CC BY
77
ХАРАКТЕРИСТИКА ФУНКЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ
ПРИ ГРИППЕ У БОЛЬНЫХ СРЕДНЕГО ВОЗРАСТА
И. В. РОГАНОВА
Изучено функциональное состояние эритроцитов при среднетяжелом неосложненном течении гриппа у 44 больных 36-50 лет. Контрольную группу составили 16 практически здоровых людей. Использовали методы биомикроскопии сосудов конъюнктивы, определяли агрегационную способность, относительную вязкость эритроцитов.
Выявлено замедление кровотока по системе микроциркуляции с агрегацией эритроцитов, сладж-феномен, микротромбообразование, повышение вязкости эритроцитов. Максимальная выраженность сладж-феномена развивается на 4-8 дни, микрогемор-рагического синдрома и микротромбообразования на 6-8 дни, вязкости эритроцитов на 1-8 дни. С 1-3 дня болезни преобладает !!!-!У, на 6-8 дни !!!-!У степень, через месяц от начала заболевания - !! степень агрегации эритроцитов. Нарушения состояния и функции эритроцитов у больных сохраняются длительно.
Изменение функционального состояния эритроцитов при гриппе является фактором риска развития осложнений, в том числе после перенесенного заболевания, что необходимо учитывать при лечении и проведении реабилитационных мероприятий.
Ключевые слова: грипп, эритроциты, сладж-феномен, микротромбообразование, микрогеморра-гический синдром, агрегационная способность, вязкость
DESCRIPTION OF THE ERYTHROCYTES
IN PATIENTS OF MIDDLE AGE WITH INFLUENZA
ROGANOVA I. V.
Functional status of erythrocytes at moderate uncomplicated influenza in 44 patients of 36-50 years of age was studied. The control group consisted of l6 healthy people. Methods of biomicroscopy of the conjunctiva vessels were used, the aggregation ability, the relative viscosity of red blood cells was determined.
Slowing-down of blood flow in the microcirculation system with the aggregation of red blood cells, sludge phenomenon, microthrombogenesis, and increasing viscosity of red blood cells was revealed. The maximum intensity of sludge-phenomenon develops for the 4-8 days, microhe-morrhagic syndrome and microthrombogenesis - for the
6-8 days, the viscosity of red blood cells foe the 1-8 days. From the 1-3 days of illness the III-IV degree prevails, for the 6-8 days - the III-IV degree, a month later after the onset - the II degree of aggregation of red blood cells. Impairments of state and function of red blood cells in patients persist for a long time.
Change of the functional state of erythrocytes at influenza is a risk factor for complications, including those after the disease that must be considered at treatment and conducting of rehabilitation activities.
Key words: influenza, erythrocytes, sludge phenomenon, microthrombogenesis, microhemorrhagic syndrome, aggregation, viscosity
© Коллектив авторов, 2012 УДК 579.841.95:576.8.077.3
АНТИГЕНЫ И АНТИСЫВОРОТКИ РЯЛМСКЕИЛ ТШЛЯЕШК: К ВОПРОСУ ИММУНОДИАГНОСТИКИ ТУЛЯРЕМИИ
И. С. Тюменцева1, Е. Н. Афанасьев1, Е. В. Алиева2, С. А. Курчева1, Ю. Ю. Гаркуша1
1 Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт
2 Ставропольская государственная медицинская академия
Тюменцева Ирина Степановна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая научно-производственной лабораторией препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций Ставропольского научноисследовательского противочумного института, тел.: (8652)264039, 89283022096, e-mail: stav-diagn@mail.ru.
Афанасьев Евгений Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник научнопроизводственной лаборатории препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций Ставропольского научно-исследовательского противочумного института, тел.: (8652)264039, 89283062908, e-mail: stav-diagn@mail.ru.
Алиева Елена Васильевна, доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической фармакологии, бактериологии, аллергологии, иммунологии ИПДО Ставропольской государственной медицинской академии, тел.: (8652)551567, (8652)913896, e-mail: elalieva.ru@rambler.ru.
Курчева Светлана Александровна, научный сотрудник научнопроизводственной лаборатории препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций Ставропольского научноисследовательского противочумного института, тел.: (8652)264039, 89187758590, e-mail: labdiagn@yandex.ru.
