CC BY
93
Hygiene & Sanitation (Russian Journal). 2017; 96(11)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2017-96-11-1109-1114
Original article
0 КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 614.777-078
Иванова Л.В.1, Артёмова Т.З.1, Загайнова А.В.1, Гипп Е.К.1, Максимкина Т.Н.1, Красняк А.В.1, Шустова С.А.1, Юрцева Н.А.1, Райкович Блейзер Л.М.2, Сипс Ж.2, Хертерих С.2, Бруин Б.2, Губин С.Н.3, Брызнюк Н.А.3
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ УСКОРЕННОГО ВЫПОЛНЕНИЯ САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ВОДЫ
1 ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» Минздрава России, 119991, Москва;
2 IDEXX Laboratories, Уэстбрук, 04092, США;
3 ООО «Симедика РУ», 141069, Королёв
Выполнена оценка метода обнаружения и идентификации санитарно-показательных микроорганизмов в пробах воды с применением тест-систем IDEXX производства фирмы IDEXX Laboratories, Inc (США), основанных на использовании хромогенных питательных сред и реагентов в соответствии с методикой, разработанной фирмой-изготовителем. Установлено, что метод IDEXX не уступает референтным методам исследования воды, которые применяются на территории РФ и в международной практике. Сравнительная оценка посевов показала сопоставимость полученных результатов как при исследовании загрязненной воды с естественными микробиоценнозом, так и воды модельных водоёмов, контаминированных суточными культурами тест-микрооганизмов. Метод позволяет сократить время проведения анализа за счёт исключения проведения биохимических реакций (оксидазная активность, ферментация углеводов, образование индола и др.), необходимых для определения видовых признаков микроорганизмов, и получить окончательный результат анализа через 24 ч. На основании полученных результатов тест-системы IDEXX Laboratories (США) могут применяться на территории РФ для оценки качества воды по санитарно-ми-кробиологическим показателям.
Ключевые слова: санитарно-микробиологический анализ воды; санитарно-показательные микроорганизмы; гигиенические нормативы; методы контроля; тест-системы.
Для цитирования: Иванова Л.В., Артёмова Т.З., Загайнова А.В., Гипп Е.К., Максимкина Т.Н., Красняк А.В., Шустова С.А., Юрцева Н.А., Блейзер Л.М., Сипс Ж., Хертерих С., Бруин Б., Губин С.Н., Брызнюк Н.А. Оценка эффективности тест-систем для ускоренного выполнения санитарно-бактериологического анализа воды. Гигиена и санитария. 2017; 96(11): 1109-1114. DOI: http://dx. doi . org/10.18821/0016-9900-2017-96-11-1109-1114
Для корреспонденции: Загайнова Анжелика Владимировна, канд. биол. наук, зав. лаб. санитарной бактериологии и паразитологии ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» Минздрава России, 119991, Москва. E-mail: [email protected]
Ivanova L.V.1, Artemova T.Z.1, ZagaynovaA.V.1, Gipp E.K.1, Maksimkina T.N.1, KrasnyakA.V.1, Shustova S.A.1, Yurtseva N.A.1, Raykovich Bleyzer L.M.2, Sips Zh.2, Kherterikh S.2, Bruin B.2, Gubin S.N.3, Bryznyuk N.A.3
EVALUATION OF THE EFFECTIVENESS OF TEST-SYSTEMS FOR RAPID IMPLEMENTATION OF SANITARY-BACTERIOLOGICAL ANALYSIS OF WATER
'Center for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks, Moscow, 119991, Russian Federation;
2IDEXXLaboratories, Westbrook, 04092, USA;
3Ltd «Simedika Ru», Korolev, 141069, Russian Federation
There was executed the assessment of the method of the detection and identification of sanitary-indicative microorganisms in water samples with the use of test systems IDEXX manufactured by IDEXX Laboratories, Inc (USA), based on the use of chromogenic culture media and reagents in accordance with the methodology developed by the manufacturer. IDEXX method was found not to be inferior to the reference methods of water analysis applied in Russia and in international practice. Comparative evaluation of crops showed the consistency of results, as in the study of contaminated water with natural microbiocenoses and water modeling of water bodies, contaminated by daily cultures test microganisms. The method allows reduce time of an analysis due to the exclusion of the biochemical reactions (oxidase activity, fermentation of carbohydrates, formation of indole, etc.) needed to determine species of microorganisms, and to obtain the final result of the analysis after 24 hours. On the basis of obtained results test systems IDEXX Laboratories (USA) may be applied on the territory of the Russian Federation for the assessment of water quality according to sanitary-microbiological indices
Keywords: sanitary-microbiological analysis of water; sanitary-indicative microorganisms of the hygienic standards; monitoring methods; test system.
For citation: Ivanova L.V., Artemova T.Z., Zagaynova A.V., Gipp E.K., Maksimkina T.N., Krasnyak A.V., Shustova S.A., Yurtseva N.A., Raikovovich Blazer L.M., Sipes J., Herterich S., Bruin B., Gubin S.N., Bryznyuk N.A. Evaluation the effectiveness of test-systems for rapid implementation of sanitary-bacteriological analysis of water. Gigiena i Sanitaria (Hygiene and Sanitation, Russian journal) 2017; 96(11): 1109-1114. (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0016-9900-2017-96-11-1109-1114
For correspondence: Angelica V. Zagaynova, MD, PhD, Associate Professor, Head of the Laboratory of Sanitary Bacteriology and Parasitology of the Center for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks , Moscow, 119991, Russian Federation. E-mail: [email protected]
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest. Acknowledgment: The study had no sponsorship . Received: 06 March 2017 Accepted: 05 July 2017
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2017-96-11-1109-1114 Оригинальная статья
Введение
В связи с переходом практики санитарно-гигиенического контроля объектов окружающей среды на новые критерии оценки качества и необходимости их гармонизации с международными подходами требуется дальнейшее совершенствование существующей методической базы контроля за циркуляцией возбудителей воднообусловленных инфекций и их индикаторов в водных объектах в направлении повышения чувствительности, точности, экспрессности методов, соответствия международным стандартам.
Разработанный метод определения в воде индикаторных и потенциально-патогенных бактерий с использованием тест-систем IDEXX Laboratories (США) (далее IDEXX) простой, позволяет в течение суток получить результат оценки качества воды. Эксклюзивным представителем фирмы-производителя в России является компания ООО «Симедика РУ».
В ряде работ отмечено потенциальное преимущество тест-системы Colilert-18 по сравнению с методом ISO. Кроме того, после разработки метода была организована широкая апробация метода IDEXX (defined substrate of procedure) в 20 лабораториях 13 европейских стран (Niemel S.I., Lee J.V., Trieren C.R.) при исследовании воды с уровнем бактериального загрязнения от 5 до 15 КОЕ/100 мл. Установлено, что тест-система Colilert-18 является альтернативой референтному методу ISO
Анализ литературных источников показал, что тест-система Colilert-18, основанная на определении P-D-галактозидазы и P-D-глюкоронидазы, широко использовалась для выявления ко-лиформных бактерий и E.coli в объектах окружающей среды, в том числе в воде. При сравнении тест-системы Colilert-18 по сравнению с мембранным методом ISO на среде с тергитолом приведены сопоставимые результаты и рядом авторов доказано потенциальное преимущество тест-системы Colilert-18 над традиционными методами (Edberg et all, 1988; Sartory and Howard, 1912; Palmer et all, 1993; Tridar et all, 1997).
Для внедрения IDEXX в практику лабораторного контроля в Российской Федерации (РФ) необходимо проведение сравнительной оценки эффективности IDEXX с действующими в настоящее время референтными методами определения уровня бактериального загрязнения воды различного назначения, что и явилось целью работы.
Объект исследования - питьевая вода; вода поверхностных водоёмов (река Москва); вода, расфасованная в ёмкости; экспериментальные модельные водоёмы с искусственным загрязнением.
Материал и методы
Колиформные бактерии, E.coli и фекальные энтерококки определяли методом мембранной фильтрации в соответствии с утверждёнными в РФ нормативно-методическими документами водно-санитарного законодательства: МУК 4.2. 1018-01 «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды»; МУК 4.2.1884-04 «Санитарно-микробиологический и санитарно-па-разитологический анализ воды поверхностных водных объектов; МУ 2.1.4.1184-2002 «Методические указания по внедрению и применению Санитарных правил и норм СанПиН 2.1.4.11162002 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в ёмкости. Контроль качества», ГОСТ Р 31942-2012 (ISO 19458:2006) «Вода питьевая. Отбор проб для микробиологического анализа»; МУ 2.1.5.800-99.
Посевы выполняли с использованием мембранных фильтров фирмы «Владисарт» (г. Владимир), фильтрующая мембрана из нитроцеллюлозы (ФМНЦ) производства фирмы «Мерк» с диаметром пор 0,45 мкм, предназначенных для задержания бактериальных клеток. Посевы проб воды на мембранные фильтры проводили с десятикратными разведениями с таким расчётом, чтобы после инкубации получить рост изолированных колоний. После фильтрации мембранный фильтр при помощи стерильного пинцета помещали на селективную питательную среду в соответствии с видовой принадлежностью исследуемого микроорганизма посевом вверх. Инкубацию посевов осуществляли в термостате при температуре 37 ± 1 °C в течение установленного времени для каждого микробиологического показателя, после чего производили учёт выросших колоний и определяли их количество в 100 мл воды (КОЕ/100мл).
Кроме метода мембранной фильтрации был применён ти-трационный метод. При определении колиформных бактерий, E.coli, энтерококков проводили посев воды в трёх рядах в объёме 10 см3, 1 см3, 0,1 см3, 0,01 см3, 0,001 см3 в глюкозо-пептон-ную среду накопления. Через 24 ч инкубации при обнаружении роста производили посев на плотные селективные среды - Эндо, энтерококк-агар, колиформ-агар. После инкубации посевов в течение 24 ч при температуре 37°C проводили учёт и идентификацию выделенных микроорганизмов.
При определении P. aeruginosa посевы проб воды производили в среду накопления «Бонде» с последующей инкубацией посевов в течение 24 ч с последующим высевом на подтверждающую среду «Блеск» и «цетримид агар». Наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий определяли по статистическим таблицам.
