ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ПРОИЗВОДСТВА ВИРУСНЫХ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

46

Вестник защиты растений, ,3, 2007

УДК 632.95

ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ПРОИЗВОДСТВА ВИРУСНЫХ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ

ПРЕПАРАТОВ

Е.В. Орловская*, А.С. Тихонова**, М.Б. Кобрин**

*Московский государственный университет леса, Мытищи Московской обл. **Государственный научный центр по антибиотикам, Москва

Представлены данные о разработке опытных производств вирусных препаратов. Обсуждается необходимость введения в вирусные препараты антисептиков - стабилизаторов, обеспечивающих подавление микробных контоминантов.

Известно, что энтомопатогенные вирусы широко распространены в популяциях насекомых вредителей сельского и лесного хозяйства. Во многих странах мира испытываются и применяются вирусные препараты, созданные в основном с использованием бакуловирусов. Еще в 1973 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) признала бакуловирусы безопасными для человека и окружающей среды (Anonimus, 1973) при условии ограниченного присутствия в препаратах посторонней микрофлоры до уровня 107 и недопустимости присутствия в них бактерий Escherichia coli и Salmonella sp.

Технология производства вирусных препаратов включает два основных этапа:

1) культивирование вирусов в насекомых;

2) выделение вирусов из погибших насекомых, их очистка и приготовление товарных форм препаратов.

Первый этап наиболее трудоемок и продолжителен, он может выполняться двумя способами. Первый способ - культивирование вирусов в личинках насекомых, собранных в старших возрастах в природе. Их заражение производится в лаборатории или на территории лаборатории или подыскиваются участки с естественно размножающимися личинками вредителя. Участки обрабатываются вирусной суспензией и через определенное время личинок собирают. Размещают в лаборатории с кормом и после их гибели собирают погибших особей в стерильную тару. Либо собирают погибших особей на зараженном участке и сохраняют при низких температурах (Smirnoff, 1964). Второй способ предусматривает выращи-

вание насекомых на искусственных питательных средах (ИПС) до и после заражения вирусами. Культивирование вирусов в насекомых, выращиваемых на ИПС, интенсивно развивалось во второй половине прошлого века. Наиболее приемлем этот способ для насекомых с коротким циклом развития личиночных фаз, например совок.

Производство на опытной установке трех вирусных препаратов (вирин-ЭНШ, вирин-ЭКС и вирин-АББ) при выращивании личинок на ИПС обеспечило наработку этих препаратов для госиспытаний, которые проводились в течение нескольких лет. Препараты вирин-ЭНШ и вирин-ЭКС были рекомендованы к применению. Однако, после большого количества заявок на приобретение препарата вирин-ЭНШ, стало очевидным, что создать рентабельное производство этого препарата по технологии выращивания гусениц на ИПС очень сложно.

По просьбе Минлесхоза Киргизии было организовано производство препарата вирин-ЭНШ на станции защиты леса. В соответствии с нашим регламентом была применена технология производства ви-рин-ЭНШ без выращивания насекомых в лабораторных условиях.

На первом этапе производства заражение и культивирование вируса ядерного полиэдроза (ВЯП) проводилось в насаждениях фисташки в ущельях, где удобно было проводить сбор погибших от вируса гусениц. Собранные погибшие гусеницы хранились до выделения вирусов в специальной камере при температуре 6±2°С. Выделение вирусов и приготовле-

Вестник защиты растений, ,3, 2007 ние препарата проводилось в лаборатории СТАЗЛ по технологической схеме на стандартном оборудовании. Производство препарата с титром полиэдров 109 в 1 мл достигало 1000 л в год (Орловская, 1988). Для облегчения его пересылки к местам применения вирус сконцентрировали до титра 4-109 полиэдров в 1 мл с получением препарата вирин-ЭНШ(к). Этот препарат также прошел испытания и был рекомендован к применению с меньшим расходом (25 мл/га).

Второй этап состоит из выделения из погибших гусениц вирусной биомассы, ее очистки и приготовления препарата. Технологическая схема процессов последовательная:

- измельчение погибших особей со стерильным физиологическим раствором;

- фильтрация гомогената;

- осаждение полиэдров центрифугированием и удаление надосадочной жидкости.

