CC BY
12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2005 УДК 613.34:628.163.067
Е. Н. Ахапкина, С. Н. Тымчук, Е. /О. Спиридонова, В. Е. Ларин
ОПЫТ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МЕМБРАННЫХ ФИЛЬТРОВ
ДЛЯ САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВОДЫ
Аналитический центр контроля качества воды ЗАО "РОСА", Москва
Качество фильтрующих мембран может оказывать существенное влияние на результаты санитарно-микро-биологических исследований воды при работе мембранным методом. Процедура контроля качества мембранных фильтров (МФ), обязательная для аккредитованных в области исследования воды лабораторий, регламентирована МУ 2.1.4.1057-01 "Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды" [3]. Согласно [3] качество МФ контролируется по проценту кзвлекаемости/удержания — комплексному показателю, позволяющему оценить суммарные потери при посеве способом мембранной фильтрации по сравнению с прямым поверхностным посевом. В качестве эталонного штамма рекомендован штамм Escherichia coli Ml7-02.
В отделе биологических методов анализа ЗАО "РОСА" за период с января 2001 г. по октябрь 2003 г. осуществлен контроль 78 партий МФ разных производителей, в ходе которого было выполнено приблизительно 230 исследований по указанной в МУ 2.1.4.1057-01 [3] схеме.
При проведении контроля МФ согласно рекомендациям МУ 2.1.4.1057-01 была выявлена проблема, связанная с наличием у эталонного штамма Е. coli Ml7-02 индивидуальных особенностей, которые, по нашему мнению, оказывают влияние на объективность биологической оценки удерживающей способности фильтрующих мембран.
Для исключения возможного влияния индивидуальных особенностей штамма Е. coli Ml7-02 на объективность оценки качества МФ были проведены параплель-ные исследования по схеме [3] 48 партий МФ (табл. 1) на двух штаммах — Е. coli М17-02 и альтернативном. В качестве альтернативных штаммов использовали штаммы Е. coli различного происхождения, полученные из ГИСК им. Л. А. Тарасевича или выделенные из природной воды (табл. 2). Дня партий, не прошедших контроль по штамму Е. coli Ml7-02, выполняли одно или несколько повторных исследований с увеличенным в 2 раза количеством повторностей. Для 2 партий МФ "Sartorius" и 1 партии МФ "Millipore" было выполнено исследование с использованием в качестве контрольного материала природной воды с достаточным уровнем целевых микроорганизмов.
Для оценки потерь от прохождения ("просеивания") клеток эталонного микроорганизма через фильтрующую мембрану определяли количество целевых микроорганизмов в фильтрате после фильтрации 10 мл суспензии клеток штамма Е. coli Ml7-02, содержащей приблизительно 107 колониеобразуюших единиц (КОЕ) в 1 мл, через участок МФ площадью 3,14 см2. Посевную дозу готовили по [3]. Фильтрат собирали в стерильную емкость, после чего высевали на среду Эндо методом мембранной фильтрации на проверенные ранее фильтры. После ин-
Таблица
Исследованные МФ
Производитель
Число партий
Материал МФ
ЗАО НТЦ "Владипор" 31
"Sartorius" 9
"Владисарт" 4
"Millipore" 2
"Schleicher & Schuell" 2
Ацетат целлюлозы Нитрат целлюлозы Ацетат целлюлозы Нитрат целлюлозы Смесь эфиров целлюлозы
кубации при 37°С в течение 20—24 ч учитывали количество выросших типичных колоний.
Статистическую обработку данных проводили с использованием критериев Стьюдента, %2, точного критерия Фишера (односторонний вариант) и критерия знаков [1, 2].
Учитывая относительно небольшое количество наблюдений, для анализа результатов использовали односторонний вариант точного критерия Фишера. Нулевой гипотезой послужило предположение о том, что процент удержания МФ данного производителя не зависит от индивидуальных особенностей используемых эталонных штаммов. Рассчитанные значения критерия (р) также представлены в табл. 3. Результаты, полученные для МФ "Sartorius" и МФ "Владипор", отвергают нулевую гипотезу и подтверждают зависимость результатов контроля от выбора эталонного штамма (вероятность подтверждения нулевой гипотезы — р < 0,01) и отсутствие такой зависимости у МФ "Владисарт".