Исследования проводили на воде поверхностных водоисточников с естественным микробиоценозом, воде, расфасованной в ёмкостях и искусственных водоёмах, контаминированных тест-микроорганизмами. В качестве тест-микроорганизмов использовались контрольные штаммы музейных микроорганизмов: Escherichia coli 1257, Pseudomonas aeruginosa 10145 АТСС, Pseudomonas fluorescents АТСС № 948, Enterococcus faecalis 29212 АТСС, Enterococcus faecium 7171, Citrobacter freundii 101/57, Enterobacter cloacae ГИСК А-186 В-4982, Klebsiella pneumoniae subsp. АТСС 700603, полученные из коллекции музея живых культур ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотреб-надзора и ФБУН ГНЦ ПМБ г. Оболенска, обладающие типичными морфологическими, культуральными, биохимическими и серологическими свойствами.
Методы определения индикаторных микроорганизмов в питьевой воде с использованием тест-систем IDEXX производства фирмы IDEXX Laboratories, Inc. (США) основаны на использовании хромогенных питательных сред для выращивания и идентификации бактерий. Принцип действия хромогенных питательных сред заключается в образовании окрашенных веществ (индикаторов) в результате взаимодействия высокоспецифичных ферментов бактерий с компонентами среды.
Для получения количественного результата использован оригинальный способ распределения (раститровки) анализируемого объёма воды в объёме 100 мл в стерильные пластмассовые лотки с 51 ячейками. Пробу воды после добавления субстрата вносят в лоток и распределяют по ячейкам. Затем лоток запечатывают герметично на аппарате Sealer и помещают в термостат ячейками вниз при температуре 37 ± 0,5°C, время инкубации каждой тест-системы зависит от видовой принадлежности исследуемых микробиологических показателей (колиформные бактерии, псевдомонады, энтерококки). Наличие в лунке бактерий определяют по изменению цвета или по появлению способности к свечению - флюоресценции под УФ-лампой. Число положительных лунок подсчитывают и определяют НВЧ по таблице, прилагаемой к каждой тест-системе.
Колиформы и E.coli определяли с использованием системы Colilert-18. Для контроля качества системы использовали воду модельных водоемов: стерильную водопроводную, инфицированную суточными культурами штаммов E.coli, K. рneumoniaе, P. аeruginosa, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae после инкубации посевов 18 или 24 ч. При положительном результате подсчитывали лунки с изменённым цветом (жёлтым) для определения показателя колиформных бактерий, из которых определяли флюоресцирующие лунки для определения E.coli . Энтерококки определяли с использованием системы Enterolert. Для контроля качества системы исследовали воду модельных водоёмов, инфицированную Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium и E.coli.
Бактерии P. аeruginosa определяли с использованием системы Pseudolert в присутствии штаммов P. aeruginosa, E.coli, P. fluorescens
Исследования проведены на воде модельных водоёмов, создаваемых путём разбавления воды, отобранной из реки Москвы стерильной водопроводной водой в соотношении 1:100 и 5:1000, таким образом, чтобы уровень естественного загрязнения воды соответствовал высокому и низкому уровням загрязнения в реальных условиях.
Также исследовалась вода модельных водоёмов со стерильной водопроводной водой, контаминированной штаммами му-
Таблица 1
Результаты сравнительной оценки задержания микроорганизмов на фильтрующей поверхности мембран производства ЗАО «Владисарт» и ЗАО НТЦ «Владипор»
№ пробы Разведение Виды микроорганизмов Мембранные фильтры различных производителей
Владисарт Миллипор Владисарт Миллипор
1 1:100 E.coli 30 40 6 12
Колиформы 64 70 20 16
Энтерококки 40 30 0 0
2 1:10 E.coli 300 250 60 50
Колиформы 600 700 100 200
Энтерококки 210 190 2 4
1 E.coli 130 200 12 10
Колиформы 270 300 16 14
Энтерококки 40 30 10 12
2 E.coli 140 120 15 15
Колиформы 600 500 100 300
Энтерококки 150 170 8 10
3 E.coli 170 150 18 30
Колиформы 300 300 51 43
Энтерококки 70 85 23 28
4 E.coli 90 50 10 16
Колиформы 250 180 25 40
Энтерококки 50 70 18 24
зейных тест-микроорганизмов с низким и высоким уровнями микробного загрязнения.
Из каждого модельного водоёма отбирали пробы воды для проведения санитарно-микробиологического анализа (КОЕ/100 мл) на соответствующие питательные селективные среды в соответствии с видовой принадлежностью исследуемых микроорганизмов: питательный агар - для определения ОМЧ, дифференциально-диагностическая среда Эндо, колиформ-агар, среда ГПС - для выявления колиформных бактерий и E.coli, энтерококк-агар - для выделения энтерококков, среды «Блеск» и «Ци-тримид агар» отечественного и импортного производства - для первичной идентификации P. aeruginosa.
Натурные исследования проводили при анализе питьевой воды, расфасованной в ёмкости и воды поверхностного водоёма из реки Москвы. Всего исследовано 4 пробы питьевой воды, расфасованной в ёмкости, 16 проб воды из реки Москвы и 20 проб воды из модельных водоёмов, контаминированных семью тест-микроорганизмами.
Для анализа питьевой воды использовали воду, расфасованную в ёмкости первой и высшей категории качества. В пробах воды определяли ОМЧ, колиформные бактерии, Escherichia coli, энтерококки, P. aeruginosa
Исследования на музейных тест-микроорганизмах были выполнены в двух независимых сериях экспериментов. В каждой серии испытаны 10 модельных водоёмов. Отбор и анализ исследованных проб проводили в трёх повторностях с параллельным определением КОЕ в 100 мл методом мембранной фильтрации, титрационным методом и с использованием тест-системы IDEXX.
Данные, полученные в результате экспериментальных и натурных исследований, обработаны с использованием программного обеспечения Microsoft Windows, Microsoft Excel 2003 и пакета статистических программ Statistic for Windows.
Результаты
Оценка эффективности микробиологического анализа воды методом мембранной фильтрации с использованием мембранных фильтров фирм «Владисарт» и «Миллипор». В связи с тем, что достоверность результатов микробиологического анализа проб воды методом мембранной фильтрации зависит от эффективности задержания микроорганизмов на фильтрующей по-
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2017-96-11-1109-1114
Original article
температуре ные aeruginosa 37°C бактерии -■- Референтные методы - Метод IDEXX
Результаты сравнительной оценки определения уровней бактериального загрязнения питьевой воды, расфасованной в ёмкости, с методом мембранной фильтрации, титрационным методом и с применением тест-систем IDEXX.
верхности мембраны, были проведены исследования по оценке эффективности мембранных фильтров фирм «Владисарт» и «Миллипор» для различного уровня микробного загрязнения воды (колиформные бактерии, Е.соН, энтерококки) (табл. 1).
При использовании мембранных фильтров «Владисарт» и «Миллипор» для оценки качества воды с различным уровнем микробного загрязнения статистически достоверных различий не установлено (коэффициент корреляции г = 0,947 при статистической значимости р = 0,05, коэффициент регрессии - накл. Ь = 0,97, сдвиг а = 11,13, стандартная ошибка Ь = 0,06, стандартная ошибка а = 10,64, стандартное отклонение 50,69). На основании полученных результатов дальнейшие исследования проводили с использованием мембран фирмы «Владисарт».
Сравнение методов при анализе воды, расфасованной в ёмкости. Исследования питьевой воды, расфасованной в ёмкости методами мембранной фильтрации, титрационным и методом ГОЕХХ на тест-системах СоШегИ8, Pseudolert, ЕПего1ег1 показали сопоставимость полученных результатов (см. рисунок). Установлено, что при проведении анализа питьевой воды, расфасованной в ёмкости стандартными методами, вода соответствовала установленным требованиям. Аналогичный результат получен с использованием тест-системы ГОЕХХ, ложноположи-тельные результаты не выявлены.
Сравнительная оценка методов анализа воды питьевой, искусственно контаминированной санитарно-показательными микроорганизмами. В первой серии исследований при уровне заражения п х 102-п х 103 К0Е/100 см3 установлено (табл. 2), что с применением тест-системы ГОЕХХ численность колиформ-ных бактерий в воде модельных водоёмов варьировала от 19,2 до 129,8 КОЕ/см3 (мл); методом мембранной фильтрации - от 12 до 150 КОЕ/см3 .
Несмотря на отличающиеся величины статистическая обработка данных подтвердила сопоставимость результатов санитар-но-микробиологического анализа воды г = 0,961 при р = 0,0001.
При использовании титрационного метода установлены более высокие значения числа колиформных бактерий (от 46 до 280 К0Е/100 см3). Соответственно коэффициент корреляции был установлен ниже (г = 0,767). Однако эти различия не существенны (р = 0,012). В четырёх водоёмах бактерии Е.соН не обнаружены ни одним из сравниваемых методов.
Во второй серии исследований также было проведено 10 независимых экспериментов при анализе воды 10 модельных водоёмов с уровнем загрязнения п х 102-п х 103 К0Е/100 см3. Получены аналогичные результаты, подтвердившие высокий уровень сопоставимости сравниваемых результатов. Бактерии Е.соН как и в первой серии исследований были обнаружены не во всех модельных водоёмах. Титрационным методом показан более высокий уровень инфицирования воды бактериями, которые входят в показатель «колиформные бактерии». Однако это различие не отразилось на
llll
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2017-96-11-1109-1114 Оригинальная статья
Таблица 2
Сопоставимость результатов санитарно-микробиологического анализа воды питьевой, искусственно контаминированной санитарно-показательными микроорганизмами, полученными на тест-системе Colilert-18 с методами, утверждёнными РФ (серия 1)
Тест-системы Colilert-18, К0Е/100 мл Референтные методы, утверждённые на территории РФ, К0Е/100 см3
Проба Уровень контаминации 102-103, К0Е/100 см3
колиформы E.coli мембранный титрационный
колиформы E.coli колиформы E.coli
50,4 17,9 65 35 143 43
59,1 59,1 78 46 130 36
19,2 8,7 12 10 23 0
56,0 11,1 75 11 150 18
129,8 0 150 0 210 0
65,9 50,4 67 14 130 15
20,7 0 16 0 46 0
109,1 0 110 0 280 0
88,5 0 98 0 281 0
32,4 23,9 65 24 136 58
r - - 0, 961 0, 952 0,767 0,721
Р - - 0 0 0,012 0,021
статистической оценке достоверности разницы методов IDEXX и общепринятых методов бактериологического анализа.
При проведении санитарно-микробиологического анализа питьевой воды с использованием тест-системы Colilert-18, искусственно контаминированной микроорганизмами в концентрации n • 103-104 КОЕ/100 мл (табл. 3), количественного результата получено не было. Полученные данные доказывают, что при использовании тест-системы Colilert-18 для исследования воды с высоким уровнем загрязнения необходимо разведение пробы в несколько раз, что увеличивает погрешность получаемого результата.
При выявлении санитарно-показательных микроорганизмов E. coli, C. freundii, E. cloacae, K. pneumoniae, входящие в показатель «колиформные бактерии», в присутствии представителей бактерий других семейств P. aeruginosa, E. faecalis при концентрации n • 102-n • 103 КОЕ /100 см3 с применением тест-системы IDEXX
Таблица 3
Сопоставимость результатов санитарно-микробиологического анализа воды питьевой, искусственно контаминированной микроорганизмами, полученными на тест-системе Colilert-18 с методами, утверждёнными РФ
Тест-системы Colilert-18, К0Е/100 мл Референтные методы, утверждённые на территории РФ, КОЕ/100 см3
Проба Уровень контаминации 103-104, К0Е/100 мл
колиформы E.coli мембранный титрационный
колиформы E.coli колиформы E.coli
> 200,5 > 200,5 1>104 8,0^103 > 1,Ы04 1,Ы03
> 200,5 > 200,5 3>104 9,0^103 4,6^104 1,Ы04
> 200,5 > 200,5 2>104 7,0^103 3>104 1,0^103
> 200,5 > 200,5 2>104 6>103 3,9^104 1,Ы03
> 200,5 > 200,5 2>104 7>103 3,7^104 1,Ы03
> 200,5 > 200,5 3>104 6>103 4>104 1,Ы04
> 200,5 > 200,5 2,Ы04 7>103 > 1,Ы04 1,Ы04
> 200,5 > 200,5 2>104 7,Ы03 3,6^104 1,Ы04
> 200,5 > 200,5 3>104 6>103 2,9^104 1,Ы03
> 200,5 > 200,5 3>104 9>103 3,7^104 1,Ы04
Таблица 4
Результаты оценки эффективности тест-системы СоШеГ>18 при анализе стерильной водопроводной воды, контаминированной суточными культурами бактерий (серия 1)
Тест-системы Colilert Референтные методы, утверждённые на территории РФ и ТС, К0Е/100 см3
Проба Уровень заражения 102-103, К0Е/100 см3
колиформы E. coli мембранный титрационный
колиформы E. coli колиформы E. coli
50,4 17,9 65 35 143 43
59,1 59,1 78 46 130 36
19,2 8,7 12 10 23 0
56,0 11,1 75 11 150 18
129,8 0 150 0 210 0
65,9 50,4 67 14 130 15
20,7 0 16 0 46 0
109,1 0 110 0 280 0
88,5 0 98 0 281 0
32,4 23,9 65 24 136 58
r 0, 961 0, 952 0,767 0,721
Р 0,00 0,00 0,012 0,021
был получен сопоставимый со стандартными методами количественный результат. При более высоких уровнях загрязнения 103104 К0Е/100 см3 тест-системы IDEXX показывают наличие в воде загрязнения качественно без количественного результата.
Сравнительная оценка методов при анализе воды поверхностных водоёмов, полученными на тест-системе Colilert-18 и методами, утверждёнными РФ. Результаты сравнительной оценки тест-системы Colilert-18 и методов РФ при исследовании речной воды приведены в табл. 3.
Выполнены две серии исследований при разбавлении загрязнённой речной воды 1:100 и 5:1000. В каждой из 16 отобранных проб воды определяли колиформы и E. coli тремя сравниваемыми методами одновременно.
Натурные исследования воды реки Москвы подтвердили, что использование количественных методов определения индексов бактерий с помощью тест-систем IDEXX ограничено уровнем загрязнения воды. Установить индекс колиформных бактерий и E. coli при уровне загрязнения >200 К0Е/100 мл не представляется возможным. В этих случаях полученные результаты позволяют констатировать, что исследуемые пробы воды инфицированы колиформными бактериями.
При более низком уровне - 102-103 К0Е/100 см3 - индекс колиформных бактерий во всех пробах был практически одинаковый при посеве мембранным методом и методом IDEXX (в первой серии r = 0,946 при p = 0, вторая серия r = 0,899 при р = 0) (табл. 4). В то же время индекс колиформных бактерий был выше при посеве титрационным методом. Индекс E. coli, который определяли методами IDEXX и мембранной фильтрации в обеих сериях исследований, был идентичен в пределах допустимой ошибки (первая серия r = 0,976 при р = 0,000, вторая серия r = 0,768 при р = 0,031).
Сравнительная оценка эффективности тест-систем Enterolert DW и методов РФ при проведении анализа воды, инфицированной суточными культурами бактерий. Исследования выполнены на стерильной водопроводной воде, инфицированной суточными культурами бактерий Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli. Проведены две серии экспериментов по 10 модельных водоёмов в каждой серии. Исследовано 20 проб воды с разным уровнем загрязнения методами мембранной фильтрации, титрационным и с использованием тест-систем Enterolert DW метода IDEXX. Результаты представлены в табл. 5.
Полученные данные свидетельствуют об идентичной эффективности трёх сравниваемых методов при определении в воде показателя «энтерококки». В модельных водоёмах моделирован различный уровень КОЕ энтерококков, что позволяет судить о возможности исследования воды методами IDEXX при числен-
Таблица 5
Результаты оценки эффективности тест-системы ЕП:его1еН ГОЕХХ при анализе стерильной водопроводной воды, инфицированной суточными культурами бактерий. Уровень заражения 102-103, КОЕ/100 см3
Серия 1 Серия 2
Проба Тест- Методы РФ Тест- Методы РФ
система Enterolert IDEXX мембранный титраци-онный система Enterolert IDEXX мембранный титраци-онный
1 9,9 10 2 8,7 21 3,4
2 20,7 20 30 34.4 35 35
3 1 0 0 1 0 0
4 > 200,5 100 > 240 > 200,5 152 > 240
5 > 200,5 250 150 > 200,5 280 110
6 > 200,5 220 > 240 > 200,5 230 > 240
7 30,6 20 46 32,4 24 46
8 > 200,5 150 > 240 > 200,5 154 > 240
9 22,2 20 110 27,1 24 110
10 30,6 30 24 32,4 36 46
r - 0,948 0,912 - 0,952 0,842
р - 0,000 0,000 - 0,000 0,004
ности бактерий от единичных клеток до сотен КОЕ/см3. При уровне обсеменённости воды энтерококками свыше 200 КОЕ/ см3 с помощью тест-систем Enterolert DW не удалось получить количественных результатов, однако можно констатировать высокое бактериальное загрязнение воды. Статистическая обработка полученных данных подтверждает сопоставимость результатов контроля качества воды по показателю «энтерококки», полученных методом IDEXX и традиционными методами (первая серия r = 0,948 при р = 0,000; вторая серия r = 0,952 при р = 0,000 при сравнении методов IDEXX и мембранной фильтрации и r = 0,912 при р = 0,000; r = 0,842 при р = 0,004 соответственно при сравнении с титрационным методом).
Оценка эффективности тест-систем Enterolert DW и методов РФ при проведении анализа речной воды. Пробы речной воды перед анализом разбавляли стерильной водопроводной водой 1:100 и 5:1000, чтобы провести сравнительную оценку методов при различном уровне бактериального загрязнения речной воды. Выполнены две независимые серии, исследовано 16 проб воды параллельно тремя методами (табл. 6).
Анализ полученных данных показывает достаточно высокую эффективность тест-системы Enterolert DW при анализе воды водоёма. Коэффициент корреляции r = 0,851 при р = 0,010 и r = 0,952 при р = 0,000 при исследовании первой и второй серии соответственно мембранным методом. Аналогичные результаты получены при сравнении метода IDEXX и титрационного метода (r = 0,976 при р = 0,000 и r = 0,842 при р = 0,004 в первой и второй сериях соответственно).
Оценка эффективности тест-системы Pseudolert и методов РФ при проведении анализа стерильной водопроводной воды, инфицированной суточными культурами бактерий. Исследования выполнены при анализе воды модельных водоёмов, где моделирован различный уровень загрязнения путём внесения суточных культур бактерий Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescents, Enterococcus faecalis. Проведены 3 серии исследований по 10 модельных водоёмов в каждой серии. Результаты представлены в табл. 10 и 11. Сравнение полученных данных подтверждает установленную в предыдущих разделах закономерность, заключающуюся в том, что методом IDEXX количественные результаты могут быть получены только при низком уровне бактериального загрязнения в воде -менее 200 К0Е/100 см3 .
Анализ полученных данных, приведенный в табл. 7, показывает сопоставимость результатов анализа методом IDEXX и методами РФ, что подтверждает статистическая обработка. Коэффициенты корреляции во второй серии составляют r = 0,648 при р = 0,044 при сравнении с мембранным методом и r = 0,870
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2017-96-11-1109-1114
Original article
Таблица 6
Результаты оценки эффективности тест-системы Enterolert IDEXX при анализе реки Москвы (разбавление 1:100 и 5:1000 (КОЕ/100 см3))
Серия 1 Серия 2
Проба Тест- Методы РФ Тест- Методы РФ
система Enterolert IDEXX мембранный титраци-онный система Enterolert IDEXX мембранный титраци-онный
1, > 200,5 400 460 65,9 180 70
1» > 200,5 300 460 73,8 175 60
2' 17,9 24 12 30,6 80 40
2» 47,8 17 46 34,4 130 50
3' 165,2 56 110 109,1 85 20
3» 25,4 6 15 144,5 65 25
4' 11,1 2 8 13,7 40 30
4" 34,4 14 24 13,7 30 20
r - 0,851 0,976 - 0,952 0,842
р - 0,010 0,000 - 0,000 0,004
при р = 0,002 при сравнении с титрационным. Аналогично высокие коэффициенты корреляции получены в третьей серии.