Второй этап производства вирусных препаратов должен обеспечивать безопасность и эффективность выпускаемых товарных форм препаратов. Поэтому каждый процесс контролировался по показателям титра полиэдров, общего микробного числа (ОМЧ) и состава посторонней микрофлоры. Для механической очистки от посторонней микрофлоры биомасса промывалась физраствором несколько раз. Известно, что при превышении допустимой нормы ОМЧ в вирусных препаратах (более 107/мл) биомассу смешивают с антисептиками. В качестве антисептиков-стабилизаторов были выбраны антибиотик фитобактериомицин (ФБМ), додецилсульфат натрия (ДДС) и хлороформ.

Контроль готового продукта осуществлял изготовитель препарата по методикам, приведенным в регламенте и ТУ на производство препарата, согласованным с Госхимкомиссией, Минздравом и другими организациями. Штамм-продуцент препарата вирин-ЭНШ периодически передавался производителям после его обновления и проверки активности. Этот штамм-продуцент депонирован в ВИЗР за №7 и хранится в коллекции ВИЗР

(Митрофанов, 2002). Контроль за производством выпускаемых энтомопатоген-ных препаратов осуществлялся научно -исследовательскими институтами разных ведомств: Киевским НИИ эпидемиологии и инфекционных болезней им. Громашев-ского, Азовским НИИ рыбного хозяйства, Московской ветеринарной академией им. Скрябина, ВНИИбакпрепарат, МГУЛ и Государственным научным центром по антибиотикам. По данным Ветеринарной академии, обсемененность посторонней микрофлорой 6 изученных вирусных препаратов (вирин-ЭКС, вирин-ЭНШ, вирин-АББ, вирин-ДИПРИОН, вирин-ГЯП и вирин-КШ) варьировала по составу, а в некоторых образцах последних трех препаратов ОМЧ превышало допустимую норму в 1000 раз, в т.ч. и в образцах вирин-ЭНШ после хранения в течение 1 года (Полтев и др., 1984).

Учитывая высокую степень микробной обсемененности в биомассе (полупродукте) препарата вирин-ЭНШ(к), поступившей из Киргизии в виде пасты, была проведена оценка влияния антисептиков-стабилизаторов на снижение посторонней микрофлоры.

При приготовлении стандартных образцов препарата с титром не менее 4-109 полиэдров в 1 мл пасту после механической очистки смешивали с антисептиками, разведенными в стерильном физиологическом растворе, и выдерживали 24 часа при температуре 22°С. После центрифугирования надосадочную жидкость сливали для удаления антисептиков и добавляли в пасту равный объем стерильного 50% глицерина в физиологическом растворе (табл. 1).

Первую часть образцов использовали для изучения состава посторонней микрофлоры после введения антисептиков с целью выбора наиболее активного из них.

Исследование состава контаминантов в пасте препарата вирин-ЭНШ(к) до и после приготовления на ее основе стандартных образцов, обработанных разными антисептиками, свидетельствует о снижении количества видов грибной и неспорообразующей бактериальной фло-

ры и об уничтожении кишечной палочки Escherichia coli во всех вариантах. Наиболее эффективное подавление неспоро-образуюших бактерий отмечено в образце с применением ФБМ. Несколько слабее подавлял бактериальную флору ДДС. При использовании хлороформа значительная часть неспорообразующих бактерий осталась жизнеспособной. Бациллы сохранили жизнеспособность во всех вариантах (табл. 1).

Таблица 1. Качественный состав микрофлоры: А) в биомассе препарата вирин-ЭНШ(к) и Б) в стандартных образцах препарата, приготовленных после обработки антисептиками-стабилизаторами при хранении в течение суток при 22°С

Мик- Микроорганизмы Б)

Выделенные микроорганизмы

роор-гани-змы

А)

