19Оригинальная статья УДК 57.084.1
https://doi.org/10.57034/2618723X-2022-04-06
Опыт применения хлопковых крыс для моделирования респираторно-синцитиальной вирусной инфекции и иммунопатологии
М.В. Сергеева*, А.А. Пулькина, А.А. Штро, К.А. Васильев, Е.А. Романовская-Романько, А.В. Гаршинина, А.В. Галочкина, А.А. Мужикян, Ж.В. Бузицкая, М.А. Стукова
ФГБУ«НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия
* E-mail: mari.v.sergeeva@gmail.com
Резюме. Хлопковые крысы широко используются в мире в качестве экспериментальной животной модели в исследованиях вакцин и химиопрепаратов против респираторно-синцитиальной вирусной (РСВ) инфекции. Востребованность данной модели обусловлена тем, что хлопковые крысы более восприимчивы к заражению РСВ, чем большинство лабораторных линий мышей, а также несут функциональный набор генов, кодирующих белки Mx1 и Mx2, которые являются важнейшими компонентами врожденной системы противовирусной защиты человека. Несмотря на небольшой размер, хлопковые крысы сложны в содержании и при проведении манипуляций, поскольку они сохранили поведенческие реакции диких животных, избегают контакта и быстро передвигаются. В этой статье мы обсуждаем препятствия на пути внедрения РСВ-модели хлопковых крыс в лабораторные исследования и представляем собственный опыт работы с этими животными. Наиболее длительным этапом был период времени, затраченный на переговоры с питомником и подготовку документов для получения животных. По прибытии хлопковых крыс (самки, возраст 6-8 нед) размещали в отдельном помещении вивария в индивидуальных клетках, снабженных стерилизованным подстилом. Животные быстро адаптировались к новым условиям и начали стабильно набирать массу тела с первых суток карантинного периода. Для моделирования РСВ-инфекции использовали две заражающие дозы вируса — 5 или 6 lg БОЕ/животное. Животным вводили вирус интраназально без наркоза или под ингаляционным наркозом (смесь изофлурана и пропиленгликоля). При этом инфекция без использования наркоза протекала бессимптомно в независимости от заражающей дозы вируса, хотя и сопровождалась продуктивной репликацией вируса главным образом в верхних дыхательных путях. Заражение животных под наркозом приводило к активной репликации вируса в легких, значительной потере массы тела и существенным повреждениям легких при использовании высокой заражающей дозы вируса. Иммунизация хлопковых крыс инактивированным формалином респиратор-но-синцитиальным вирусом привела к появлению классических маркеров усиления респираторной патологии в гистологических срезах легких и к снижению массы тела животных. Полученные результаты позволяют использовать отработанную модель хлопковых крыс для изучения защитных свойств и безопасности вакцин против РСВ-инфекции.
Ключевые слова: хлопковые крысы, респираторно-синцитиальный вирус, модель РСВ-инфекции, вакциноассоциированное усиление респираторной патологии
Благодарности. Исследование выполнено в рамках государственного контракта № 0373100122120000007 с ФГБУ «ЦСП» ФМБА России. Авторы выражают благодарность заведующей виварием Крыловой В.И. и сотрудникам вивария ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России за помощь в обеспечении особых условий содержания животных.
Для цитирования: Сергеева М.В., Пулькина А.А., Штро А.А., Васильев К.А., Романовская-Романь-ко Е.А., Гаршинина А.В., Галочкина А.В., Мужикян А.А., Бузицкая Ж.В., Стукова М.А. Опыт применения хлопковых крыс для моделирования респираторно-синцитиальной вирусной инфекции и иммунопатологии. Лабораторные животные для научных исследований. 2022; 4. 46-56. https://doi.org/ 10.57034/2618723X-2022-04-06.
© Сергеева М.В., Пулькина А.А., Штро А.А., Васильев К.А., Романовская-Романько Е.А., Гаршинина А.В., Галочкина А.В, Мужикян А.А., Бузицкая Ж.В., Стукова М.А., 2022
Original article
Implementation experience of cotton rat model for respiratory syncytial virus infection and immunopathology
M.V. Sergeeva*, A.A. Pulkina, A.A. Shtro, K.A. Vasiliev, E.A. Romanovskaya-Romanko, A.V. Garshinina, A.V. Galochkina, A.A. Muzhikyan, J.V. Buzitskaya, M.A. Stukova
Federal State Budgetary Institution "Influenza Research Institute named after A.A. Smorodintsev" of the Ministry of Health of Russia, Saint-Petersburg, Russia
* E-mail: mari.v.sergeeva@gmail.com
Abstract. Cotton rats are widely used worldwide as an animal model in research of vaccines and chemotherapy against respiratory syncytial virus infection. The demand for this model is due to the fact that cotton rats are more susceptible to the RSV infection than laboratory mouse strains, and also carry a functional set of genes encoding Mx1 and Mx2 proteins, which are the most important components of the innate human antiviral defense system. Despite their small size, cotton rats are difficult to handle and manipulate, since they have retained the behavioral reactions of wild animals, avoid contact, and move quickly. In the present manuscript, we discuss the barriers to implementing the cotton rat model into laboratory research and present our experience. The longest stage of the process was the time spent on negotiations with animal nursery and preparation of documents for receiving animals. Upon arrival, cotton rats (females, 6-8 weeks old) were housed in a separate vivarium room in individual cages equipped with sterilized bedding. The animals quickly adapted to the new conditions and began to steadily gain weight from the first day of the quarantine period. To simulate RSV infection, we used two infectious doses of the virus, 5 lg or 6 lg PFU/animal. Animals were injected with the virus intranasally without anesthesia or under inhalation anesthesia (a mixture of isoflurane and propylene glycol). Infection without the use of anesthesia was asymptomatic, regardless of the virus dose, although it was accompanied by productive virus replication, mainly in the upper respiratory tract. At the same time, infection of animals under anesthesia led to active replication of the virus in the lungs, and also significant loss of body weight and lung damage of animals infected with a high virus dose. Immunization of cotton rats with formalin inactivated RSV resulted in the appearance of classical markers of enhanced respiratory pathology in histolog-ical sections of the lungs and a decrease in animal weight. The results obtained make it possible to use the developed model of cotton rats to study the protective properties and safety of vaccines against RSV infection.
