CC BY
60
2015, том 17 [11]
УДК 616.69-008.8-078-078.33
ОПЫТ ИЗУЧЕНИЯ ОБРАЗЦОВ ЭЯКУЛЯТА ИНФЕРТИЛЬНЫХ МУЖЧИН С БЕССИМПТОМНОЙ БАКТЕРИОСПЕРМИЕЙ
А.П. Годовалое
ГБОУ ВПО Пермский государственный медицинский университет имени акад. Е.А. Вагнера Минздрава России,
Кафедра иммунологии, г. Пермь, Россия
Т.И. Карпунина
ГБОУ ВПО Пермский государственный медицинский университет имени акад. Е. А. Вагнера Минздрава России,
Кафедра микробиологии и вирусологии с курсом клинической лабораторной диагностики, г. Пермь, Россия
Аннотация. В настоящем исследовании показано, что в формирование мужского бесплодия значительный вклад вносят условно-патогенные микроорганизмы, адгезирующиеся к сперматозоидам при бессимптомной бактериоспермии. Высокую степень их обсемененности можно рассматривать как одну из возможных причин выработки большого количества антиспермальных антител, которые изменяют качественные и количественные характеристики сперматозоидов, их двигательную активность.
Ключевые слова: бессимптомная бактериоспермия, условно-патогенные микроорганизмы, антиспер-мальные антитела, мужское бесплодие.
Согласно опубликованным данным многолетних исследований в России от 10 до 17% семей бесплодны (4—4,5 млн супружеских пар), при этом в половине случаев установлена связь с нарушением репродуктивного здоровья мужчин [1; 2], что согласуется с результатами подобных исследований и за рубежом [3]. Общепризнано, что инфекционно-воспалительные заболевания яичек, придатков и предстательной железы, частота
встречаемости которых растет с каждым годом, негативно влияют на сперматогенез и фертильность [4; 5]. Опубликованы данные, объясняющие снижение фертильных свойств эякулята нарушениями физико-химических параметров семенной жидкости, повреждающим воздействием реактивных форм кислорода, прямым или опосредованным влиянием патогенных микроорганизмов, развитием патологических аутоиммунных реакций
—---------------------------—
~ 19 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999
e-ISSN 2226-7417
On line scientific @ educational Bulletin “Health and Education Millennium”, 2015. Vol. 17. No 11
—-------£4040^---------—
[6]. В то же время отсутствует убедительная информация о том, что бессимптомная бак-териоспермия (ББ) способна оказывать влияние на качество спермы и стать причиной мужского бесплодия.
Цель исследования — изучить показатели эякулята мужчин с бессимптомной бак-териоспермией, состоящих в бесплодном браке.
Объекты и методы исследования. Проведено лабораторное исследование образцов эякулята 71 мужчины, состоящих в бесплодном браке, средний возраст которых составил 37,7 ± 0,7 года. У обследованных отсутствовали клинические симптомы, характерные для инфекционно-воспалительных заболеваний. Однако при проведении ультразвукового исследования более чем в половине случаев были выявлены диффузные изменения предстательной железы по типу хронического простатита. Срок от начала половой жизни без предохранения до обращения составил от 12 до 60 месяцев. Взятие материала и его исследование проводили согласно стандартизованным методикам, предложенным экспертами ВОЗ (2010) [7].
При микроскопическом исследовании мазков из нативного материала оценивали общее число сперматозоидов, мазки окрашенные эозином использовали для анализа жизнеспособности клеток. Для оценки клеточного состава и морфологических исследований
готовили препараты, окрашенные по методу Романовского-Гимза.
Для бактериологического анализа исследуемых образцов готовили десятикратное разведение исходного материала, считая значимым для дальнейшего анализа количество бактерий, превышающее 103 КОЕ/мл. Стреп-то- и энтерококки изолировали на кровяном агаре, стафилококки выделяли на желточносолевом агаре (ЖСА), грибы рода Candida — на среде Сабуро, энтеробактерии определяли при высеве на агар Эндо, анаэробы — на обогащенной среде для контроля стерильности, разлитой «высоким столбиком» по пробиркам. Количество выделенных микроорганизмов выражали в виде значения десятичного логарифма числа КОЕ/мл биологического материала.
Определение концентрации антиспер-мальных антител (АСА) проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем Bioserv Diagnostics (Германия), согласно инструкции производителя.
Для статистического анализа данных использовали непарный вариант t-критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение. Средний объем эякулята составил 3,7 ± 0,2 мл, рН 7,8 ± ± 0,02, количество сперматозоидов — 81,9 ± ± 7,1 млн/мл, в том числе 84,8 ± 1,7% живых. Подвижность сперматозоидов характеризовалась различными показателями (табл. 1).
Показатели подвижности сперматозоидов
Таблица 1
Движение сперматозоидов Относительные показатели,% Абсолютное значение, млн/мл
быстрое поступательное 34,2 ± 2,3 29,9 ± 3,3
медленное поступательное 18,8 ± 1,5 18,1 ± 3,1
не поступательное 10,7 ± 0,7 9,1 ± 1,4
отсутствует 36,4 ± 2,9 25,0 ± 3,0
—---------------------------—
~ 20 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999
e-ISSN 2226-7417
Годовалов А.П., Карпунина Т.И. Опыт изучения образцов эякулята инфертильных мужчин...
