CC BY
16
ОСНОВНЫЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЕФЕРЕНС-ШТАММОВ БАКТЕРИИ ORNITHOBACTERIUM ЯНШОТЕДСНЕДЬЕ
Курьянова Назия Хусаиновна
Канд. биол. наук, доцент кафедры технологии производства переработки и экспертизы продукции АПК, Технологический институт (ф) «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», г. Димитровград
Бактерии вида ОгтШоЬаСегшт гЫпойасЬеак сравнительно недавно признали в качестве патогенного возбудителя заболевания респираторных путей у значительного числа цыплят и индеек.
В статье описаны результаты исследований по изучению тинкториальных, культуральных и биохимических свойств бактерий вида ОгтШоЪайегшш гЫпойасИеак -возбудителей орнитобактериоза птиц.
Цель и задачи исследования
Цель изучить основные биологические свойства бактерий вида ОгтШоЬайегшт гЫпойа^еак на рефе-ренс-штаммах К 282 и К 33, полученных из музея НИИЦ-МиБ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА», для изучения
возможности создания инактивированной вакцины против орнитобактериоза птиц.
Изучение биологических свойств бактерий вида ОгтШоЬаСегшш гЫпойасИеак проводилось по классическим методикам [1].
Результаты исследований
Тинкториальные свойства бактерий ОгтШоЬа-йегшт гЫпо1гаЛеа1е устанавливали путем микроскопии под иммерсионной системой мазка суточной культуры, окрашенной по Грамму. Результат микроскопического исследования мазка бактерий О. гЫпо^аЛеак, окрашенного по Грамму представлен на рисунке 1.
'А-
Рисунок 1. Окраска по Грамму референс-штамма O. rhinotracheale К 282 увеличение ><100*15
Микроскопию проводили методом негативного контрастирования 1,5% фосфорно-вольфрамовой кислотой (ФВК). Просматривали препараты на микроскопе HV-12A (фирмы Hitachi) при ускоряющем напряжении 75 кВ и увеличении 35*103. Фиксировали культуру 2%-ным раствором OsO4. Результаты электронного микроскопии, представленные на рисунке 3 дают характерную информацию морфологии данного микроорганизма.
Для изучения культуральной характеристики использовали тесты, которые наиболее полно характеризуют ферментативные свойства бактерий вида Ornitho-bacterium rhinotracheale. По результатам исследования получили следующие результаты: во-первых, интенсив-
ное синие окрашивание дисков при исследовании на окси-дазу (HiMedia) (рисунок 2) свидетельствует о положительной их реакции на цитохромоксидазу; индол и сероводород они не образуют; при добавлении метилового красного кислоту не образуют и окрашивание среды остается желтого цвета; на среде Симмонса цитрат не утилизируют; фермент ДНК-аза не деполимеризует ДНК вокруг культуры и цвет среды остается без изменений (рисунок 3). При ферментации углеводов производят слабое сбраживание (интенсивное синее окрашивание по ходу укола практически без изменения цвета среды) лактозы, сахарозы (рисунок 4), глюкозы (рисунок 5), мальтозы, маннит, маннозы.
Рисунок 2. Положительный результат теста на оксидазу референс-штамма O. rhinotracheale К 282
Рисунок 3. Отрицательный результат теста на ДНКазу референс-штаммов О. гЫпо^аЛеак К 282 и К 33
(слева направо)
Рисунок 4. Положительный результат теста на сахарозу референс-штаммов О. гЫпойаЛеак К 282 и К 33 (слева направо по 2 пробирки)
Рисунок 5. Положительный результат теста на глюкозу референс-штаммов О. гЫпо^аЛеак К 282 и К 33 (слева направо по 2 пробирки)
^ на сероводород - результат отрицательный (черного осадка нет), ^ на орнитин - результат положительный (синее окрашивание).
Таблица 1
Показатели исследований на биохимические свойства референс штаммов бактерий ОгшПюЬас^пит г1што1гасИса1с
При изучении биохимических свойств бактерий ОгпШоЪайсгшт гЫпойасИсак на тест - системе по ускоренной типизации, произведенные ФГУН НИИЭМ им. Пастера получены следующие результаты (рисунок 6):
Наименование тестов ОгтШоЬайегшт rhinotrachea1e К 282 ОгтШоЬаСепит гЫпойаЛеак К33
Каталаза - -
Оксидаза + +
Индол - -
Сероводород - -
метиловый красный - -
утилизация цитрата - -
ДНКаза - -
О/Р + +
Лактоза + +
Сахароза + +
Глюкоза + +
Мальтоза + +/-
Гемолиз - -
Манноза + +
Маннит + +
^ на лизин - результат отрицательный (сине-зеленой
окраски нет), ^ на аргинин - результат отрицательный (зеленого
или синего окрашивания нет), ^ на уреазу - результат отрицательный (малинового
окрашивания нет), ^ на индол - результат отрицательный (красное кольцо отсутствует),
^ на арабинозу - результат отрицательный (окрашивание малиновое), ^ на маннозу - результат положительный (окрашивание желтое),
^ на сахарозу - результат положительный (окрашивание желтое), ^ на глюкозу - результат положительный (окрашивание желтое),
^ на маннит - результат положительный (окрашивание желтое),
^ на адонит - результат отрицательный (окрашивание малиновое),
^ на сорбит - результат отрицательный (окрашивание малиновое), ^ на лактозу - результат положительный (окрашивание желтое).
Рисунок 6. Планшет с результатами тест-системы по изучению биологических свойств бактерий вида Ormthobacterшm
гЫпсйасЬеак (референс-штамм O. rhinotracheale К 282)
Таблица 2
Показатели ферментативной активности бактерий Ormthobacterшm rhinotracheale по тест - системе _для ускоренной типизации (ФГУН НИИЭМ им. Пастера)_
Наименование тестов Ornithobacterшm rhinotracheale К 282 Ormthobacterшm rhinotracheale К33
Сероводород - -
орнитиндекарбоксилаза + +
Лизиндегидролаза - -
Аргининдегидролаза - -
Уреаза - -
Индол - -
Арабиноза - -
Манноза + +
Сахароза + +
Глюкоза + +
Маннит + +
Адонит - -
Сорбит - -
Лактоза + +
Определения морфологических и фенотипических факторов на гемолитическую активность проводили на триптозо-соевом агаре (БИко) с добавлением 10 % овечьей и человеческой дефибринированной крови. Для чего культуру предварительно культивировали в течение 48 ч
при 37 0С на бульоне Хоттингера. При изучении гемолитической активности не зависимо от вида донора, чья кровь была использована, зона разрушения эритроцитов не обнаружена (рисунок 6 - 7).
Рисунок 6. Отрицательный результат теста на гемолитическую активность референс-штамма О. rhinotracheale К 282 на триптозо-соевом агаре (р1£ко) с добавлением 10 % человеческой дефибринированной крови (х 4 увеличение)
Рисунок 7. Отрицательный результат теста на гемолитическую активность референс-штамма О. rhinotracheale К 33 на триптозо-соевом агаре (р1£ко) с добавлением 10 % человеческой дефибринированной крови (х 4 увеличение)
Выводы. Путем микроскопии под иммерсионной системой мазка суточной культуры, окрашенной по Грамму, установлены тинкториальные свойства бактерий Ornithobacterшm rhinotrachea1e - это небольшие грамотри-цательные палочки с круглыми концами, спор и капсул не образуют. Опытным путем доказаны ферментативные свойства, отсутствие способности образовывать индол, сероводород и утилизировать цитрат; не зависимо от вида донора гемолитическая активность (разрушения эритроцитов) не выявлена.
Список литературы
1. Васильев Д.А. ПРОБЛЕМЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ОРНИТОБАКТЕРИОЗА / Н.Х. Курьянова, Н.И. Молофеева, Д.А. Васильев // Научный вестник - Димитровград, 2009 - с.170-174.
2. Курьянова Н.Х. ТИНКТОРИАЛЬНЫЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ
ИДЕНТИФИКАЦИИ / Н.Х Курьянова, А.С. Разор-вина, Н.И. Молофеева, Д.А. Васильев // Материалы Международной научно-практической конференции на тему Актуальные вопросы аграрной науки и образования, посвященной 65-летию УГСХА, эпизоотологии, ВСЭ, биотехнологии - Ульяновск, 2008 - с. 155-161.
3. Курьянова Н.Х., БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ ВИДА ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE - ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОРНИТОБАКТЕРИОЗА ПТИЦ Фундаментальные исследования. 2013. № 11-4. С. 679-682.
4. Hinz K.-H., C. Blome, M. Ryll Acute exudative pneumonia and airsacculitis associated with Ornithobacterium rhinotracheale in turkey// Vet. Rec., 1994, 135, p. 233-234.
5. Travers A.F. Concomitant Ornithobacterium rhinotracheale and New-castle disease infection in broilers in South Africa// Avian dis., 1996,40:488-490.
АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ И АНТИВИРУСНЫЕ СВОЙСТВА ТЕОТРОПИНА
Курьянова Назия Хусаиновна
Канд. биол. наук, доцент кафедры технологии производства переработки и экспертизы продукции АПК, Технологический институт (ф) «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», г. Димитровград
Изучение антибактериальных и антивирусных свойств соединений различных классов, с целью разработки новых нетоксичных, высокоэффективных, экологически безопасных консервантов и инактиваторов для изготовления биопрепаратов представляет собой весьма актуальную задачу современной биотехнологии [2,4,6].
Инактивирование с целью получения антигена для вакцин из убитых штаммов микроорганизмов в то же время должно сохранить иммуногенные структуры возбудителя в возможно более неизмененном виде.
Поэтому прикладные исследования в разработке инактивированных вакцин направлены, прежде всего, на постоянный поиск «идеального» способа инактивации.
Для решения этой проблемы необходимо изыскание оптимальных средств и методов, которые бы необратимо повреждали имеющиеся в нуклеиновых кислотах возбудителя структуры и информации, ответственные за размножение, но оставляли контактными антигенные структуры белково-полисахаридных молекул, ответственных за иммуногенность [1,3,5].
Применяемые для этой цели химические соединения типа формальдегида обладают остаточным действием, которое приходится устранять дополнительными реактивами, что усложняет технологию изготовления вакцинных биопрепаратов.
Теотропин - стабильное при хранении и нагревании вещество (плавится без разложения при температуре 194-196°С, стабилен при хранении в сухом виде и температуре не выше 40°С в течение не менее 10 лет - срок наблюдения). Он представляет собой порошок желтоватого цвета со слабым специфическим запахом или без запаха в зависимости от степени очистки. Хорошо растворим в воде (насыщенный раствор имеет концентрацию свыше 50%), спирте, ацетоне, рН 10 %-ого водного раствора в пределах 9,3-9,5. Теотропин не раздражает кожи и слизистых оболочек глаз, дыхательных путей, мочеполовой системы. Для приготовления концентрированных растворов и работы с ними следует использовать резиновые перчатки, для работы с разбавленными растворами специальных мер
предосторожности не требуется, кроме предотвращения приема внутрь больших количеств раствора. При попадании в глаза их следует промыть водой и раствором борной кислоты, поскольку растворы теотропина обладают слабощелочным рН [5,6].
Отсутствие раздражающего и токсического действия теотропина на организм теплокровных животных делает его перспективным препаратом как возможного средства для инактивации вакцинных штаммов микроорганизмов.
Целью наших исследований являлось изучение бактерицидного и бактериостатического действия теотро-пина на микроорганизмы различной морфологической структуры при его применении как возможного инактиви-рующего препарата на производственные штаммы бактерий в технологии изготовления инактивированных вакцин.
Для бактериологического исследования использовали следующие питательные среды и реактивы: мясопеп-тонный бульон (НПО «Питательные среды», г.Махачкала), мясопептонный агар (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), желточно-солевой агар, глюкоза, теотропин.
Бактериостатическую и бактерицидную концентрации теотропина определяли методом их серийных разведений согласно «Методическим указаниям по отбору, испытаниям и оценке антивирусных и антибактериальных химиопрепаратов среди соединений различных химических классов» (Москва, 2004), а также «Методическим указаниям по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.189004».
Концентрацию препарата теотропинав бактериальных суспензиях доводили до следующих величин: 5 мг/мл; 7,5 мг/мл; 10,0 мг/мл. Концентрацию бактерий в 1 мл физиологического раствора доводили до величины 1010 микробных тел по результатам титрования. Данная концентрация бактериальной суспензии не превышает одну дозу инактивированной бактериальной вакцины, что