Keywords: cotton rats, respiratory syncytial virus, RSV infection animal model, vaccine associated enhanced respiratory disease
Acknowledgements. The study was carried out under the state contract No. 0373100122120000007 with the Federal State Budgetary Institution "TsSP" of the FMBA of Russia. The authors are grateful to the head of the vivarium, Krylo-va V.I. and employees of the vivarium of the Federal State Budgetary Institution "Influenza Research Institute named after A.A. Smorodintsev" of the Ministry of Health of Russia for assistance in providing special conditions for keeping animals.
For citation: Sergeeva M.V., Pulkina A.A., Shtro A.A., Vasiliev K.A., Romanovskaya-Romanko E.A., Garshinina A.V., Galochkina A.V., Muzhikyan A.A., Buzitskaya J.V., Stukova M.A. Implementation experience of cotton rat model for respiratory syncytial virus infection and immunopathology. Laboratory Animals for Science. 2022; 4. 46-56. https://doi.org/10.57034/2618723X-2022-04-06.
Введение
Экспериментальные модели респираторно-син-цитиальной вирусной (РСВ) инфекции являются инструментом для понимания патогенеза заболевания и оценки безопасности и эффективности новых средств терапии и профилактики. В конце 1960-х годов, в эпоху, предшествующую широкому использованию экспериментальных моделей, разработчики формалин-инактивированной вакцины против РСВ-инфекции (ФИ-РСВ) столкнулись с феноменом вакциноассоциированного усиления респираторного заболевания, которое имело трагические последствия для вакцинированных детей младшего возраста при встрече с РСВ-инфекцией [1]. Наблюдаемое явление впоследствии было смоделировано на животных и оказалось напрямую связано с развитием им-
мунопатологии [2], которая характеризовалась дисбалансом цитокинов и иммунного ответа по Th2/Th17-™ny, формированием ненейтрализу-ющих антител, эозинофилией и нейтрофилией [3]. Особенностью РСВ-инфекции является отсутствие прямой связи между вирусной нагрузкой в респираторном тракте и тяжестью течения заболевания, которая в большей мере зависит от реакции иммунной системы на инфекцию [4], что существенно ограничивает использование тестов in vitro для разработки средств терапии и профилактики РСВ-инфекции. Некоторые исследования in vitro позволяют оценить отдельные компоненты развития иммунопатологической реакции как, например, профиль цитокинов, синтезируемых мо-нонуклеарными клетками периферической крови при РСВ- инфекции в ответ на различные антигены [5]. Также описано исследование in vitro врож-
денного иммунного ответа на различные вакцины против РСВ с использованием дендритных клеток, полученных из моноцитов человека (moDC) и культуры аллогенных Т-клеток. Результаты исследования [6] в отношении баланса Т-клеточного ответа на вакцины были схожи с данными, полученными на моделях животных. В перечисленных случаях для моделирования использованы клетки взрослых доноров, уже контактировавших с РСВ в течение жизни, в то время как группу риска развития иммунопатологии составляют дети раннего возраста, не контактировавшие с РСВ [7]. Поэтому наиболее надежным способом, позволяющим оценить развитие вакциноассоциированного усиления патологии при РСВ-инфекции, остается использование нативных животных.
Хлопковые крысы, мыши, овцы, сирийские хомяки, шиншиллы, морские свинки, хорьки и нечеловекообразные приматы используются для моделирования РСВ-инфекции [8]. Из всех мелких животных хлопковые крысы (Sigmodon hispidus) наиболее восприимчивы к РСВ-инфекции и превосходят таковую у большинства лабораторных линий мышей, которые демонстрируют значительные вариации восприимчивости к РСВ от штамма к штамму [9]. При иммунизации хлопковых крыс ФИ-РСВ последующая инфекция вызывает у животных признаки иммунопатологии и вакциноассоциированного усиления респираторного заболевания, схожие с наблюдаемыми во время испытаний подобной вакцины у детей [10, 11]. Хлопковые крысы несут функциональный набор генов, кодирующих белки Mx1 и Mx2, которые являются важнейшими компонентами врожденной системы противовирусной защиты человека [12, 13], что особенно значимо при испытаниях интрана-зальной вакцины на основе аттенуированного гриппозного вектора, которая в большой степени направлена на активацию врожденного компонента иммунного ответа [14].
Цель данного исследования — воспроизведение и отработка параметров модели РСВ-инфекции и иммунопатологии на хлопковых крысах для последующего применения в изучении специфической активности векторной вакцины против РСВ.
Материал и методы
Экспериментальные животные Хлопковые крысы (Sigmodon hispidus) самки, возраст 5-8 нед были получены из питомника Envigo Inc. (США) с соответствующим ветеринарным свидетельством. Животных содержали в условиях вивария в соответствии с ГОСТом 332152014 и СП 2.2.1.3218-14; все работы проводили согласно СП 1.3.2322-08 и документов «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» и «Международные рекомендации (биоэтический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных». Процедуры, проводимые с животными, были одобрены Комиссией по био-
этике ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России (протокол № 21 от 29.06.20).
Животных содержали в индивидуальных автоклавируемых поликарбонатных клетках (BENEX а.с., Чешская Республика), тип Т3А, площадь 800 см2, в которых, помимо стерилизованного подстила Lignocell Wood Fibers (JRC, Германия), также размещали укрытие (цилиндр из ПВХ-трубы диаметром 11 см, стерилизация автоклавирова-нием) и материал для гнездования (бумажные салфетки), необходимые для снижения уровня стресса у животных [15]. Животные получали без ограничений пищу, состоящую из смеси полноценного лабораторного корма (ООО «Лабора-торкорм», Россия) и корма для хомяков (Versele-Laga, Бельгия). Животных обеспечивали чистой питьевой водой, полученной при помощи системы водоподготовки (Millipore RiOs 50, США), которую наливали в стандартные поилки со стальными крышками-носиками, и кормом ad libitum. Контроль параметров окружающей среды осуществляли ежедневно на всем протяжении исследования, включая контроль температуры и влажности. Фотопериод составлял 12 ч — ночь, 12 ч — день при искусственном освещении лампами дневного света. В период карантина (7 дней) и при экспериментальном заражении (7 дней) проводили ежедневный мониторинг массы тела животных.
Респираторно-синцитиальный вирус В работе использовали респираторно-синцитиаль-ный вирус серотипа А штамм А2 (РСВ A2), полученный из коллекции International Reagent Resource (США). Вирус накапливался в клетках НЕр-2 (ATCC, США). Инфекционную активность вируса определяли по количеству бляшкообразующих единиц (БОЕ) методом титрования в клетках HEp-2 в 24-луночных культуральных планшетах (Nunc, Дания). Клетки заражали 10-кратными разведениями вируссодержащего материала, инкубировали 1 ч при 37 °С, после чего вносили полужидкое покрытие, содержащее питательную среду c 0,3% агарозой (NBCo, США). Планшеты инкубировали 4 сут при температуре 37 °С, 5% СО2, затем клетки фиксировали 80% ацетоном и окрашивали моно-клональными антителами 4F2 к белку F РСВ [16]. Подсчет количества бляшек проводили визуально. Титр рассчитывали как произведение усредненного числа бляшек на использованное разведение и выражали в десятичных логарифмах lg БОЕ/мл.
Иммунизация животных прототипом ФИ-РСВ Для подготовки прототипа ФИ-РСВ вирус РСВ А2 накапливали в культуре клеток НЕр-2, затем инактивировали добавлением 1:4000 формалина (Вектон, Россия) в течение 72 ч при 37 °С. Далее проводили очистку вируса методом ультрацентрифугирования в роторе SW-41 (Beckman, США) в режиме 36 000 rpm (~190 000 g), 4 ч, при 4 °С через подушку из 30% сахарозы (Amresco, США). Концентрацию общего белка в очищенном инак-тивированном вирусе измеряли с использованием набора реагентов Quant-iT Protein Assay Kit и флу-
Рис. 1. Интраназальное заражение хлопковой крысы: а — У-образный захват животного; б — введение вируссодержащего материала в носовые ходы хлопковой крысы
ориметра Qubit 2.0 (Invitrogen, США). Для иммунизации животных готовили препарат, содержащий в одной дозе 10 мкг очищенного формалининак-тивированного вируса и 100 мкг адъюванта ги-дроксида алюминия (Sigma, США), разведенные в среде без сыворотки в общем объеме 100 мкл.
Иммунизацию хлопковых крыс прототипом ФИ-РСВ проводили за 5 нед до заражения, животным внутримышечно вводили 10 мкг очищенного инактивированного РСВ, адсорбированного на 100 мкг гидроксида алюминия в течение 4 ч при 4 °C.
Заражение животных
Экспериментальное заражение хлопковых крыс проводили интраназально двумя способами — без наркоза и под легким изофлурановым наркозом.
Для проведения манипуляций животное обездвиживали путем V-образного захвата (рис. 1). В качестве наркоза использовали смесь изо-флурана и пропиленгликоля [17]. Для заражения под наркозом переднюю часть головы хлопковой крысы помещали в стеклянный конус, в котором располагали два слоя марли — первый слой, смоченный смесью изофлурана и пропиленглико-ля (1:1), и второй сухой слой, как описано в [18]. О действии наркоза судили по расслаблению и опусканию задних конечностей, после чего животное располагали горизонтально и вводили ви-руссодержащую жидкость в носовые ходы в объеме 100 мкл. При заражении без наркоза обездвиженному и горизонтально расположенному животному вводили интраназально 50 мкл вируссодержащего материала. После заражения ежедневно контролировали массу тела. Плановую эвтаназию животных проводили путем помещения в СО2-бокс (VetTech Solutions Auto CO2 Workstation, США) и последующей цервикальной дислокации. Образцы тканей верхних и нижних дыхательных путей были получены на 4, 5 или 6-й день после заражения и проанализированы на репродуктив-ность вируса. Также ткань легких подвергали ги-стопатологическому анализу.
Гистологическое исследование Гистологическому анализу были подвергнуты парафиновые срезы легких хлопковых крыс, окрашенные гематоксилином и эозином. Полуколи-
чественный анализ ткани легких был выполнен в двух вариантах со следующей оценкой степени повреждений: 0 — отсутствие; 1 — минимальные повреждения; 2 — незначительные; 3 — умеренные; 4 — выраженные; 5 — тяжелые. При этом визуально оценивали общий процент пораженной ткани легких на срезе, а также выраженность острого воспаления и инфильтрацию лимфоцитов отдельно для функциональных элементов ткани легкого — бронхиол, сосудов, интерстиция и альвеол. Суммарный индекс поражения рассчитывали как максимальный индекс, полученный при анализе различных элементов. Также оценивали наличие и выраженность следующих характерных изменений элементов ткани — гипертрофию и гиперплазию эпителия, атипию плоского эпителия, некроз эпителия (первые четыре признака оценивали отдельно для бронхов и бронхиол), гипертрофию пневмоцитов II типа, гиперемию межальвеолярной перегородки, альвеолярную эмфизему, альвеолярную геморрагию, бронхит, бронхиолит, перибронхит, перибронхио-лит, инфильтрацию интерстиция, альвеолит, ва-скулит, периваскулит.
Морфометрическую оценку количества эо-зинофилов проводили не менее чем в 10 полях зрения от каждого образца при увеличении в 200 раз. Морфометрическую оценку количества бокаловидных клеток проводили путем подсчета количества клеток в пересчете на 1 мм2 эпителия воздухоносных путей. Для морфометрической оценки количества эозинофилов и бокаловидных клеток выбирали поля зрения с наибольшим количеством оцениваемых клеток.
Анализ данных
Статистический анализ первичных данных проводили в программных пакетах Microsoft Office Exœl 2010 (США) и GraphPad Prism v6.01 (США). Для графического представления динамики массы тела хлопковых крыс у каждого животного вычисляли относительное значение массы тела в процентах к массе в 1-й день, затем вычисляли среднее арифметическое, стандартное отклонение (СО) и строили кривую зависимости группового среднего от дня после начала эксперимента. Для графического представления вирусной нагрузки использовали логарифмированные данные, представленные на точечных диаграммах.
Результаты и обсуждение
Получение и адаптация хлопковых крыс Наиболее длительным этапом в работе с хлопковыми крысами был период времени, затраченный на переговоры с питомником и подготовку документов для получения животных, который в совокупности занял около 5 мес. По прибытии животных размещали в отдельном помещении вивария в индивидуальных клетках. Такой способ размещения связан с тем, что хлопковые крысы сохраняли поведенческие реакции диких животных, избегали контакта, быстро передвигались, что существенно затрудняло проведение манипуляций. Несмотря на стресс во время транспортировки, хлопковые крысы быстро адаптировались к новым условиям и начали стабильно набирать массу тела с первых суток карантинного периода. В период адаптации никаких отклонений в состоянии и поведении животных отмечено не было. За время 7-дневного карантина масса тела хлопковых крыс в среднем увеличилась с 41±5 до 49±5 г (рис. 2, область выделена голубым).
Подбор оптимальной инфекционной дозы РСВ при моделировании инфекции у хлопковых крыс Для моделирования РСВ-инфекции проводили заражение хлопковых крыс двумя инфекционными дозами РСВ — 5 или 6 ^ БОЕ/животное. Заражение проводили интраназально (см. рис. 2) без наркоза (по 4 животных на 1 экспериментальную точку) или под изофлурановым наркозом (по 3 животных на 1 точку). В течение 6 дней после заражения животных ежедневно взвешивали, на 4-й и 6-й день после заражения часть животных вскрывали, извлекали легкие, носовые ходы и трахею, в которых определяли наличие инфекционного вируса. Из соображений гуманности в высокой дозе под наркозом заражали только 2 животных, которых вскрыли на 5-й день эксперимента.
По итогам наблюдения у животных, зараженных без наркоза, вне зависимости от инфекционной дозы наблюдали тенденцию к приросту массы тела, который, однако, был более медленным по сравнению с интактными животными. При этом максимальные различия между группами были зафиксированы на 6-й день инфекции (рис. 3а). Инфекция под наркозом в дозе 5 ^ БОЕ не отразилась на значениях массы тела хлопковых крыс (рис. 36). В группе с высокой заражающей дозой вируса (6 ^ БОЕ) наблюдали отрицательную динамику массы тела животных, достигшую 10% от исходного уровня к концу периода наблюдения (см. рис. 3б).
Выделение инфекционного вируса в носовых ходах было зафиксировано у всех животных, получивших РСВ без наркоза, на 4-й день после заражения вне зависимости от заражающей дозы. Вирусовыделение из верхних дыхательных путей было на уровне 3-4 ^ БОЕ/мл суспензии органа (рис. 4а). На 6-й день после заражения вирус обнаружен в носовых ходах у 2 (из двух) животных, зараженных высокой дозой вируса (6 ^ БОЕ/животное), и у 1 (из двух), зараженных низкой дозой (5 ^ БОЕ/животное). В легких инфекционный вирус обнаружен только у 2 животных (в разные дни, разные дозы заражения), в трахее — только у 1 животного из группы с низкой заражающей дозой на 6-й день. Выделение инфекционного вируса в носовых ходах зафиксировано у всех животных, получивших РСВ под наркозом, примерно на одном уровне, составляющем 3-4 ^ БОЕ/мл суспензии ткани, вне зависимости от заражающей дозы (рис. 4б). У всех животных, зараженных в дозе 5 ^ БОЕ, зафиксирован инфекционный вирус в нижних отделах респираторного тракта, — трахее и легких. У хлопковых крыс, зараженных в дозе 6 ^ БОЕ, на 5-е сутки после инфекции вирусовыделение из легких не отмечено или было на очень низком уровне, что, по-видимому, связа-
Рис. 2. Динамика массы тела хлопковых крыс в период карантина:
а — хлопковая крыса. Животное удерживают за основание хвоста, что обеспечивает меньший уровень стресса по сравнению с другими способами; б — динамика массы тела животных в период карантина. Отдельные линии — индивидуальное изменение массы тела каждого животного. Голубая область — изменение средней массы тела животных
Рис. 3. Изменение массы тела хлопковых крыс после интраназального заражения респираторно-синцитиальным
вирусом без наркоза (а) и под наркозом (б) в указанных дозах. Представлены усредненные значения изменения показателя по группам животных и стандартные отклонения (СО). На графике (б) — изменение массы тела животных, предварительно иммунизированных прототипом ФИ-РСВ и зараженных в дозе 5 íg БОЕ
о
L0
■м
5 п
4 -
3 -
2 -
1 -
О
..СМ.
.mk......оов..ж../Акд.
День 4
День 6
О Легкие □ Носовые ходы А Трахея • 5 lg БОЕ 6 lg БОЕ
О Б
■м
5 -1
4 -
3 -
2 -
1 -
День 4
День 5
День 6
О Легкие □ Носовые ходы А Трахея • 5 lg БОЕ 6 lg БОЕ
Рис. 4. Вирусная нагрузка в различных отделах респираторного тракта хлопковых крыс
при интраназальной инфекции респираторно-синцитиальным вирусом без наркоза (а) и под наркозом (б). Маркерами представлены индивидуальные значения титров для каждого животного
б
□
0
0
но с более ранним началом и высокой интенсивностью воспалительного процесса при заражении вирусом в высокой дозе.