Согласно приведенным в табл. 3 результатам, зависимость итогов контроля МФ "Владисарт" от используемого эталонного штамма не подтвердилась по критерию Фишера. Однако если рассмотреть числовые значения процента удержания, полученные при контроле мембран "Владисарт" на разных штаммах (табл. 4), то очевидна существенная разница между значениями штамма Е. coli М17-02 и процентом удержания альтернативных штаммов. Использование критерия знаков с вероятностью 95% доказывает, что полученные на штамме Е. coli Ml 7-02 результаты достоверно ниже, чем на альтернативном штамме. Это свидетельствует о том, что МФ "Владисарт" также оказывали более выраженное негативное воздействие на штамм Е. coli Ml7-02, чем на другие штаммы данного вида.
Для исследования вероятных потерь от прохождения ("просеивания") клеток эталонного микроорганизма через фильтрующую мембрану были выбраны два разных типа мембран со значительной разницей в эффективности по штамму Е. coli М17-02 и альтернативному штамму (табл. 5). В обоих случаях в фильтратах эталонный штамм Е. coli Ml7-02 не был обнаружен.
При проведении количественного контроля МФ 5 производителей обнаружено наличие определенного негативного воздействия практически всех исследованных партий МФ на жизнеспособность штамма Е. coli МП-
Таблица 2
Тестовые культуры
Штамм
Источник получения
Примечание
Е. coli М17-02 ГИСК им.
E. coli 25922 E. coli ATCC 11775
E. coli 3912/41 E. coli 5845 E. coli 9581 S. aureus 7163 S. aureus 9659
ГИСК им. ГИСК им.
ГИСК им. Р. Москва Р. Москва Р. Москва Р. Москва
JI. А. Тарасевича Рекомендован МУ 2.1.4.1057-01
Л. А. Тарасевича
JI. А. Тарасевича Используется "Schleicher & Schnell" для контроля МФ
Л. А. Тарасевича (ЗАО "РОСА")
(ЗАО "РОСА") Неподвижный (ЗАО "РОСА") (ЗАО "РОСА")
Примечание. В отдельных исследованиях в качестве эталонного материала использовалась природная вода с достаточным содержанием целевых микроорганизмов.
Таблица 3
Результаты сравнительного контроля МФ на разных эталонных штаммах микроорганизмов
МФ "Владипор" МФ "Sartorius" МФ "Владисарт" МФ "Schleicher & Scluiell" МФ "Millipore"
Штамм > 80% < 80% > 80% < 80% 5 80% < 80% > 80% < 80% > 80% < 80%
Число партий
Е. coli М17-02 24 7 3 6
Альтернативный штамм 31 0 9 0
Точный критерий Фишера (р) (односторонний вариант) 0,005 0,005
0,5
0 2 2 0 Н. о.
Примечание. И.о. — критерий не определялся из-за малого количества наблюдений.
1 1 2 0 Н. о.
02. МФ "Владипор", "Sartorius", "Millipore" и "Schleicher & Schuell" не оказывали подобного негативного воздействия на другие штаммы данного вида и микроорганизмы других таксономических групп, использованные в параллельном исследовании.
МФ "Владисарт", возможно, оказывали некоторое негативное воздействие на жизнеспособность не только штамма Е. coli Ml7-02, но и других штаммов Е. coli, однако данное заключение носит предположительный характер в связи с малым количеством исследованных партий МФ данного производителя.
При контроле удерживающей способности некоторых партий МФ "Владипор" наблюдался сливной рост колоний тестового штамма на отдельных секторах мембраны или в виде сплошного газона на всем фильтре, что приводило к невозможности учета результатов контроля. Сливной рост у разных партий наблюдался на 10—100% мембран, взятых в исследование. За анализируемый период было исследовано 60 партий МФ "Владипор" и 18 партий МФ других производителей. Подобный дефект проявился только на МФ "Владипор" при исследовании 29 партий, что составило 48% от общего числа исследуемых партий. Для 18 партий, при контроле которых наблюдался сливной рост, были выполнены повторные исследования. Полученные ранее результаты — наличие сливного роста на части мембран — воспроизводились в 16 повторных исследованиях из 18. Посевная доза во всех исследованиях не превышала допустимую, регламентируемую методическими документами [3] — 25—60 КОЕ для МФ диаметром 35 мм и 25—80 КОЕ для МФ диаметром 47 мм. Тенденцию к сливному росту проявляли только подвижные микроорганизмы (табл. 6).