—----------------------
Как видно из табл. 1, более половины сперматозоидов оказались прогрессивно-подвижными, а треть клеток — неподвижными. Средняя линейная скорость движения сперматозоидов составила 12,6 ± 0,6 мкм/сек.
При оценке морфологических характеристик почти у половины (46,1 ± 1,8%) сперматозоидов обнаруживали те или иные изменения, среди которых наиболее существенное место занимали дефекты головки — 40,3 ± ± 1,7% (16,6 ± 3,2 млн/мл). Доли повреждений средней части и хвоста оказались равнозначными — 8,3 ± 0,7% (3,4 ± 0,7 млн/мл) и 9,5 ± ± 0,7% (3,3 ± 0,4 млн/мл) соответственно. Клетки сперматогенеза составили 1,0 ± 0,1%, число лейкоцитов не превышало 1,4 ± 0,5, а макрофагов — 0,6 ± 0,04 в поле зрения. Несмотря на выявленные дефекты, в целом показатели, характеризующие состояние сперматозоидов, соответствовали значениям, регламентированным ВОЗ (2010) как «нормальные» [7].
Одним из факторов репродуктивных неудач, как считают исследователи, может служить обсемененность спермальной жидкости микроорганизмами [5]. По нашим наблюдениям общее микробное число спермоплазмы в группе обследованных мужчин составило 7,2 ± 0,5 КОЕ/мл. Обсемененность эякулята грамположительными кокками (5,7 ± 0,4 КОЕ/мл) статистически значимо ниже, чем грамотрицательными палочками (6,8 ± 0,3 КОЕ/мл; р < 0,05). В зависимости от грампринадлежности высеваемых бактерий, исследуемые образцы условно поделили на 2 группы. Количество сперматозоидов, а также их жизнеспособность в сравниваемых группах статистически значимо не различались (р > 0,05). При оценке показателей подвижности сперматозоидов в пробах с наличием грамотрицательных палочек обнаружено 14,6 ± 4,9 млн/мл непоступательно подвижных клеток, а при выявлении грампо-ложительных кокков — 6,0 ± 1,2 млн/мл (р < < 0,05), соответственно сперматозоидов с дефектами зарегистрировано 53,9 ± 16,0 млн/мл и 26,6 ± 4,9 млн/мл (р < 0,05). Необходимо
отметить, что у пациентов с грамотрицатель-ными палочками в спермоплазме статистически значимо чаще встречались дефекты всех частей сперматозоида: головки — 22,1 ± 6,7; средней части и шейки — 3,6 ± 1,1 и хвоста — 6,1 ± 2,2 млн/мл. В группе сравнения количество сперматозоидов с дефектами головки составило 10,1 ± 2,2 (р < 0,05); средней части и шейки — 1,4 ± 0,4 (р<0,05) и хвоста — 2,3 ± 0,5 млн/мл (р < 0,05).
В 7,7% образцов, контаминированных грамположительными кокками, была выявлена агглютинация сперматозоидов, что можно объяснить наличием фактора спермагглюти-нации у кокковой микрофлоры [8]. В то же время у пациентов с грамотрицательными палочками в эякуляте феномена агглютинации выявлено не было. Микробная обсеме-ненность не оказывала существенного влияния на аггрегацию сперматозоидов.
Известно, что при персистировании бактерий на сперматозоидах формируются антитела, как к антигенам бактерий, так и к антигенам клеток человека [9]. У 8,7% мужчин обнаружены АСА. Общее микробное число эякулята мужчин с АСА 5,3 ± 0,3 КОЕ/мл, в отсутствии аутоантител — 3,9 ± 0,4 КОЕ/мл (р < 0,05). Обнаружение АСА в семенной жидкости ассоциировалось с выделением представителей семейства Enterobacteriaceae (69,3% проб). В 88,8% случаев при детекции грамположительных кокков аутоантитела выявлены не были. Массивное инфицирование семенной жидкости условно-патогенными бактериями, вероятно, способствует увеличению количества антиспермальных антител, которые нарушают активность сперматозоидов. По нашим данным наличие антиспер-мальных антител сочеталось со сниженным количеством сперматозоидов. Так, число клеток в отсутствии АСА составило 91,4 ± ± 12,5 млн/мл, а при их наличии — 47,9 ± ± 9,2 млн/мл (р < 0,05).
При изучении параметров, характеризующих подвижность сперматозоидов, установлено существенное изменение последних под влиянием антиспермальных антител (табл. 2).