Оценка эффективности тест-системы Pseudolert и методов РФ при проведении анализа воды реки Москвы. Исследования 16 проб воды реки Москвы выполнены параллельно тремя методами: титрационным, мембранным и методом IDEXX. Результаты представлены в табл. 8. Анализ полученных результатов показал, что методом IDEXX бактерии P. aeruginosa выявлены в количестве, полученном при посеве проб мембранным и титрационным методами (первая серия - коэффициенты корреляции при этом составляют r = 0,571 при р = 0,130 и r = 0,869 при р = 0,007; вторая серия - r = 0,530 при р = 0,170 и r = 0,601 при р = 0,113 при сравнении мембранным и титрационным методами соответственно).
Следовательно, метод IDEXX системы Pseudolert пригодна для анализа поверхностных водоёмов с низким уровнем загрязнения.
Заключение
Результаты исследований по оценке эффективности альтернативного метода исследования воды с использованием тест-систем производства фирмы IDEXX Laboratories, Inc (США)
Таблица 7
Результаты оценки эффективности тест-системы Pseudolert IDEXX при анализе стерильной водопроводной воды, инфицированной суточными культурами бактерий. Уровень заражения 102-103, КОЕ/100 см3
Проба Серия 2 Серия 3
Тест- Методы РФ Тест- Методы РФ
система мембран- система мембран-
Pseudolert титраци- Pseudolert титраци-
IDEXX ный онный IDEXX ный онный
1 3,1 7 9,3 4,2 5 4
2 129.8 250 150 109,1 100 150
3 2 4 9,3 2 2 9
4 9,9 5 9,3 5,3 5 9,3
5 > 200,5 140 > 240 > 200,5 120 > 240
6 > 200,5 130 > 240 > 200,5 110 > 240
7 45,3 80 15 42,9 100 15
8 > 200,5 15 110 > 200,5 7 110
9 > 200,5 135 > 240 > 200,5 120 > 240
10 > 200,5 78 110 > 200,5 70 110
r - 0,648 0,870 - 0,767 0,870
р - 0,044 0.002 - 0,012 0,002
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2017-96-11-1109-1114 Оригинальная статья
Таблица 8
Результаты оценки эффективности тест-системы Pseudolert ГОЕХХ при анализе реки Москвы (разбавление 1:100 и 5:1000 (КОЕ/100 см3))
Серия 1 Серия 2
Проба Тест- Методы РФ и ТС Тест- Методы РФ и ТС
система Pseudolert IDEXX мембранный титраци-онный система Pseudolert IDEXX мембранный титраци-онный
1' 2,0 6 2 > 73,8 64 70
1" 3,1 6 2 31,1 72
2' 12,4 11 4 15,1 22 24
2» 7,9 3 9 12 26
3' 36,4 26 29 19,5 20 24
3" 9,9 2 6 37,2 23 -
4' 7,5 2 4 39,2 22 24
4'' 34,4 30 21 20,2 30 -
r - 0,571 0,869 - 0,530 0,601
Р - 0,130 0,007 - 0,170 0,113
(эксклюзивного представителя компании ООО «Симедика РУ») на соответствие гигиеническим требованиям по микробиологическим показателям по сравнению с референтными методами, используемыми на территории РФ, показали, что такой метод по эффективности не уступает референтным методам исследования воды. Тест-системы, разработанные на основе принципа действия хромогенных сред и специфичные для каждого сани-тарно-показательного микроорганизма, позволяют не только качественно (обнаружено/не обнаружено), но и количественно определять КОЕ/100 мл пробы: колиформные бактерии по изменению цвета среды в лунках; E. coli - по числу флюоресцирующих лунок по отношению к лункам с изменённым цветом среды, характерным для колиформных бактерий; энтерококков -на тест системе Enterolert DW по изменению цвета среды в лунках; P. aeruginosa - по флюоресценции лунок на тест-системе Pseudolert. Следует отметить преимуществом тест-системы Pseudolert, которая позволяет определять в воде не родовой показатель (псевдомонады), а вид, патогенный для человека -Pseudomonas aeruginosa.
Сравнительная оценка тест-систем IDEXX с методами мембранной фильтрации подтвердила сопоставимость полученных результатов как при исследовании загрязнённой воды водоёма с естественным микробиоценозом, так и воды модельных водоёмов, контаминированных суточными культурами тест-микроганизмов. Полученные статистические отклонения при проведении статистического анализа оказались несущественными и находятся в пределах допустимых колебаний различия средних величин.
На основании полученных результатов при использовании метода IDEXX установлено, что альтернативный метод позволяет:
- провести объективный качественный и количественный анализ воды;
- сократить время проведения исследований и получить окончательный ответ (результат) за 24 ч от начала посева, так как он исключает проведение последующих пересевов и других дополнительных манипуляций (определения оксидазной активности бактерий, ферментации углеводов, образования индола и др.) для подтверждения принадлежности к данной группе микроорганизмов.
На основании проведённых исследований установлено, что при проведении санитарно-микробиологического анализа воды при использовании тест-систем IDEXX Laboratories, Inc (США) подтверждение результатов анализа проводить другими методами не требуется.
Установлено, что на протяжении всего срока годности тест-систем IDEXX полученные результаты сопоставимы и при необходимости их возможно воспроизвести. Использование тест-систем IDEXX сокращает время на подготовку и проведение анализа. Метод прост в исполнении. Реагенты для наборов IDEXX не требуют дополнительных трудозатрат, необходимым
условием их применения является доведение их температуры перед исследованием до 22-25 °C .
Необходимым условием для использования IDEXX в практике лабораторного контроля на территории РФ является проведение сравнительных исследований (испытаний) с целью подтверждения идентичности, сопоставимости и воспроизводимости результатов с утверждёнными референтными методами оценки качества питьевой воды по микробиологическим показателям на территории РФ.
Санитарно-микробиологический анализ проб воды, проведённый титрационным методом, наиболее сопоставим с методом IDEXX, поскольку основан на едином принципе обнаружения микроорганизмов.
Ограничения альтернативного метода
- метод позволяет количественно исследовать качество воды с невысоким уровнем загрязнения - не более 200 К0Е/100 см3, поэтому может быть рекомендован для количественного анализа питьевой воды и качественного анализа для исследования поверхностных водоисточников;
- метод требует дополнительного оснащения лаборатории специальным оборудованием производства США (тест-системы, реактивы, аппарат для запаивания тест-системы, аппарат, оснащенный УФ-лампой).
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литер ату р а
1. ГОСТ 31942-2012 (ISO 19458:2006). «Вода питьевая. Отбор проб для микробиологического анализа». М.; 2012.
2. ГОСТ Р 31955-2012 (ISO 9308-1:2000). «Вода питьевая. Обнаружение и количественный учёт Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть 1. Метод мембранной фильтрации». М.; 2012.
3. СанПиН 2.1.4.1074—01. «Питьевая вода. «Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества». М.; 2001.
4. МУК 4.2.1.1018-01. «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды». М.; 2001.
5. МУК 4.2.1884-04. «Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов». М.; 2004.
6. МУ 2.1.4.1184—03. «Методические указания по внедрению и применению санитарно-эпидемиологических правил и нормативов СанПиН 2.1.4.116-02 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества». М.; 2003.
7. Заварзин Г.А., ред. Определитель Берджи. Том 1. М.; 1997.
8. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград: Медицинская литература; 1962.
9. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии. М.: РАМН; 2000.
10. Савилов Е.Д., Мамонтова Л.М., Астафьев В.А., Жданова С.Н. Применение статистических методов в эпидемиологическом анализе. М.; 2004.
11. Халафян А.А. Статистический анализ данных. Статистика 6. М.: Бином; 2008.
References
1. GOST 31942-2012 (ISO 19458:2006). «Drinking water. Sampling for microbiological analysis». Moscow; 2012. (in Russian)
2. GOST R 31955-2012 (ISO 9308-1:2000). «Drinking water. Detection and quantification of Escherichia coli and coliform bacteria. Part 1. Method of membrane filtration». Moscow; 2012. (in Russian)
3. SanPiN 2.1.4.1074-01. «Drinking water. «Hygienic requirements for water quality of centralized drinking water supply systems. Quality control». Moscow; 2001. (in Russian)
4. MUK 4.2.1.1018-01. «Sanitary-microbiological analysis of drinking water». Moscow; 2001. (in Russian)
5. MUK 4.2.1884-04. «Sanitary-microbiological and sanitary-parasitologi-cal analysis of surface water bodies water». Moscow; 2004. (in Russian)
6. MU 2.1.4.1184—03. «Methodical instructions on the introduction and application of Sanitary and Epidemiological Regulations and Norms SanPiN 2.1.4.116-02 «Drinking water. Hygienic requirements for the quality of water packaged in a container. Quality control». Moscow; 2003. (in Russian)
7. Zavarzin G.A., ed. The Determinant of Berdzhi. Volume 1 [Opredelitel' Berdzhi. Tom 1]. Moscow; 1997. (in Russian)
8. Ashmarin I.P., Vorob'ev A.A. Statistical Methods in Microbiological Studies [Statisticheskie metody v mikrobiologicheskikh issledovaniyakh]. Leningrad: Meditsinskaya literatura; 1962. (in Russian)
9. Platonov A.E. Statistical Analysis in Medicine and Biology [Statistiches-kiy analiz v meditsine i biologii]. Moscow: RAMS; 2000. (in Russian)
10. Savilov E.D., Mamontova L.M., Astaf'ev V.A., Zhdanova S.N. The Use of Statistical Methods in Epidemiological Analysis [Primenenie statisticheskikh metodov v epidemiologicheskom analize]. Moscow; 2004. (in Russian)
11. Khalafyan A.A. Statistical Analysis of Data. Statistics 6 [Statisticheskiy analiz dannykh. Statistika 6]. Moscow: Binom; 2008. (in Russian)
Поступила 06.03.17 Принята к печати 05.07.17