Табл и ца 4
Процент удержания МФ "Владисарт" для разных эталонных штаммов
Партия Е. coli М17-02 Альтернативный штамм
0002353 9 S1
0101913 (35 мм) 14 58
0101913 (47 мм) 14 62
0101513 39 86
0101513 (повтор) 33 76
0101203 15 63
0101203 (повтор) 12 52
Примечание. В отличие от табл. 3 здесь представлены результаты всех исследований указанных партий МФ, включая повторные.
Таблица 5
Результаты контроля удерживающей способности МФ на двух штаммах
Тип и партия фильтра
Е. coli М17-02
Альтернативный штамм
По-видимому, наличие сливного роста на части мембран или отдельных секторах свидетельствует о неоднородности материала МФ.
В ряде случаев стерилизация фильтров кипячением вызывала деформацию мембран разной степени выраженности, а также уменьшение их линейных размеров, что может значительно затруднять укладку МФ на фритту фильтровальной установки. Например, при контроле одной из партий МФ "Владипор" было обнаружено выраженное уменьшение диаметра мембрань: после кипячения — с 47 до 43 мм.
Итак, результаты проведенных испытаний подтвердили наличие у штамма Е. coli Ml7-02 повышенной чувствительности к неизвестным компонентам материала мембран ряда производителей или к результату их взаимодействия с питательными средами. Очевидно, что МФ в системе микроорганизм—МФ—питательная среда не является инертным механическим ситом, а оказывает влияние на ростовые и культуральные свойства бактерий. К аналогичным выводам пришли зарубежные авторы при изучении влияния МФ на выявление галактози-дазной и глюкуронидазной активности при использовании хромогенной среды [4]. Контролируемый показатель эффективности МФ — процент извлекаемости/удержа-ния обусловлен комплексом факторов, не все из которых на сегодняшний день поддаются определению и оценке.
Повышенная чувствительность штамма Е. coli Ml 7-02 по сравнению со всеми другими применявшимися для контроля качества МФ штаммами теоретически может рассматриваться как положительное свойство, позволяющее с запасом надежности гарантировать пригодность МФ для санитарно-микробиологического анализа при успешном прохождении контроля. Однако на практике указанное свойство штамма Е. coli Ml7-02 приводит к выбраковке и вынесению заключения о непригодности для санитарно-микробиологического анализа партий МФ различных производителей, успешно проходящих входной контроль при использовании альтернативных штаммов и не имеющих достоверных отличий при сравнении с результатами прямого поверхностного посева при исследовании реальных проб воды. Более того, обеспечение входного контроля качества МФ одним штаммом Е. coli М17-02 в ряде случаев ставит пользователя в
Таблица 6
Проявление сливного роста на фильтрах разными эталонными штаммами
Штамм
Подвижность
Число партий
Наличие сливного роста
Е. coli М17-02 +
Е. coli 25922 +
Е. coli АТСС 11775 + Е. coli 9581 S. aureus 9659
60 26 9 5* 1*
29 14
2 0 0
"Sartorius" (02.02) 48
"Владисарт" (0002353) 9
103 81
Примечание. Число исследованных партий, при контроле которых обнаружен сливной рост на альтернативном подвижном штамме.
тупиковую ситуацию, когда все приобретенные им партии МФ формально не могут быть допущены к использованию в анализе. Кроме того, это может привести к конфликтным ситуациям, когда результаты внутреннего входного контроля противоречат сертификату качества производителя, основанному на тестировании с альтернативным штаммом.
Очевидно, что одновременное использование для контроля качества МФ нескольких тестовых штаммов эталонных микроорганизмов по аналогии с контролем качества питательных сред позволит дать более объективную оценку качества МФ. Однако для внедрения в практику такая схема контроля требует разработки критериев согласования количественных оценок, полученных на разных штаммах. Кроме того, усложнение процедуры может сделать контроль неисполнимым для небольших лабораторий, с трудом изыскивающих ресурсы для проведения контроля в его действующем варианте. Возможным путем решения проблемы при условии установленных критериев согласования полученных на разных штаммах количественных оценок могло быть внедрение дифференцированной системы контроля качества МФ. При этом в крупных аккредитованных лабораториях проводится расширенный контроль качества с применением нескольких тестовых штаммов, и протокол с положительными результатами такого контроля является основанием для допуска МФ проконтролированной партии в анализ внешней лабораторией без собственного входного контроля. В небольших лабораториях осуществляется необходимый входной контроль с одним штаммом при отсутствии у партии МФ сопровождающего протокола расширенного контроля качества, а результаты такого контроля значимы только для внугрилабора-торного применения. Очевидно, что внедрение подобной системы контроля качества МФ является задачей будущего.
Основываясь на представленных материалах, предлагаем:
1) заменить рекомендованный МУ 2.1.4.1057-01 для контроля МФ штамм Е. coli M17-02 другим, например непатогенным Е. coli АТСС 11775, имеющимся в коллекции ГИСК им. JI. А. Тарасевича, показавшим удовлетворительные результаты в собственных испытаниях и используемым зарубежными производителями МФ ("Schleicher & Schuell") для контроля продукции;
2) дополнить контролируемые показатели качества МФ определением степени уменьшения линейных размеров мембран после стерилизации, так как в отдельных случаях в результате стерилизации уменьшение размеров мембран было настолько значимым, что затрудняло их использование;
3) дополнить контролируемые показатели качества МФ определением сливного роста, поскольку в ряде случаев указанное свойство МФ исключало возможность количественного учета выросших колоний тестового штамма.
Л итература
1. Гланц С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. - М., 1998.
2. Зайцев Г. Н. Математическая статистика в экспериментальной ботанике. — М., 1984.
3. Организация внутреннего контроля качестза сани-тарно-микробиологических исследований воды: Метод, указания. — М., 2001.
4. Ossmer R., Schmidt W., Mende U. // Chromocuit® Col-iform Agar — Influence of Membrane Filter Quality on Performance: XVII Congresso de la Sociedad, Granada, 1999.
Поступила 30.12.03
По поручению Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Министерства здравоохранения и социального развития РФ издательством "МЕДИЦИНА" выпущен в свет "Государственный реестр лекарственных средств (официальное издание)" в двух томах (далее — "Реестр").
"Реестр" ведется и издается в соответствии с Законом о лекарственных средствах и Приказом Минздрава России № 100 от 06.04.1998 г. и включает полную официальную информацию о зарегистрированных в России лекарственных, медико-профилактических и диагностических средствах, разрешенных к медицинскому применению и промышленному выпуску по состоянию на 1 сентября 2004 года. В первом томе содержатся сведения о торговых и международных непатентованных названиях, лекарственных формах, упаковках, дозировках, фармакологических группах, во втором — типовые клинико-фармакологические статьи.
Информация, содержащаяся в "Реестре", должна служить основой при осуществлении Программы дополнительного лекарственного обеспечения отдельных категорий граждан, формировании различных перечней и списков (перечня жизненно важных лекарственных средств, списков А и В,
списков лекарств безрецептурного отпуска и др.), при сборе заявок от регионов на их поставку, при анализе процессов производства, импорта и потребления, при составлении государственного баланса спроса и предложения на лекарственные средства, стандартом описания лекарственных средств при обмене информацией по контролю качества и сертификации лекарственных средств.
С целью оперативного обеспечения всех заинтересованных организаций и учреждений текущей информацией о лекарственных средствах, прошедших государственную регистрацию и перерегистрацию, издательством в течение 2005 года будут выпущены 3 Приложения к "Реестру", которые будут являться его неотъемлемой частью. Приложение № 1 будет включать официальную информацию обо всех зарегистрированных и прошедших перерегистрацию в России лекарственных средствах в период с 1 сентября 2004 года по 1 января 2005 года; Приложение № 2 — в период с 1 января 2005 года по 1 апреля 2005 года; Приложение № 3 — в период с 1 апреля 2005 года по 1 июля 2005 года.
Научный центр экспертизы средств медицинского применения
I
Заявки на приобретение следует направлять в срок до 1 февраля 2005 года
по почте
адрес: 101990, Москва, Петроверигский переулок, дом 6/8, издательство "Медицина", | (с обязательной пометкой на конверте "РЕЕСТР")
по факсу
| (095) 928-62-94 или |
| по электронной почте
| адрес: Rrls@mail.ru
I Телефоны для справок: (095) 928-86-48; 928-64-55.