—-----------------------------—
~ 21 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999
e-ISSN 2226-7417
On line scientific @ educational Bulletin “Health and Education Millennium”, 2015. Vol. 17. No 11
—------£4040^-----------
Влияние антиспермальных антител на показатели подвижности сперматозоидов
Таблица 2
Движение сперматозоидов Наличие АСА Отсутствие АСА Р
быстрое поступательное 9,9 ± 5,7 млн/мл 30,1 ± 4,1 млн/мл < 0,05
медленное поступательное 10,2 ± 2,4 млн/мл 14,4 ± 2,6 млн/мл > 0,05
отсутствует 19,9 ± 1,1 млн/мл 4,8 ± 1,2 млн/мл < 0,05
средняя линейная скорость 10,7 ± 1,2 мкм/сек 13,6 ± 0,5 мкм/сек < 0,05
Несмотря на изменение характеристик, отображающих подвижность сперматозоидов, АСА в семенной жидкости не оказывали существенного влияния на морфологические свойства клеток. Число клеток с дефектами в спермоплазме с АСА составило 22,0 ± ± 3,6 млн/мл (30,9 ± 4,1 млн/мл — без АСА; р > 0,05).
Количество лейкоцитов у мужчин с разным содержанием АСА статистически значимо не различалось. Обращает на себя внимание установленная связь повышения количества клеток сперматогенеза (с 0,5 ± 0,1% до 0,7 ± 0,1%) с наличием АСА (р < 0,05). Однако расшифровка механизма и причин такого явления требует дальнейшего изучения.
Таким образом, среди обследованных мужчин, имеющих репродуктивные проблемы, не выявлено диагностически значимых отклонений по показателям морфологии и подвижности сперматозоидов, однако в большинстве случаев прослеживалась значительная микробная обсемененность эякулята. Известно, что микроорганизмы имеют уникальные способности к адгезии, в том числе к сперматозоидам, способствуя инфицированию и яйцеклетки, что может нарушать процесс оплодотворения, деления зиготы [10, 11].
Выводы. Проведенные исследования показали, что при нарушении фертильности значительную роль играют микроорганизмы, адгезирующиеся к сперматозоидам при бессимптомной бактериоспермии. Массивное инфицирование эякулята условно патогенными
микроорганизмами является одной из возможных причин формирования большого количества антиспермальных антител, присутствие которых коррелирует с изменением качественных и количественных характеристик мужских половых клеток.
ЛИТЕРАТУРА
1. Лебедев В.В. Нарушения мужского репродуктивного здоровья и пути их профилактики: автореф. дисс. .. канд. мед. наук. М., 2012.
2. Богданов Ю.А., Карпунина Т.И., Зуева Т.В. К вопросу о распространенности мужского бесплодия // Медицина и образование в Сибири. 2013. № 5. С. 54—60.
3. Carr B.R. Optimal diagnosis and medical treatment of male infertility // Semin. Reprod. Med. 2013. Vol. 31. P. 231—232.
4. Domes T., Lo K.C., Grober E.D., Mullen J.B., Mazzulli T., Jarvi K. The incidence and effect of bac-teriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters // Fertil. Steril. 2012. Vol. 97. P. 1050—1055.
5. Weng S.L., Chiu C.M., Lin F.M., Huang W.C., Liang C., Yang T., Yang T.L., Liu C.Y., Wu W.Y., Chang Y.A., Chang T.H., Huang H.D. Bacterial communities in semen from men of infertile couples: metagenomic sequencing reveals relationships of seminal microbiota to semen quality // PLoS One. 2014. Vol. 9(10). P. e110152.
6. Семенов А.В. Репродуктивная функция мужчин при хроническом бактериальном простатите: клинические и иммунологические аспекты: автореф. дисс. ... докт. мед. наук. М., 2010.
7. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. WHO (Geneva), 2010. Vol. 270.
—--------&*&+&**3---------—
~ 22 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999
e-ISSN 2226-7417
Годовалов А.П., Карпунина Т.И. Опыт изучения образцов эякулята инфертильных мужчин...
—----------------------
8. Kaur S., Prabha V., Sarwal A. Receptor mediated agglutination of human spermatozoa by sperm-agglutinating factor isolated from Staphylococcus aureus // J. Urol. 2010. Vol. 184(6). P. 2586—90.
9. Mazumdar S., Levine A.S. Antisperm antibodies: etiology, pathogenesis, diagnosis, and treatment // Fertil. Steril. 1998. Vol. 70(5). P. 799—810.
10. Lang T., Dechant M., Sanchez V., Wistuba J., Boiani M., Pilatz A., Stammler A., Middendorff R., Schuler G., Bhushan S., Tchatalbachev S., Wubbel-
ing F., Burger M., Chakraborty T., Mallidis C., Meinhardt A.. Structural and functional integrity of spermatozoa is compromised as a consequence of acute uropathogenic E. coli-associated epididymitis // Biol. Reprod. 2013. Vol. 89(3). P. 1—10.
11. Rennemeier C., Frambach T., Hennicke F., Dietl J., Staib P. Microbial quorum-sensing molecules induce acrosome loss and cell death in human spermatozoa // Infection and immunity. 2009. Vol. 77(11). P. 4990—4997.
RESEARCH EXPERIENCE OF EJACULATE SAMPLES
FROM INFERTILE MEN
WITH ASYMPTOMATIC BACTERIOSPERMIA
A.P. Godovalov
Acad. E.A. