно развиваются в клетке как в многоуровневой иерархически организованной системе.
Перечисленные многоуровневые подходы физической мезомеханики являются необходимыми, но недостаточными для описания многоуровневых иерархически организованных биологических систем. Их объединение с классическими подходами биохимии и молекулярной биологии проводится в настоящее время в СО РАМН и СО РАН. Подробное изложение мезомеханики наноструктурных переходов в мембранах эритроцитов и их разрушения при взаимодействии с гормонами стресса будет представлено в следующей работе.
6. Заключение
Известно, что гормоны стресса (кортизол, адреналин, норадреналин) в организме участвуют в усилении энергетического обмена. В этом заключается их основная роль в реализации различных механизмов адаптации в субэкстремальных и экстремальных условиях существования. Данная функция гормонов в настоящее время хорошо изучена. Однако мы до сих пор плохо представляем себе многочисленные побочные эффекты действия этих гормонов. В литературе достаточно подробно обсуждается катаболическое действие их в организме, но совершенно не изученными остаются неспецифические механизмы действия [20]. В данной работе показано, что к ним следует отнести важное влияние гормонов стресса на структуру цитоплазматических мембран клеток периферической крови, в первую очередь эритроцитов. Эта задача приобретает особенно большое значение, когда речь идет о хроническом стрессе. Для человека особенную важность приобретает длительное психоэмоциональное напряжение на фоне развития тревожности, когда содержание адаптивных гормонов в крови увеличивается многократно. В этих условиях масштаб их взаимодействия с эритроцитарными мембранами существенно увеличивается и значительно повышает допустимые нормы.
Важную роль в данном механизме играют водородные связи, гидрофобные и электростатические взаимо-
действия. Известно, что кортизол является гидрофобным соединением, он плохо растворим в воде. Однако в его структуре присутствуют три ОН-группы (в 11, 17 и 19 положении) и 2 кетогруппы (в 3, 18 положении). Именно они принимают участие в образовании водородных связей с СО- и КН-группами мембраносвязанных белков и фосфолипидов. Это приводит к тому, что при участии кортизола на поверхности эритроцитарных мембран формируются белково-липидные домены, в которых развиваются «сжимающие» гидростатические напряжения. Диполи воды начинают вытесняться в смежные области мембраны. Этому способствует усиление гидрофобных взаимодействий за счет дополнительных двух СН3-групп (в 10 и 11 положении) и гидрофобных колец самого гормона. Избыточное содержание воды на границах доменов и возникновение в этих зонах «растягивающих» гидростатических напряжений формируют на поверхности эритроцитов мезополосы, разрыхляющие мембрану (рис. 4-6). При этом в целом жесткость мембраны возрастает, особенно в области липид-белковых взаимодействий. Степень структурной упорядоченности мембран увеличивается, а свободная энергия системы ДG уменьшается (табл. 2). Такие эритроциты уже не могут выполнять свои функции в полном объеме. Более того, в капиллярной сети они способны образовывать многочисленные мелкие тромбы, разрушаться и приводить к развитию гипоксии и, возможно, инфаркту.
Качественно подобно влияет на структурное состояние эритроцитов их взаимодействие с адреналином и норадреналином. Так, адреналин обладает еще большим сродством к эритроцитарным мембранам. Однако в целом механизм структурных переходов в мембранах под влиянием данного гормона практически тот же самый, что и у кортизола. На это указывают результаты инфракрасной спектроскопии (табл. 1). В молекулу адреналина входят три ОН-группы, способных участвовать в образовании водородных связей, 1КН-группа, имеющая положительный заряд, и смежная СН3-группа, усиливающая влияние этого положительного заряда, т.е. действуют те же самые силы. Однако они дополняются действием спектрин-актин-анкериновой сети, которое может усиливаться при взаимодействии адреналина с его мембранным рецептором. При атомно-силовой микроскопии эритроцитов в присутствии адреналина видно образование крупных доменов, возвышающихся над поверхностью эритроцита, на границах которых находятся участки очень рыхлого вещества. Вероятно, это участки с избыточным содержанием молекулярной воды. Увеличенный молярный объем вещества на границах доменов превышает критические размеры, выше которых конденсированное состояние сохраняться не может и разрушается. Поверхностное натяжение в упорядоченных зонах доменов обусловливает их кривизну и образование
на границах сквозных пор. Близкая картина получена и для норадреналина.
Таким образом, можно утверждать, что кортизол и катехоламины на эритроцитарные мембраны действуют как синергисты. Кроме того, существует еще аддитивный эффект. Все адаптивные гормоны повышают жесткость эритроцитарных мембран и могут вызывать развитие гипоксии при прохождении ими капиллярного русла в тканях. Данный механизм может быть причиной возникновения «коронарного синдрома X», приводящего нередко к сердечно-сосудистым катастрофам (инфарктам, инсультам).
Использование в биологии и медицине принципов и закономерностей, вскрытых в физической мезомеха-нике, позволяет понять и математически описать механизмы взаимосвязи структуры и функции биологических мембран как в норме, так и при патологии. Развитие системной патологии биологических мембран, обусловленной структурными переходами в условиях повышения температуры, действия радиационных и волновых факторов, токсических химических соединений и т.д., понимание их физико-химической природы позволяют не только глубже раскрыть патогенез многих заболеваний, но и разработать системы превентивных мероприятий.