По итогам данного раздела можно заключить, что интраназальное введение вируса под наркозом необходимо для моделирования РСВ-инфекции в нижних дыхательных путях хлопковых крыс, так как заражение без наркоза приводит к вирусной репликации только в верхних дыхательных путях.
Патологические изменения в легких хлопковых крыс при заражении РСВ и вакциноассоциированном усилении инфекции Для моделирования иммунопатологии на фоне РСВ-инфекции часть хлопковых крыс была иммунизирована прототипом ФИ-РСВ за 5 нед до заражения. После введения вируса в дозе 5 ^ БОЕ
у животных зарегистрировано снижение массы тела в среднем на 5% от исходного уровня в течение 6 дней (см. рис. 3б). При этом иммунизация прототипом ФИ-РСВ полностью предотвратила появление инфекционного вируса в нижних отделах респираторного тракта, а в носовых ходах вирус выделялся только на 4-е сутки после заражения в среднем титре 3,5±1,2 lg БОЕ/мл. По данным аналогичных исследований, описанных в литературе [19], иммунизация хлопковых крыс оригинальным препаратом ФИ-РСВ (lot 100) приводила к частичному снижению вирусной нагрузки в легких животных. При этом до конца неясна доза РСВ-антигена, входящего в состав оригинального препарата, и исследователи оперируют разведениями исходного материала (1:25, 1:125), а не конечной концентрацией вирусного белка [10]. Однако для вакцин на основе реком-
бинантных белков показана зависимость между вирусной нагрузкой в легких и дозой антигена. Так, например, иммунизация хлопковых крыс рекомбинантным белком F в дозе 0,5-5 мкг/жи-вотное полностью предотвращала репродукцию РСВ в легких [20, 21]. Можно предположить, что полное подавление вирусной нагрузки в нашем исследовании также связано с высокой дозой антигена, которая составляла 10 мкг ФИ-РСВ/жи-вотное.
Другая картина наблюдалась при гистологическом анализе срезов легких животных, привитых прототипом ФИ-РСВ и далее зараженных РСВ, по сравнению с непривитыми зараженными животными (рис. 5). Степень выраженности патологических изменений в легких непривитых крыс, зараженных под наркозом в дозе 5 БОЕ, была умеренной, проявлялась в незначительной смешанно-клеточной инфильтрации интерсти-циальной ткани и альвеолярных перегородок; наблюдалась гиперплазия бронхиального и брон-хиолярного эпителия, сопровождавшаяся развитием слабо выраженного и умеренного бронхита. У крыс, иммунизированных прототипом ФИ-РСВ, степень выраженности и частота встречаемости отмеченных выше патологических изменений была выше, чем у контрольных животных. С большей частотой наблюдался альвеолит, сопровождавшийся накоплением в просвете альвеол клеток мононуклеарного ряда. В целом картина поражений совпадала с описанной ранее в литературе [20]. У животных группы ФИ-РСВ наблюдались тяжелые перибронхиальные и перибронхиоляр-ные смешанно-клеточные инфильтраты с вовлечением в воспалительный процесс большого количества эозинофилов. Также регистрировалось утолщение интерстициальной ткани легких и альвеолярных перегородок с диффузно-очаго-вой полиморфно-клеточной воспалительной ин-
фильтрацией, сопровождавшейся развитием выраженного альвеолита с накоплением в просвете альвеол большого количества альвеолярных макрофагов, лимфоцитов, в умеренном количестве дегенеративно-измененных и активированных нейтрофилов, эозинофилов с признаками частичной дегрануляции.
Проведенная полуколичественная оценка морфометрических показателей повреждения различных элементов ткани легких показала усиление респираторной патологии у животных, иммунизированных прототипом ФИ-РСВ, по сравнению с животными из группы контроля заражения (рис. 6а, б). У животных, привитых прототипом ФИ-РСВ, наблюдалось повышенное количество эозинофилов и бокаловидных клеток в ткани (рис. 6в, г), что является классическим маркером вакцино-ассоциированного усиления патологии при РСВ-инфекции [20]. В целом использованный подход (предварительная иммунизация хлопковых крыс прототипом ФИ-РСВ) позволил смоделировать эффект вакцино-ассоциирован-ного усиления респираторной патологии при последующем заражении РСВ.
Обсуждение результатов
Модель респираторно-синцитиальной вирусной (РСВ) инфекции у хлопковых крыс была впервые описана в 1971 г. группой советских ученых, показавших высокую восприимчивость животных к респираторно-синцитиальному вирусу и развитие патологии в респираторном тракте [22]. Несколько лет спустя модель была воспроизведена в США и дополнена исследованиями зависимости тяжести инфекции от возраста животных [23, 24]. Позднее на данных животных удалось воспроизвести вакцино-ассоциированное усиление респираторной патологи при РСВ-инфекции [25],
Интактное Контроль заражения ФИ-РСВ вакцина
Рис. 5. Микроскопическое строение легких хлопковых крыс в процессе экспериментальной респираторно-синцитиальной вирусной инфекции; микрофотографии с наиболее выраженными изменениями на 6-й день после заражения
л
о Д
80 -,
б0 -
40 -
20 -
4б День после заражения
20 -,
1Б -
10 -
Б -
J±L
+
4б День после заражения
о
200 -,
1Б0 -
ф
" 100 и
о е вол
о
л о К
Б0 -
4б День после заражения
в
i I
« н
л о К
б0 -,
40 -
20 -
» i
4б День после заражения
4 ФИ-PŒ Контроль заражения
Рис. 6. Результаты полуколичественной оценки морфометрических показателей ткани легких хлопковых крыс в процессе экспериментальной респираторно-синцитиальной вирусной инфекции. Контрольных животных и животных, внутримышечно иммунизированных ФИ-РСВ, через 5 недель после иммунизации заражали респираторно-синцитиальным вирусом в дозе 5 ig БОЕ под наркозом. Через 6 дней после заражения проводили гистологический анализ легких с полуколичественной оценкой следующих показателей: a — доля пораженной ткани; б — маркеры острого воспаления; в — количество эозинофилов; г — количество бокаловидных клеток
0
0
в
г
0
0
что определило выбор хлопковых крыс в качестве незаменимой модели при исследованиях данного эффекта.
Несмотря на давнюю историю и достоинства модели хлопковых крыс, применение этих животных имеет целый ряд ограничений. Хлопковые крысы сложны в содержании и при проведении манипуляций, поскольку сохранили поведенческие реакции диких животных, избегают контакта, быстро передвигаются, а также способны высоко прыгать [26]. В нашем опыте обучение обращению с животными занимало в среднем 2-3 дня на каждого оператора. Дополнительную сложность вносило отсутствие необходимых обучающих ресурсов на русском языке. Для освоения способов проведения манипуляций с хлопковыми крысами мы использовали ресурсы на английском языке [18, 26, 27], при этом критическое значение имели видеозаписи [15, 28].
Кроме того, существует лишь весьма ограниченное количество питомников хлопковых крыс. В России и Европе таких питомников в настоящее время нет. В связи с этим первые контакты с дистрибьютором хлопковых крыс были инициирова-
ны за год до эксперимента. Время от начала переговоров по соглашению до доставки хлопковых крыс из питомника Envigo Inc. (США) в виварий института составило около 5 мес, однако на длительность этого периода, очевидно, могла повлиять пандемия COVID-19.
Несмотря на описанные трудности, нам удалось получить хлопковых крыс, адаптировать их и воспроизвести у них инфекцию верхних и нижних дыхательных путей при интраназальном заражении РСВ. У большинства хлопковых крыс, зараженных без наркоза, экспериментальная инфекция была ограничена преимущественно верхней частью респираторного тракта и не приводила к появлению существенных микро- и макроскопических патологических изменений в легких независимо от заражающей дозы. При интраназальном заражении хлопковых крыс под наркозом наблюдаемые признаки инфекции были до-зозависимыми, вирусовыделение наблюдалось как в верхней, так и в нижней части респираторного тракта, в легких выявлялись гистологические признаки поражения. Заражение в высокой дозе (6 lg БОЕ на животное) приводило к развитию вы-
раженных макропоражений в легких и существенному ухудшению состояния животных. Предварительная иммунизация хлопковых крыс прототипом препарата формалин-инактивированной вакцины ограничивала репликацию вируса в респираторном тракте животных, однако приводила к усилению гистологических признаков поражения в легких, что свидетельствует о проявлении вакциноассоциированной иммунопатологии.
Заключение
В целом в рамках данного исследования успешно смоделирован инфекционный процесс при заражении хлопковых крыс респираторно-синцити-альным вирусом, в том числе воспроизведено вакциноассоциированное усиление респираторной патологии, что позволит использовать данную модель для изучения защитных свойств и безопасности вакцин против респираторно-синци-тиальной вирусной инфекции.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. Kim H.W., Canchola J.G., Brandt C.D. et al. Respiratory syncytial virus disease in infants despite prior administration of antigenic inactivated vaccine // Am. J. Epidemiol. 1969. Vol. 89. P. 422-434. DOI: 10.1093/oxfordjournals.aje.a120955.
2. Prince G.A., Jenson A.B., Hemming V.G. et al. Enhancement of respiratory syncytial virus pulmonary pathology in cotton rats by prior intramuscular inoculation of formalin-inactiva ted virus // J. Virol. 1986. Vol. 57. N. 3. P. 721-728. DOI: 10.1128/JVI.57.3.721-728.1986.
3. Bergeron H.C., Tripp R.A. Immunopathology of RSV: An Updated Review // Viruses. 2021. Vol. 10. N. 13 (12). P. 2478. DOI: 10.3390/v13122478.
4. Openshaw P.J., Tregoning J.S. Immune responses and disease enhancement during respiratory syncytial virus infection // Clin. Microbiol. Rev. 2005. Vol. 18. N. 3. P. 541-555. DOI: 10.1128/CMR.18.3.541-555.2005.
5. Jackson M., Scott R. Different patterns of cytokine induction in cultures of respiratory syncytial (RS) virus-specific human TH cell lines following stimulation with RS virus and RS virus proteins // J. Med. Virol. 1996. Vol. 49. N. 3. P. 161-169. DOI: 10.1002/(SICI)1096-9071(199607)49: 3<161::AID-JMV2>3.0.m;2-2.
6. Chirkova T., Ha B., Rimawi B.H. et al. In vitro model for the assessment of human immune responses to subunit RSV vaccines // PLoS One. 2020. Vol. 19. N. 15 (3). P. e0229660. DOI: 10.1371/journal.pone.0229660.
7. Anderson L.J., Dormitzer P.R., Nokes D.J. et al. Strategic priorities for respiratory syncytial virus (RSV) vaccine development // Vaccine. 2013. Vol. 18. N. 31 (Suppl 2). P. B209-215. DOI: 10.1016/j.vaccine.2012.11.106.
8. Taylor G. Animal models of respiratory syncytial virus infection // Vaccine. 2017. Vol. 35. N. 3. P. 469-480. DOI: 10.1016/j.vaccine.2016.11.054.
9. Boukhvalova M.S., Yim K.C., Blanco J. Cotton rat model for testing vaccines and antivirals against respiratory syncytial virus // Antivir. Chem. Chemother. 2018. Vol. 26. P. 1-13. DOI: 10.1177/2040206618770518.