Гаркуша Юлия Юрьевна, младший научный сотрудник научнопроизводственной лаборатории препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций Ставропольского научноисследовательского противочумного института, тел.: (8652)264039, 89624433739, e-mail: labdiagn@yandex.ru.
Туляремия - природно-очаговая особо опасная инфекция, которая остается актуальной проблемой в инфекционной патологии человека. Возбудитель туляремии Ргап&веПг (Р.) №!агепв1в, циркулируя в природных очагах, может вызвать значительные вспышки заболевания.
Анализ заболеваемости туляремией в федеральных округах Российской Федерации за период с 1988 по 2010 г. показал, что в стране зарегистрированы более 2000 случаев инфекции, при этом наибольшее число больных туляремией - в Центральном федеральном округе, на них приходилось 52 % от заболеваемости в РФ. В Южном и Северо-Кавказском федеральных округах природные очаги занимают более 65 % их территории, за указанный период выявлено 11 % больных от заболеваемости в РФ. Эти очаги имеют полиго-стальный и поливекторный характер, с чередованием волн эпизоотической и эпидемиологической активности каждые 8-10 лет [1, 4, 5].
В связи с этим лабораторная диагностика туляремии имеет важнейшее значение в комплексе противоэпидемических мероприятий и складывается из индикации и идентификации возбудителя или его
специфических антигенов (Аг) и определения сывороточных антител (Ат) у человека и восприимчивых животных. При этом, как правило, на практике предпочтение отдается иммунодиагностике, характеризующейся экспрессностью, высокой специфичностью и чувствительностью. К настоящему времени для диагностики туляремии отечественными и зарубежными учеными предложено значительное количество эффективных иммунодиагностических тестов. Однако большая их часть - экспериментальные разработки [7].
Цель исследования: получение специфических туля-ремийных антигенов и иммунных сывороток, конструирование на их основе различных иммунодиагностических препаратов.
Материал и методы. В работе использовали штаммы F. tularensis разных подвидов: F. tularensis 543/6 (mediaasiatica); F. tularensis Schu (nearctica); F. tularensis 83 eryS; F. tularensis 503/840; F. tularensis Miura, F. tularensis 325/1765 (holarctica) и вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ (ЖТВ).
В опытах использованы 50 кроликов породы шиншилла массой 3-3,5 кг
Диск-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) осуществляли по H. Maurer [10] на аппарате с вертикальными гелевыми пластинами LKB (Швеция). Электрофоретическую подвижность белковых фракций антигенов (Rf) рассчитывали по K. Weber и M. Osborn [15]. Для контроля активности антигенов и антисывороток применяли реакцию иммунодиффузии (РИД) по О. Ouchterlony [12]. Контроль титра специфи-
ческих антител в сыворотках определяли в реакции непрямой иммунофлуоресценции (НРИФ) по T. H. Weller, A. H. Coons [16]. Для выделения иммуноглобулинов (IgG) использовали сульфатный метод [6]; метод фракционирования полиэтиленгликолем [13] и каприловой кислотой [14].
Конъюгацию IgG с флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) фирмы «Sigma» проводили по Н. Stortz [14]. Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом пероксидатного окисления [11].
Статистическую обработку полученных результатов проводили, оценивая дисперсию, стандартное отклонение, доверительный интервал выборки из результатов эксперимента с использованием компьютерной программы Microsoft Office Excel, 2007.
Результаты и обсуждение. Антигенные вещества различной химической природы удалось получить комплексным методом с применением ряда специальных манипуляций (рис. 1). Экстракция осадка 2,5 % раствором NaCl и выделение второго супернатанта позволяли в максимальной степени извлекать антигены из бактериальной массы, а фракционирование сульфатом аммония, помимо концентрирования и очистки, приводило к стабилизации белков. В конечном итоге получен наиболее полный антигенный комплекс из микробов с сохранением нативности биополимеров.
Изучение методом диск-электрофореза в ПААГ белкового спектра Аг F. tularensis различных подвидов показало, что при разделении образуется от 6 до 10 белковых зон (рис. 2).
