CC BY
157
УДК 579.61:615.373.3
ОПЫТ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУННЫХ СЫВОРОТОК ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
© Алиева Е.В., Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Лаврешин М.П., Афанасьев Н.Е., Горобец Е.А., Семирчева А.А., Миронов А.Ю.
Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора,
Ставрополь;
НИЦ Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова, Москва
Разработаны эффективные схемы иммунизации для получения гипериммунных сывороток, основанные на оптимальной комбинации специфических белковых антигенных комплексов с иммунокорректорами ти-могеном либо иммунофаном, обеспечивающие высокий специфический иммунный ответ у 100% животных, значительное сокращение сроков иммунизации, материальных и трудозатрат. Полученные гиперим-мунные сыворотки являются высококачественным биологическим сырьем для их применения при изготовлении различных иммунобиологических препаратов.
Ключевые слова: антиген, антитело, иммунные сыворотки, иммунизация, иммунокорректор.
EXPERIENCE IN OBTAINING IMMUNE SERA FOR PRODUCTION OF DISGNOSTIC
REAGENTS
Alieva E.V., Tyumentseva I.S., Afanasiev E.N., Lavreshin N.P., Afanasiev N.E., Gorobets E.A.,
SemirchevaA.A., MironovА.Yu.
Stavropol Scientific-Research Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor, Stavropol;
Scientific-Research Center of the I.M. Sechenov Moscow Medical Academy, Moscow
The effective schemes of immunization for obtaining hyperimmune sera based on the optimal combination of specific protein antigen complexes with thymogen or immunofan used as immunocorrectors, which provide the high specific immune response in 100% of animals, and the significant reduction of the time of immunization, expenditures of material and labour have been developed. The hyperimmune sera obtained are high-quality biological raw material to be used for the production of various immunobiological reagents.
Key words: antigen, antibody, immune sera, immunization, immunocorrector.
Большинство иммунологических методов исследования предусматривают применение иммунных сывороток, получаемых из крови животных, иммунизированных различными АГ, при этом их активность существенно влияет на результаты исследования. Для получения сывороток необходимо подобрать рациональную схему иммунизации животных. Под этим подразумевают прежде всего такие факторы, как физико-химическое состояние АГ, дозы, способы, интервалы и кратность введения АГ, общую продолжительность цикла иммунизации, применение адъювантов и иммуномодуляторов.
Общеизвестна зависимость антителообра-зования от дозы АГ, вводимого животному. В малых дозах АГ обычно даёт недостаточное иммунозащитное раздражение, а в слишком больших - вызывает, так называемое, имму-низаторное утомление, приводящее к сниже-
нию титров АТ. При введении больших доз АГ образуются АТ с низким аффинитетом и их синтез продолжается в течение длительного периода времени. Уменьшая дозу, можно подобрать такую, которая будет индуцировать образование высокоаффинных АТ [14].
Результаты изучения зависимости антите-лообразования от кратности введения АГ свидетельствуют о совершенно очевидном преимуществе многократной иммунизации перед однократной. Интервалы между инъекциями иммуногена выбираются эмпирическим путем, причём результаты опытов обычно могут быть использованы только применительно к данному конкретному препарату.
Прослеживается зависимость между способом введения АГ и уровнем АТ в сыворотке крови животных. Основными причинами различия эффективности являются скорость,
с которой АГ распространяется от места инъекции, и вероятность его прохождения через лимфатические узлы и другие органы иммунной системы [17].
Как полагает Т. Чард [16], одна и та же конечная цель может быть достигнута различными путями, но в любом случае, схема иммунизации, предлагаемая для производства, должна соответствовать определенным требованиям, главное из которых - возможность получения сывороток с достаточно высоким титром специфических АТ за сравнительно короткий промежуток времени при минимальном расходовании антигенного и другого материала.
Цель исследования - получение высокоактивных, специфичных гипериммунных сывороток против белковых антигенных комплексов из различного биологического материала, являющихся качественным биологическим сырьем для конструирования медицинских иммунобиологических препаратов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В опытах использованы 150 кроликов обоего пола породы Шиншилла, массой 3-3,5 кг. В процессе содержания животных поддерживали рекомендуемый режим питания согласно приказу № 1179 [10]. Все процедуры на экспериментальных животных проводили согласно методическим рекомендациям [4, 7].
Титр специфических АТ в сыворотках определяли в непрямой реакции иммунофлуоресценции (НРИФ) [21].
Количественное определение белка проводили методом сравнения поглощения белков при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 [9, 20].
Специфическую активность АГ и полученных иммунных сывороток определяли в реакции иммунодиффузии (РИД) в 1% агаровом геле ^Ага, USA) [19].
Лиофилизацию биологического материала проводили в камерах TG-5 (Германия) и LZ-9c (Чехия).
Для подтверждения воспроизводимости и достоверности результатов, полученных при исследовании, применяли методы вариационной статистики, изложенные в работах [2,
13, 11]. При оценке доверительного коэффициента исходили в каждом случае из степени числа свобод выбранной точности 95%.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для изготовления тест-систем иммуно-ферментных, магноиммуносорбентных, иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих, диагностикумов эритроцитарных требуются гипериммунные сыворотки с преимущественным количеством преципитинов. Это можно объяснить тем, что при исследовании корпускулярных АГ титры АТ при первичном и вторичном иммунном ответе мало различаются. При введении животным растворимых АГ резко увеличивается синтез АТ при вторичном иммунном ответе [6, 18].
Для получения гипериммунных сывороток применяли белковые антигенные комплексы из различного биологического материала, адъюванты и иммунокорректоры, обладающие разнообразным биологическим действием.
Попытки иммунизации кроликов по схеме, состоящей из последовательных многоточечных внутрикожных введений АГ с полным адъювантом Фрейнда, приводили к иммунному ответу лишь у 25-30% иммунизируемых животных, при этом длительность иммунизации составляла 2,5-3 месяца, а у кроликов развивалась адъювантная болезнь.
В дальнейшем в качестве иммуномодулирующего вещества применён феракрил (смесь железных (II, III) солей полиакриловой кислоты), который способен вызывать выраженное увеличение антителообразующих Т- и В-клеток [5]. Изменена схема иммунизации: грундиммунизация включала пять последовательных парентеральных введений смеси АГ с 3% водно-спиртовым раствором феракрила с интервалами в 3-7 дней. Через 30 суток после последней инъекции АГ у животных брали из краевой вены уха кровь и отделяли не менее 4 мл иммунной сыворотки, в которую добавляли АГ с целью получения комплекса АГ-АТ. Основной цикл иммунизации состоял из четырех внутривенных инъекций комплекса АГ-АТ через каждые 3-4 дня тому же животному, от которого была получена иммунная сыворотка. При такой схеме иммуниза-
ции получили кроличьи гипериммунные сыворотки с высокой специфической активностью в иммунологических реакциях. При этом иммуностимулирующий эффект при отсутствии токсического воздействия на животное, без возникновения адъювантной болезни достигался у 95% кроликов. Что же касается продолжительности цикла иммунизации, то она не всегда приемлема, поскольку конечные результаты достигались не ранее 49-54 дней.
С учётом накопленного опыта и теоретических предпосылок предложена и экспериментально обоснована новая схема иммунизации животных: антигенный материал пятикратно вводили внутривенно, одновременно внутримышечно в качестве иммуномодулятора инъецировали тималин, в третью инъекцию дополнительно вводили внутримышечно циклофосфан [12]. Использование в качестве иммуномодулятора тималина способствовало значительному повышению титров специфических сывороточных АТ за счёт увеличения числа антителопродуцирующих клеток в результате стимуляции функции макрофагов и хелперных Т-клеток. Циклофосфан, являясь классическим иммуносупрессором, также активизировал макрофаги, стимулируя фагоцитарную, цитотоксическую и супрессивную (в отношении главным образом Т-лимфоцитов) функции [8]. Такая избирательность в действии иммуностимулятора, с одной стороны, и определенная селективность в действии иммуносупрессора - с другой, служили оптимальной комбинацией препаратов обеих групп и режимов их использования для активации одних механизмов иммунитета и выключения других. При данном способе продолжительность цикла иммунизации составляла 31-35 дней, расход антигенного материала - 7550 мкг на одного кролика. Титры специфических АТ в сыворотках животных при определении в РИД достигали показателей 1:15,4±1,25 - 1:28,8±2,5, а в НРИФ - не ниже 1:13926,4±1372,16. Такие характеристики соответствовали требованиям оценки сырья для производства иммунобиологических препаратов.
Дальнейшие исследования позволили предложить новую схему гипериммунизации кроликов с одним иммунокорректором - ти-могеном, при этом удалось значительно сни-
зить антигенную нагрузку при иммунизации. Применение тимогена сопровождалось мобилизацией регуляторных и эффекторных механизмов адаптации организма к воздействию ксенобиотических факторов. Согласно концепции пептидного регуляторного каскада, после его экзогенного введения в организме происходило освобождение других пептидов, для которых исходный пептид служит индуктором. Биологическое действие тимогена реализовалось на уровне предшественников Т-клеток. Эффекты препарата на клеточном уровне включали в себя специфическое связывание с мембраной лимфоцитов, активацию систем вторичных посредников и регуляцию функционального состояния лимфоидных клеток через цАМР-зависимые проте-икиназы [3, 15].
Схема иммунизации состояла из следующих манипуляций: кроликам вводили внутривенно каждые пять дней белковый антигенный комплекс в увеличивающихся дозах. В эти же сроки внутримышечно инъецировали по 10 мкг тимогена. На 7-10 день после последнего введения иммуногена животных кровопускали. Активность гипериммунных сывороток, полученных по этой схеме, в РИД составляла 1:28,8±2,5 - 1:53,3±5,01, в НРИФ - 1:13926,4±1372,16 - 1:24576±2744,32.
Благодаря применению иммунокорректора тимогена, обладающего полифункцио-нальным действием, значительно сокращены дозировки вводимого антигенного материала (с 7550 мкг до 450 мкг), иммунокорректора -в 500 раз, длительность процесса иммунизации с 35 дней до 22 дней, при этом повышен выход целевого продукта за счёт увеличения антителообразования у животных с одновременным уменьшением трудозатрат [1].
Обнадеживающие результаты получены при использовании иммунокорректора иммунофана - синтетического гексопептида (Cз6H61O10N12), способного резко увеличивать титры и длительность циркуляции специфических АТ. После пятикратного внутривенного введения АГ на фоне внутримышечных инъекций иммунофана удалось получить относительно сходные результаты практически у 100% животных.
При сопоставлении достигнутых показателей как по продолжительности иммунизации, так и специфической активности полу-