10. Prince G.A., Curtis S.J., Yim K.C., Porter D.D. Vaccine-enhanced respiratory syncytial virus disease in cotton rats following immunization with Lot 100 or a newly prepared
reference vaccine // J. Gen. Virol. 2001. Vol. 82. N. 12. P. 2881-2888. DOI: 10.1099/0022-1317-82-12-2881.
11. Muralidharan A., Li C., Wang L., Li X. Immunopathogene-sis associated with formaldehyde-inactivated RSV vaccine in preclinical and clinical studies // Expert Rev Vaccines. 2017. Vol. 16. N. 4. P. 351-360. DOI: 10.1080/14760584 .2017.1260452.
12. Pletneva L.M., Haller O., Porter D.D., Prince G.A., Blanco J.C. Interferon-inducible Mx gene expression in cotton rats: cloning, characterization, and expression during influenza viral infection // J. Interferon Cytokine Res. 2006. Vol. 26. N. 12. P. 914-921. DOI: 10.1089/jir.2006.26.914.
13. Pletneva L.M., Haller O., Porter D.D., Prince G.A., Blanco J.C.G. Induction of type I interferons and interferon-in-ducible Mx genes during respiratory syncytial virus infection and reinfection in cotton rats // J. Gen. Virol. 2008. Vol 89. Pt 1. P. 261-270. DOI: 10.1099/vir.0.83294-0.
14. Vasilyev K.A., Yukhneva M.A., Shurygina A.-P.S., Stuko-va M.A., Egorov A.Y. The enhancement of influenza A virus immunogenicity by the inhibition of the immunosuppres-sive function of NS1 protein // MIR J. 2018. Vol. 5. N. 1. P. 48-58. DOI: 10.18527/2500-2236-2018-5-1-48-58.
15. Cuddington B., Verschoor M., Mossman K. Handling of the cotton rat in studies for the pre-clinical evaluation of oncolytic viruses // J. Vis. Exp. 2014. Vol. 93. P. e52232. Published 2014 Nov 24. DOI: 10.3791/52232.
16. Кривицкая В.З., Петрова Е.Р., Сорокин Е.В. и др. Получение и характеристика моноклональных антител, специфичных к респираторно-синцитиальному вирусу // Биотехнология. 2016. Т. 32. № 1. С. 65-75. [V.Z. Krivitskaya, E.R. Petrova, E.V. Sorokin et al. Design and Characteristics of Monoclonal Antibodies Specific to Respiratory Syncytial Virus // Biotekhnologiya. 2016. Vol. 32. N. 1. P. 65-75. DOI: 10.21519/0234-2758-2016-1-65-75 (In Russian)].
17. Nagate T., Chino T., Nishiyama C. et al. Diluted isoflurane as a suitable alternative for diethyl ether for rat anaesthesia in regular toxicology studies // J. Vet. Med. Sci. 2007. Vol. 69. N. 11. P. 1137-1143. DOI: 10.1292/jvms.69.1137.
18. Division of Laboratory Animal Resources. UK Research. Open-Drop or Nose Cone Method of Isoflurane Anesthesia in Mice and Rats. Electronic resource: https:// www.research.uky.edu/division-laboratory-animal-resour-ces/open-drop-or-nose-cone-method-isoflurane-anesthe-sia-mice-and. Access free, 10.09.2020.
19. Boukhvalova M.S., Prince G.A., Blanco J.C. The cotton rat model of respiratory viral infections // Biologicals. 2009. Vol. 37. N. 3. P. 152-159. DOI: 10.1016/j.biologicals.2009.02.017.
20. Murphy B.R., Sotnikov A.V., Lawrence L.A., Banks S.M., Prince G.A. Enhanced pulmonary histopathology is observed in cotton rats immunized with formalin-inactivated respiratory syncytial virus (RSV) or purified F glycoprotein and challenged with RSV 3-6 months after immunization // Vaccine. 1990. Vol. 8. N. 5. P. 497-502. DOI: 10.1016/ 0264-410x(90)90253-i.
21. Schneider-Ohrum K., Cayatte C., Bennett A.S. et al. Immunization with Low Doses of Recombinant Postfusion or Pre-fusion Respiratory Syncytial Virus F Primes for Vaccine-Enhanced Disease in the Cotton Rat Model Independently of the Presence of a Th1-Biasing (GLA-SE) or Th2-Bia-sing (Alum) Adjuvant // J. Virol. 2017. Vol. 29. N. 91(8). P. e02180-16. DOI: 10.1128/JVI.02180-16.
22. Дрейзин Р.С., Вышневецкая Л.О., Багдамян Е.Ф. и др. Изучение экспериментальной РС вирусной инфекции
в хлопковых крысах. Вирусологические и иммунофлу-оресцентные исследования // Вопросы вирусологии. 1971. Т. 16. С. 670-676. [Dreizin R.S., Vyshnevetskaia L.O., Bagdamian E.F. et al. Experimental RS virus infection of cotton rats. A viral and Immunofluorescent study // Voprosy Virusologii. 1971. Vol. 16. P. 670-676. (In Russ.)].
23. Prince G.A., Jenson A.B., Horswood R.L., Camargo E., Cha-nock R.M. The pathogenesis of respiratory syncytial virus infection in cotton rats // Am. J. Pathol. 1978. Vol. 93. N. 3. P. 771-791.
24. Prince G.A., Horswood R.L., Berndt J., Suffin S.C., Cha-nock R.M. Respiratory syncytial virus infection in inbred mice // Infect. Immun. 1979. Vol. 26. N. 2. P. 764-766. DOI: 10.1128/IAI.26.2.764-766.1979.
25. Prince G.A., Jenson A.B., Hemming V.G. et al. Enhancement of respiratory syncytial virus pulmonary pathology
in cotton rats by prior intramuscular inoculation of formalin-inactivated virus // J. Virol. 1986. Vol. 57. N. 3. P. 721728. DOI: 10.1128/JVI.57.3.721-728.1986.
26. Niewiesk S., Prince G. Diversifying animal models: the use of hispid cotton rats (Sigmodon hispidus) in infectious diseases // Lab. Anim. 2002. Vol. 36. N. 4. P. 357-372. DOI: 10.1258/002367702320389026.
27. Green M.G., Huey D., Niewiesk S. The cotton rat (Sigmodon hispidus) as an animal model for respiratory tract infections with human pathogens // Anim. (NY). 2013. Vol. 42. N. 5. P. 170-176. DOI: 10.1038/1aban.188.
28. Hanson J.M., Anderson L.J., Williams C.M., Jorquera P., Tripp R.A. Passive narcosis for anesthesia induction in cotton rats (Sigmodon hispidus) // Lab. Anim. (NY). 2016. Vol. 23. N. 45 (9). P. 333-337. DOI: 10.1038/ laban.1084.
Информация об авторах
М.В. Сергеева, кандидат биологических наук,
ведущий научный сотрудник лаборатории
векторных вакцин, mari.v.sergeeva@gmail.com,
https://orcid.org/0000-0003-0411-9896
А.А. Пулькина, научный сотрудник лаборатории векторных вакцин,
https://orcid.org/0000-0001-8609-8093 А.А. Штро, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией химиотерапии вирусных инфекций, https://orcid.org/0000-0002-2295-1881
К.А. Васильев, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории векторных вакцин,
https://orcid.org/0000-0002-7750-9652
Е.А. Романовская-Романько, кандидат
биологических наук, старший научный
сотрудник лаборатории векторных вакцин,
https://orcid.org/0000-0001-7560-398X
А.В. Гаршинина, научный сотрудник
лаборатории химиотерапии вирусных инфекций,
https://orcid.org/0000-0002-6202-808X
А.В. Галочкина, кандидат биологических наук,
ведущий научный сотрудник лаборатории
химиотерапии вирусных инфекций,
https://orcid.org/0000-0002-3208-8006
А.А. Мужикян, кандидат ветеринарных наук,
ведущий научный сотрудник лаборатории
векторных вакцин,
https://orcid.org/0000-0002-7093-0014 Ж.В. Бузицкая, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории векторных вакцин,
https://orcid.org/0000-0002-8394-102X
М.А. Стукова, кандидат медицинских наук,
заведующий лабораторией векторных вакцин,
https://orcid.org/0000-0002-2127-3820
ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева»
Минздрава России,
197376, Россия, Санкт-Петербург,
ул. Профессора Попова, 15/17.
Information about the authors
M.V. Sergeeva, PhD, leading researcher in the laboratory of vector vaccines, mari.v.sergeeva@gmail.com, https://orcid.org/0000-0003-0411-9896
A.A. Pulkina, researcher in the laboratory of vector vaccines,
https://orcid.org/0000-0001-8609-8093 A.A. Shtro, PhD, head of the laboratory of chemotherapy for viral infections, https://orcid.org/0000-0002-2295-1881 K.A. Vasiliev, PhD, researcher in the laboratory of vector vaccines,
https://orcid.org/0000-0002-7750-9652 E.A. Romanovskaya-Romanko, PhD, senior researcher in the laboratory of vector vaccines, https://orcid.org/0000-0001-7560-398X A.V. Garshinina, researcher in the laboratory of chemotherapy for viral infections, https://orcid.org/0000-0002-6202-808X
A.V. Galochkina, PhD, leading researcher in the laboratory of chemotherapy for viral infections,
https://orcid.org/0000-0002-3208-8006 A.A. Muzhikyan, PhD, leading researcher in the laboratory of vector vaccines, https://orcid.org/0000-0002-7093-0014
J.V. Buzitskaya, PhD, researcher in the laboratory of vector vaccines,
https://orcid.org/0000-0002-8394-102X M.A. Stukova, PhD, head of the laboratory of vector vaccines,
https://orcid.org/0000-0002-2127-3820 Federal State Budgetary Institution "Influenza Research Institute named after A.A. Smorodintsev" of the Ministry of Health of Russia, 197376, Russia, Saint-Petersburg, Prof.Popova str., 15/17.
Вклад авторов в написание статьи
М.В. Сергеева — концепция и дизайн
экспериментов, визуализация данных
и подготовка текста рукописи, критический
анализ полученных результатов.
А.А. Штро — концепция и дизайн экспериментов.
М.А. Стукова — концепция и дизайн
экспериментов, редактирование рукописи.
А.А. Пулькина — культивирование и титрование
вирусов, интерпретация результатов.
К.А. Васильев — манипуляции с животными,
сбор первичных данных.
Е.А. Романовская-Романько —
культивирование и титрование вирусов,
интерпретация результатов.
А.В. Гаршинина — манипуляции с животными,
сбор первичных данных.
А.В. Галочкина — манипуляции с животными, сбор первичных данных.
А.А. Мужикян — гистологический анализ.
Ж.В. Бузицкая — редактирование рукописи.
Authors contribution
M.V. Sergeeva — concept and design of experiments, data visualization and preparation of the text of the manuscript, critical analysis of the results obtained.
A.A. Shtro — concept and design of experiments. M.A. Stukova — concept and Besign of yxperiments, manuscript editing.
A.A. Pulkina — cultivation and titration of viruses,
interpretation of results.
K.A. Vasiliev — manipulations with animals,
collection of primary data.
E.A. Romanovskaya-Romanko — cultivation
and titration of viruses, interpretation of results.
A.V. Garshinina — manipulations with animals,
collection of primary data.
A.V. Galochkina — manipulations with animals,
collection of primary data.
A.A. Muzhikyan — histological analysis.
Zh.V. Buzitskaya — editing the manuscript.
Сведения о конфликте интересов Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
Дата поступления рукописи
в редакцию: 31.08.2022
Дата рецензии статьи: 07.10.2022
Дата принятия статьи к публикации: 20.10.2022
Received: 31.08.2022 Reviewed: 07.10.2022 Accepted for publication: 20.10.2022