Обеззараженная хлороформом бакмасса F. tularensis
Экстракция раствором NaCl (2,5%), 48 ч
Супернатант
Центрифугирование при 20000 об/мин, 30 мин
Осадок микробных клеток
Фракционирование сульфатом аммония до 80 % насыщения при инкубации 16-18 ч при 4 °С
Ресуспендирование в 0,9 % растворе NaCl и замораживание при минус 40 °С
Центрифугирование при 20000 об/мин, 30 мин
—~y^z-----------------
Разрушение в экструдере (4-х кратно)
Осадок
Ресуспендирование в 0,9 % растворе NaCl. Поверхностные белки микробной клетки. Фракция I
Центрифугирование при 20000 об/мин, 30 мин
Супернатант. Белково-полисахариднолипидный комплекс. Фракция П
Детрит
Ресуспендирование в 0,9 % растворе NaCl с твин 80
Количественное Объединение
определение белка. фракций
Розлив в ампулы. 1+П+Ш.
Лиофилизация. Диализ
против ДН2О
Супернатант. Мембранные, рибосомальные, оболочечные белки. Фракция Ш
УЗ-дезинтеграция
Центрифугирование при 20000 об/мин 20 мин
Рис. 1. Биотехнологическая схема получения водорастворимых антигенных комплексов F. tulаrensis
Обозначения:
1 - F. tularensis 15
НИИЭГ (ЖТВ);
2 - F. tularensis 83 ery5 ;
3 - F. tularensis 503/840;
4 - F. tularensis 543/6;
5 - F. tularensis Miura;
6 - F. tularensis Schu;
7 - F. tularensis
325/1765
Рис. 2. Протеинограмма водорастворимых антигенов F. Tularensis
При анализе протеинограмм туляремийных Аг, выделенных из штаммов голарктического подвида, было выявлено, что их белковый спектр состоял из
7-10 фракций с величинами Rf, лежащими в пределах 0,1-0,87. Протеинограмма неарктического подвида (F. tularensis Schu) характеризовалась наличием 9 белковых фракций с Rf в пределах 0,33-0,8. Про-теинограмма штамма живой туляремийной вакцины состояла из 6 белковых фракций (Rf 0,11-0,76). Общими с голарктическими и неарктическим штаммами были фракции с Rf 0,11; 0,65; 0,69; 0,76. Белковый спектр авирулентного штамма F. tularensis 325/1765 голарктического подвида был представлен 9 белковыми фракциями с электрофоретической подвижностью в пределах Rf от 0,02 до 0,78. Штамм F. tularensis 325/1765 имел общую белковую фракцию Rf 0,65 со всеми исследованными штаммами. Кроме того, выявлен еще ряд общих белковых фракций с другими штаммами туляремийного микроба: Rf 0,33 - F. tularensis 83 eryS, F. tularensis 503/840, F. tularensis Miura, F. tularensis Schu; Rf 0,51 и 0,78 - F. tularensis Miura; Rf 0,69 - F. tularensis Schu и 15 НИИЭГ.
На основании проведенных исследований для дальнейшей работы нами выбраны три штамма F. tularensis разных подвидов: F. tularensis 543/6 (mediaasiat-ica), F. tularensis Schu (nearctica) и F. tularensis 503/840 (holarctica). Объединив стерильные бакмассы (этих штаммов) ana, изолировали полигрупповой водорастворимый Аг по схеме, описанной ранее.
Иммунные туляремийные сыворотки получали по разработанным нами схемам иммунизации кроликов-продуцентов, используя иммунокорректоры тималин с циклофосфаном и тимоген, обладающие различным механизмом действия, иммуногеном при этом служил полигрупповой туляремийный водорастворимый антиген.
Использование в качестве иммуномодулятора тималина способствовало значительному повышению титров специфических сывороточных Ат за счет увеличения числа антителобразующих клеток в результате стимуляции функции макрофагов и хелпер-ных Т-клеток. Циклофосфан, являясь классическим иммуносупрессором, также активизировал макрофаги, стимулируя фагоцитарную, цитотоксическую
и супрессивную (в отношении главным образом Т-лимфотцитов) функции [3]. Такая избирательность в действии иммуностимулятора, с одной стороны, и определенная селективность в действии иммуносупрессора, с другой, служили оптимальной комбинацией препаратов обеих групп и режимов их использования для активации одних механизмов иммунитета и выключения других. При данном способе продолжительность цикла иммунизации составляла 3135 дней, расход антигенного материала - 7550 мкг на одного кролика. Титры специфических антител в сыворотках животных при определении в РИД достигали показателей 1:15,4±1,25-1:28,8±2,5, а в НРИФ -не ниже 1:13926,4±1372,16.
Дальнейшее проведение исследований позволило предложить новую схему гипериммунизации кроликов с одним иммунокорректором - тимогеном, применение которого сопровождалось мобилизацией регуляторных и эффекторных механизмов адаптации организма к воздействию ксенобиотических факторов. Согласно концепции пептидного регуляторного каскада, после его экзогенного введения в организме происходило освобождение других пептидов, для которых исходный пептид служит индуктором. Биологическое действие тимогена реализовалось на уровне предшественников Т-клеток. Эффекты препаратов на клеточном уровне включали в себя специфическое связывание с мембраной лимфоцитов, активацию систем вторичных посредников и регуляцию функционального состояния лимфоидных клеток через цАМР-зависимые протеикиназы [8, 2].
Благодаря применению иммунокорректора тимогена, обладающего полифункциональным действием, значительно сокращены дозировки вводимого антигенного материала (с 7550 мкг до 450 мкг), иммунокорректора - в 500 раз, длительность процесса иммунизации - с 35 до 22 дней.
Для повышения специфичности полученных гипер-иммунных сывороток мы проводили сорбцию пере-крестнореагирующих антител с помощью твердофазного аффинного сорбента на основе алюмосиликата, так как применение в качестве адсорбентов микробных клеток, широко распространенное в сывороточном производстве, приводило к существенному снижению титров специфических Ат.
Проведя конъюгацию 1дО с ФИТЦ и перокси-дазой хрена, мы получили иммуноглобулины диагностические туляремийные флуоресцирующие и тест-систему диагностическую для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе. Для определения туляремийных сывороточных антител изготовлен антигенный иммунопероксидазный конъюгат, при конструировании которого применили полигрупповой водорастворимый белковый комплекс. Используя формалинизированные бараньи эритроциты, а в качестве сенситина туляремийные IдС и антиген, разработали биотехнологию производства эритроцитарных антигенного и иммуноглобулинового диагностикумов.
Диагностическая ценность названных иммунобиологических препаратов подтверждена многочисленными лабораторными испытаниями, исследованиями различного полевого (клещи, грызуны, вода открытых водоемов) и клинического материала (сыворотки людей). Успешные государственные испытания дали возможность зарегистрировать эти диагностикумы в Росздравнадзоре, и это позволило наладить их коммерческий выпуск.
Заключение. Изолированы специфические ту-ляремийные антигены и получены высокоактивные иммуноглобулины класса О, что позволило создать препараты для иммунодиагностики туляремии, индикации ее возбудителя и наладить их производственный выпуск.
Литература
1. Бейер, А. П. Эпидемиологическая обстановка по опасным, зоонозным и природно-очаговым инфекционным болезням на территории СевероКавказского федерального округа / А. П. Бейер [и др.] // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств - участников СНГ : материалы Х Межгос. науч.-практ. конф. государств - участников СНГ / под ред. Г. Г. Онищенко, В. В. Кутырева, А. Н. Куличенко. -Ставрополь, 2010.- С. 19-20.
2. Влияние тимических иммуномодуляторов на систему циклических нуклеотидов Т-лимфоцитов селезенки при вакцинации БЦЖ / С. В. Демидов [и др.] // Проблемы туберкулеза. - 1990. -№ 10. - С. 63-65.
3. Лазарева, Д. Н. Стимуляторы иммунитета / Д. Н. Лазарева, Е. К. Алехин. - М. : Медицина, 1985. - 255 с.
4. Малецкая, О. В. Зоонозные особо опасные инфекции на территории Чеченской Республики / О. В. Малецкая, Г. М. Грижебовский, Т. А. Мир-зоева // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств - участников СНГ : материалы Х Межгос. науч.-практ. конф. государств - участников СНГ / под ред. Г. Г. Онищенко, В. В. Кутырева, А. Н. Куличенко. -Ставрополь, 2010. - С. 79-80.
5. Мещерякова, И. С. Туляремия: современная эпидемиология и вакцинопрофилактика / И. С. Мещерякова // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2010. - № 2. - С. 17-22.
6. Остерман, Л. А. Очистка иммуноглобулина типа 1дО / Л. А. Остерман // Исследование биологи-
ческих макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. Иммуноэлектрофорез. - М. : Наука, 1983. - Ч. II. - С. 107-109.
7. Сырова, Н. А. Современное состояние иммунодиагностики туляремии / Н. А. Сырова, З. Л. Те-решкина, З. Л. Девдариани // Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 2008. - Вып. 97. -С. 12-15.
8. Хавинсон, В. Х. Тималин - иммуномодулирующий препарат из тимуса / В. Х. Хавинсон, В. Г. Мороз // Тимус и его влияние на организм. - Томск : Изд-во Томского университета, 1982.- С. 201-203.
9. Шторц, Х. Иммунофлуоресценция / Х. Шторц // Иммунологические методы. - М. : Медицина, 1987.- С. 128-148.
10. Maurer, H.(Маурер, Г.)Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле / Н. Maurer (г. Маурер). - М. : Мир, 1971. -248 с.
11. Nakane, P. K. Peroxidase-labelled antibody - a new method of conjugation / P K. Nakane, A. Kawaoi // J. Histochem. Cytochem. - 1974. - Vol. 22, № 4. -P 506-508.
12. Ouchterlony, O. Antigen-antibody reactions in gel / O. Ouchterlony // Arkiv for Kemi. Mineral. O Ged. -1949. - Vol. 261, № 14. - P 1-9.
13. Polson, A. The fractionation of protein mixtures by linear polymers of higth molecular weigh / A. Polson,
G. M. Potgieter, J. E. Largier // Biochem. Biophis. Acta. - 1964. - Vol. 82. - P 463-475.
14. Steibuch, G. The isolation of IgG from imanalion ser-ra with the acid of caprilic / G. Steibuch, R. Andran // Arch. оf Biochem. Stray and Biophys. - 1969. -Vol. 139. - P 279-284.
15. Weber, R. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis / R. Weber, M. Osborn // J. Biol. Chem. - 1969. - Vol. 244. - № 16. - P 44064412.
16. Weller, T. H. Fluorescent antibody studies with agents of varicella and herpes zoster propagated in vitro / T. N. Weller, A. H. Coons // Proc. Soc. Exp. Biol. - 1954. - Vol. 86. - P 789-794.
АНТИГЕНЫ И АНТИСЫВОРОТКИ Р. TULARENSIS:
К ВОПРОСУ
ИММУНОДИАГНОСТИКИ ТУЛЯРЕМИИ
И. С. ТЮМЕНЦЕВА, Е. Н. АФАНАСЬЕВ,
Е. В. АЛИЕВА, С. А. КУРЧЕВА, Ю. Ю. ГАРКУША
На основании изучения белковых спектров водорастворимых антигенов и их свойств определены три производственных штамма возбудителя туляремии разных подвидов: F. tularensis 543/6 (mediaasiatica),
F. tularensis БеИи (nearctica) и F. tularensis 503/840 (holarctica), из которых по оригинальной схеме получен полигрупповой белковый антиген. Разработаны эффективные схемы иммунизации для получения ги-периммунных сывороток, основанные на оптимальной комбинации специфических белковых антигенных комплексов с иммунокорректорами тималином, ци-клофосфаном, тимогеном, обеспечивающие высокий специфический иммунный ответ у 100 % животных, значительное сокращение сроков иммунизации. Полученные специфические антигены, иммунные сыворотки и иммуноглобулины использованы для конструирования различных иммунобиологических препаратов для диагностики туляремии и индикации ее возбудителя.
Ключевые слова: туляремия, антигены, иммунные сыворотки, иммуноглобулины, иммунодиагностика
ANTIGENS AND ANTISERA OF F. TULARENSIS:
ON THE ISSUE
OF TULAREMIA IMMUNODIAGNOSIS
TYUMENTSEVA I. S., AFANASYEV E. N.,
ALIEVA E. V., KURCHEVA S. A., GARKUSHA Y. Y.
By studying the spectra of water-soluble protein antigens and their properties three strains of the causative agent of tularemia production of different subspecies are identified: F. tularensis 543/6 (mediaasiatica), F. tularen-sis Schu (nearctica) and F. tularensis 503/840 (holarcti-ca), polygroup protein antigen was obtained from them by the original scheme. The effective immunization schemes were developed to obtain hyperimmune serum, based on the optimal combination of specific protein antigen complexes with immunocorrectors timalin, cyclophosphamide, thymogen providing a high specific immune response in 100% of the animals, a significant reduction in terms of immunization. The obtained specific antigens, antisera and immunoglobulins are used for the construction of various immunobiological products for the diagnosis of tularemia and indication of its pathogen.
Key words: tularemia, antigens, immune sera, immunoglobulins, immunodiagnosis