ФБМ 2800 ед/мл

ДДС 0.5%

Хлороформ, % "Ш Ö3~

Неспорообразуюшие

Streptococcus faecalis + - - - -

Micrococcus spp. + - - - -

Enterobacter spp. + + - + +

Citrobacter frundii + - + + +

Proteus vulgaris + - - - -

Hafnia alvei + - + + +

Klebsiella spp. + - - + +

Escherichia coli + - - - -

Serratia marcescens + - - - -

Спорообразуюшие

Bacillus spp. + Грибы + + + +

Candida spp. + + + + +

Mucor spp. + - - - -

Aspergillus spp + - - - -

По количественному составу также лучшие результаты получены в варианте с обработкой препарата ФБМ. ОМЧ в этом варианте снизилось в 16 раз. При использовании ДДС ОМЧ снизилось в 11 раз, а при использовании хлороформа ОМЧ снизилось в 6-8 раз. На основании проведенных исследований качественного и количественного состава посторонней микрофлоры в образцах препарата ви-рин-ЭНШ(к), приготовленных после обработки разными антисептиками, был выбран ФБМ как наиболее сильно подавляющий микрофлору. Тем не менее, применение всех трех антисептиков

Вестник защиты растений, ,3, 2007 обеспечивает безопасность препарата для человека вследствие подавления вредной микрофлоры.

Препарат хранили при температуре 6±2°С в течение 20 дней до проведения анализа состава микрофлоры. В другую часть этой пасты после ее механической очистки добавляли стерильный 50% глицерин в физиологическом растворе в присутствии ФБМ или хлороформа (табл. 2).

Таблица 2. Качественный состав сопутствующей микрофлоры из полупродукта (биомассы) и из промышленных образцов препарата вирин-ЭНШ(к) после введения антибиотика фитобактериомицина (ФБМ) или хлороформа _(Х) при хранении при +4-8°С_

Микроорганизмы

Из био мас сы

Из препарата вирин-ЭНШ

ФБМ

Х

1 сут. 1 мес. 1 год

Грамотрицательные

Escherichia coli + +

Enterobacter cloaceae + +

Enterobacter aerogenes* + +

Enterobacter spp. +

Citrobacter frundii* + + +

Citrobacter amalonaticus + +

Hafnia alvei + +

Klebsiella pneumoniae +

Klebsiella oxytoca* + +

Serratia marcescens +

Serratia liquefeciens + +

Proteus vulgaris* + +

Proteus mirabilis +

Aeromonas hydrophila +

Acinetobacter spp. +

Pseudomonas aeruginosa +

Грамположительные

Enterococcus faecalis + + +

Enterococcus faecium + + +

Bacillus spp.* + + + + +

Грибы

Дрожжевые грибы + + + +

(Candida spp) и др.

Плесневые грибы

(Mucor. spp., + + + + +

Aspergillus spp.,

Penicillum spp.)

■"Преобладающие виды.

Вторую часть приготовленных препаратов, в которых не были удалены антисептики, использовали для оценки влияния их на вирус. При введении в препа-

Вестник защиты растений, ,3, 2007 рат антисептиков непосредственно перед хранением при +4-8оС через сутки гра-мотрицательные бактерии (в т.ч. кишечная палочка Escherichia coli) не подавлялись. Но через месяц хранения при этой температуре почти вся грамотрицательная бактериальная флора погибла (табл. 2).

При полевых испытаниях препарата вирин-ЭНШ(к) спустя 37 дней после введения этих антисептиков отмечены незначительные колебания в скорости гибели непарного шелкопряда при использовании ФБМ, а при использовании хлороформа скорость гибели снижалась более существенно (на 1.5 дня).

В России в ХХ веке было создано 9 вирусных энтомопатогенных препаратов. Они прошли госиспытания и были рекомендованы к применению. Списки этих препаратов опубликованы в разных изданиях с указанием институтов и авторов. Из них 5 препаратов для сельского и 4 препарата для лесного хозяйства. Почти все препараты для госиспытаний производились авторами на станциях защиты растений или в институтах. Из-за больших потребностей в среднеазиатских республиках вирусного препарата вирин-ХС для борьбы с хлопковой совкой институту ВНИИбакпрепарат было предложено разработать технологию для производства этого препарата в Казахстане на одном из заводов Главмикроби-опрома. Разработку начали с испытаний и введения в регламент дешевых безагаровых питательных сред и специального оборудования для выращивания гусениц до и после заражения вирусом. На основании составленной нормативно-технической документации (НТД) проектная организация разработала линию производства препарата вирин-ХС. С 1983 года препарат нарабатывался для госиспытаний на заводе в Казахстане. При производстве применялось оборудование, разработанное НПО Агроприбор для выращивания совок. Результаты испытаний опубликованы в Информационном бюллетене ВПРС МОББ № 33 (Митрофанов, 2002).

Препарат вирин-диприон для борьбы с рыжим сосновым пилильщиком посто-

янно выпускается под руководством авторов в Латвии, Сибири и других местах. В качестве основы для производства используется так называемый канадский вариант: получение массы пораженных вирусом особей осуществляют из собранных в природе личинок старших возрастов до или после их заражения вирусом (Smirnoff, 1964).

Десятый вирусный препарат - вирин-АББ прошел все процедуры его становления и изучения безопасности. С 1975 года он изготавливался на Унгенском биохимзаводе для госиспытаний, но не был рекомендован для применения из-за его низкой и нестабильной эффективности. Вирин-АББ уникальный, сложный препарат так как его действующее начало состоит из двух вирусов - ВЯП и ВГ. При постановке на госиспытания соотношение этих вирусов в препарате было недостаточно обосновано и состояло из 1 млрд полиэдров и 2 млрд гранул (соотношение 1:2). Сложность производства этого препарата усугублялась еще и тем, что гусеницы АББ в природе поражаются одновременно двумя вирусами, разделять которые сложно и дорого. Если в природе гусеницы погибают от одного вируса, то другой может быть в латентном состоянии. Поэтому при заражении гусениц одним вирусом в пораженных особях репродуцируется смесь вирусов.

В 1983 г. был приготовлен препарат ви-рин-АББ с повышенным содержанием ВГ: 1 млрд ВЯП + 50 млрд ВГ в 1 мл (в соотношении 1:50). При испытаниях на Украине этот препарат обеспечил удовлетворительную эффективность при норме расхода 250 г/га при среднесуточной температуре 18°С и максимальной 28°С, но действовал очень медленно (80% погибших гусениц на 25 день). При увеличении нормы расхода до 1 кг/га гибель гусениц 1-2 возраста через 10 дней была 100% (Красниц-кая, 1984). Возможность получения вирусной биомассы в больших количествах определяет рентабельность производства каждого вирусного препарата.

В 1992-1993 гг. были проведены исследования по определению перспектив получения вирусной биомассы ВЯП и ВГ

в гусеницах АББ, собранных в природе. Экспериментальные работы проводились на базе Волгоградской СТАЗР. Гусениц собирали в природе в основном в 4 возрасте в гнездах. Для культивирования вирусов в гусеницах использовали инкубаторы, садки и сетчатые кассеты, изготовленные НПО Агроприбор. При заражении применяли штаммы вирусов ВЯП и ВГ, выделенные в Закарпатье в 1959 г., депонированные в ВИЗР под № 22. В ВИЗР смесь пассированных вирусов, выделенных из зараженных особей, была разделена на чистые полиэдры и чистые гранулы. Очищенные ВЯП и ВГ были переданы в МГУЛ для культивирования их в гусеницах АББ. В лаборатории биозащиты МГУЛ для оптимизации условий культивирования вирусов в гусеницах АББ были проведены исследования по влиянию температуры на скорость гибели зараженных особей, выявлению предпочитаемого корма для питания зараженных гусениц и определению оптимальных способов содержания зараженных гусениц. При заражении гусениц АББ старших возрастов использовались суспензии ВЯП - 4 млн полиэдров/мл, ВГ - 200 млн гранул/мл, смесь вирусов 4 млн полиэдров/мл + 200 млн гранул/мл. Эксперименты проводились в 2-3 по-вторностях, полученные данные обрабатывались статистически.

Для определения влияния температуры на скорость гибели зараженных гусениц их выращивали при двух температурных режимах в одинаковых инкубаторах. Учеты гибели особей проводились через день. Результаты исследования показали, что ВЯП и ВГ имеют разные температурные оптимумы. Средние показатели смертности свидетельствуют о том, что гибель гусениц повышалась и ускорялась при более высокой температуре, но в разной степени. Вычисленные LТ50 и LТ90 показали, что при культивировании ВГ при разных температурах различия недостоверны, то есть температурный оптимум для ВГ лежит в широких пределах 24-31°С.

Культивирование ВЯП при различных температурах приводило к ускорению

Вестник защиты растений, ,3, 2007 гибели (90%) гусениц почти в 2 раза и оказалось статистически достоверным при 29-31°С. Температурный оптимум для репродукции ВЯП в гусеницах АББ расположен в диапазоне этих температур. При культивировании смеси двух вирусов после одновременного заражения гусениц оказалось, что существенное ускорение смертности 90% особей происходит при температуре 24-26°С. Различия значительные и достоверные (более 4 суток). В этом, очевидно, и выражается синергизм совместного действия вирусов ВЯП и ВГ на гусениц АББ. При более высоких температурах (29-31°С) явление синергизма не наблюдалось. Проведенные исследования показали, что при создании препарата для борьбы с АББ на основе ВГ или смеси вирусов ВЯП + ВГ культивирование зараженных гусениц следует проводить при 24-26°С (табл. 3).

Таблица 3. Сводная таблица данных скорости гибели гусениц АББ, зараженных вирусами ВЯП и ВГ, культивированными при разной _температуре_

Варианты К-во ^50 LT 90

Вирусы °С гусе- Доверительные

ниц интервалы

ВГ 24-26 68 5.4 - 7.5 11.2 - 13.4

ВГ 29-31 80 3.6 - 5.8 10.3 - 12.5

ВЯП 24-26 84 3.0 - 5.3 13.8 - 16.1

ВЯП 29-31 108 1.2 - 3.5 6.9 - 9.1

ВГ+ВЯП 24-26 78 2.8 - 5.0 5.0 - 7.0

ВГ+ВЯП 29-31 92 0.9 - 3.4 9.7 - 12.1

При необходимости массового производства ВЯП культивирование зараженных гусениц надо проводить при 29-31°С (Орловская, Зубкова, 1994).

Известно, что ранняя гибель гусениц после заражения вирусами (2, 3, 5 дней) влечет за собой большие потери вирусной биомассы, так как интенсивность репродукции вирусов зависит от роста особей и прибавки их массы в период культивирования вирусов (Орловская, 1984).

При выращивании зараженных ВГ гусениц АББ на тополе или клене американском более ранняя и значительная гибель наблюдалась при питании гусениц листья-

Вестник защиты растений, ,3, 2007 ми тополя. Это повторялось при разной плотности гусениц в одинаковых садках. Причем чем меньше было гусениц в садке, тем большая была ранняя гибель. Учитывая этот необычный феномен, в садки было помещено значительно большее количество зараженных гусениц (125-160) штук. При этом, на 2 день гибели не было. На 3 день

при 160 зараженных гусениц в садке гибели не было, а при 125 гусеницах в садках погибло всего 0.8% зараженных гусениц. На 5 день погибло от 3.1% до 5.6% гусениц (табл. 4). Отсутствие ранней гибели насекомых после заражения вирусами свидетельствует об их высокой жизнеспособности и устойчивости к вирусам.

Таблица 4. Динамика гибели гусениц АББ, зараженных вирусом ВГ и выращиваемых при разной численности особей в садках при 24-26°С Гусеницы в садке Гибель гусениц (%) через дней

Корм Экз. 2 3 5 7 9 10 12 13

Т 35 31.4 45.7 54.3 100

1 ополь_77_52_91_18.2 84.4 92.2 97.4 97.4_100_

34 8.8 11.8 20.6 76.5 100

К 76 3.9 6.3 9.2 51.3 75.0 82.9 90.8 94.7

Клен 125 - 0.8 5.6 50.4 76.0 80.8 91.2 91.2

160 - - 3.1 67.5 87.5 94.4 96.9 98.8

В специальном опыте после зараже- зультаты повторились: чем больше была ния гусениц и содержании их в одинако- численность в кассетах, тем меньше была вых кассетах с разной численностью ре- преждевременная гибель особей (табл. 5).

Таблица 5. Изменение динамики гибели зараженных вирусами ВГ+ВЯП гусениц АББ в зависимости от их плотности в кассетах при выращивании на клене при 24-26°С

Сетчатые кассеты Гусениц в кассете Гибель гусениц (%) через дней

Площадь, см2 Высота, см Объем, см3 2 3 5 7 9 12 13

314 3 942 30-56 4.4 6.8 12.2 88.2 100

314 3 942 70-76 2.0 3.4 6.7 52.0 77.0 93.2 97.4

314 3 942 125-160 0 0.4 4.3 59.0 81.0 94.0 95.0

Очевидно у гусениц АББ проявился эффект группы вследствие свойственного им группового развития в гнездах. В таблице 6 представлены данные

анализов выхода вирусов ВЯП и ВГ в среднем от одной гусеницы АББ (личиночный эквивалент) при заражении их смесью.

Таблица 6. Влияние температуры и корма на выход вирусной биомассы при культивирова-_нии вирусов ВЯП+ВГ в гусеницах АББ У1-УН возрастов_

К-во Объем Возраст гусениц Корм Гибель гусениц, °С ВЯП ВГ Соотнош. ВЯП : ВГ

% ЛЭ ЛЭ ЛЭ

25 Инкубато- VII Клен 40.0 62.5 24-26 30-32 4.5 х 107 7.5 х 107 7.6 х 108 1.5 х 109 1 1 16.8 20.0

ры 500 см3 Шелко- 68.8 24-26 1.8 х 107 3.0 х 108 1 16.6

вица 82.2 30-32 2.9 х 107 4.9 х 108 1 16.9

300 Садки 6000 см3 VI Клен Шелко- 95.1 85.5 24-26 24-26 1.9 х 107 2.6 х 107 5.3 х 108 3.4 х 108 1 1: 27.9 12.8

вица

Показатели выхода вирусной биомассы спективе использования клена американ-из одной зараженной гусеницы (личиноч- ского для зараженных вирусами гусениц. ный эквивалент) свидетельствуют о пер- Использование сетчатых кассет с содер-

жанием в них высокой численности зараженных гусениц (130-150 шт.) позволит создать рентабельное производство препарата вирин-АББ с высокими титрами вирусов. Против первого поколения лучше использовать препарат со значительным

Вестник защиты растений, ,3, 2007 преобладанием ВГ, а против второго поколения - с увеличенным содержанием ВЯП.

Полученные данные могут служить основанием для составления регламента на производство препарата вирин-АББ и НТД для организации его производства при СТАЗР.

Красницкая Р.С. Использование вирин-АББ против белой американской бабочки на Украине. /Итоги и перспективы производства и применения вирусных препаратов в лесном и сельском хозяйстве, М., 1984, с.106-110.

Митрофанов В.Б. Перспективы и использование микробиологических препаратов для борьбы с вредителями сельского хозяйства. /СПб., Информационный бюлл. ВПРС МОББ, 33, 2002, с.163-171.

Орловская Е.В. Основные итоги направления в разработке технологии производства и применения вирусных энтомопатогенных препаратов. /Итоги и перспективы производства и применения вирусных препаратов в сельском и лесном хозяйстве, М., 1984, с.3-14.

Орловская Е.В. Вирусные энтомопатоген-ные препараты. /Защита растений, 10, 1988, с.26-28.

Орловская Е.В., Зубкова О.В. Влияние

Литература

абиотических факторов и режимов питания гусениц белой американской бабочки на развитие вирозов. /Охрана лесных экосистем и рациональное использование лесных ресурсов, 3. Тез. докл., Всероссийской конференции МГУЛ, 1994, с.90-92.

Полтев В.И. и др. Изучение микрофлоры вирусных энтомопатогенных препаратов и их действие на медоносных пчел, тутового шелкопряда и белых мышей. /Итоги и перспективы производства и применения вирусных препаратов в сельском и лесном хозяйстве. М., 1984, с.65-72.

Anonimus The use of viruses of the control of insect pests and disease vector. Reports of joint FAO/WHO meeting on insect viruses, WHO, Geneva, 1973.

Smirnoff W.A. Preparation and application of material in biological of the just in supply. Reprinted from the forestry chronicle, 40, 2, 1964.

THE MAIN STEPS IN ENTOMOPATHOGENIC VIRUS PREPARATION

PRODUCTION E.V.Orlovskaya, A.S.Tikhonova, M.B.Kobrin The data on development of pilot productions of virus preparations are described. Necessity of introducing antiseptic stabilizers into virus preparations providing suppression of microbic contaminants is discussed.