Работа выполнена при финансовой поддержке проектов СО РАН (№№ Ш.20.1.1 и 4).
Литература
1. Панин Л.Е., Панин В.Е. Эффект «шахматной доски» и процессы массопереноса в интерфейсные средах живой и неживой природы // Физ. мезомех. - 2007. - Т. 10. - № 6. - С. 5-20.
2. Binnig G., Quate C.F., Gerber Ch. Atomic force microscope // Phys. Rev. Lett. - 1986. - V. 56. - No. 9. - P. 930-933.
3. Dodge J.T., Mitchell C., Hanahan D.I. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes // Arch. B^hem. B^hys. - 1963. - V. 100. - No. 1. - P. 119-130.
4. Kunitsyn V.G., Panin L.E., Polaykov L.M. Anomalous change ofvisco-
sity and conductivity in blood plasma lipoproteins in the physiological temperature range // Int. J. Quantum Chem. - 2001. - V. 81. -No. 5. - P. 348-369.
5. Miyazawa T., Blout E.R. The infrared spectra of polipeptides in various conformations: amid I and II bands // J. Am. Chem. Soc. - 1961. -V. 83. - No. 3. - P. 712-719.
6. Некое В.Г., Берестоеский Г.Н. Динамическая структура липидного
бислоя. - М.: Наука, 1981.
7. СеменоеM.A., Гасан А.И., Больбух Т.В., МалеееВ.Я. Гидратация и структурные переходы ДНК из Micrococcus lysodeiktucus в пленках // Биофизика. - 1996. - Т. 41. - № 5. - С. 1007-1016.
8. Leto T.L., Marchesi VT. A structural model of human erythrocyte protein 4.1 // J. Biol. Chem. - 1984. - V. 259. - No. 7. - P. 46034608.
9. Раlek J., Sahr K.E. Mutations of the red blood cell membrane proteins: from clinical evaluation of the underlying genetic defects // Blood. - 1992. - V. 80. - N. 2. - P. 308-320.
10. Huestis W.H., McConnell H.M. A functional acetylcholine receptor in the human erythrocyte // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1974. - V. 57. - No. 3. - P. 726-732.
11. Dawson R.M.C., Elliot D.C., Elliot W.H., Jones K.M. Data for biochemical research. - Oxford: Clarendon Press, 1986. - 580 p.
12. AttalahN.A., Lata G.F. Steroid-protein interactions studied by fluorescence quenching // Biochem. Biophys. Acta. - 1968. - V. 168. -P. 321-333.
13. Оои Т., Ицука Э., Онари С. Биополимеры. - М.: Мир, 1988. -554 с.
14. СергеееП.В., Галенко-ЯрошеескийП.А., ШиманоескийН.Л. Очерки биохимической фармакологии. - М.: Фарммединфо, 1996. -384 с.
15. Панин В.Е., Егорушкин В.Е., Панин А.В. Эффект каналирования пластических сдвигов и нелинейные волны локализованной пластической деформации и разрушения // Физ. мезомех. - 2010. -Т. 13. - № 5. - С. 7-26.
16. Панин В.Е., Сурикоеа Н.С., Елсукоеа Т.Ф., Егорушкин В.Е., Почи-еалое Ю.И. Наноструктурированные фазовые границы в алюми-
нии при циклической интенсивной пластической деформации // Физ. мезомех. - 2009. - Т. 12. - № 6. - С. 5-15.
17. Панин В.Е., Егорушкин В.Е. Физическая мезомеханика и неравновесная термодинамика как методологическая основа наноматериаловедения // Физ. мехомех. - 2009. - Т. 12. - № 4. - С. 7-26.
18. Panin V.E., Panin L.E., Egorushkin VE. Physical Mesomechanics for Biological and Nanostructural Materials // Proc. Int. Conf. on Me-somechanics «Multiscaling of Synthetic and Natural Systems with Self-Adaptive Capability / Ed. by G.C. Sih, C.K. Chao. - Taipei, Taiwan: Natural Taiwan University of Science and Technology, 2010. -P. 23-26.
19. Панин В.Е., Егорушкин В.Е. Наноструктурные состояния в твердых телах // ФММ. - 2010. - Т. 110. - № 5. - С. 486-496.
20. Панин Л.Е., Усенко ГА. Тревожность, адаптация и донозологичес-кая диспансеризация. - Новосибирск: Изд-во СО РАМН, 2004. -315 с.
Поступила в редакцию 02.12.2010 г.
Сведения об авторах
Панин Лев Евгеньевич, д.м.н., ак. РАМН, проф., дир. НИИ биохимии СО РАМН, [email protected] Мокрушников Павел Валентинович, к.ф.-м.н., снс НИИ биохимии СО РАМН, [email protected] Куницын Валерий Георгиевич, д.б.н., внс НИИ биохимии СО РАМН, [email protected]
Панин Виктор Евгеньевич, д.ф.-м.н., ак. РАН, проф., советник РАН, зав. лаб. ИФПМ СО РАН, [email protected] Зайцев Борис Николаевич, к.ф.-м.н., внс ГНЦ ВБ «Вектор», [email protected]
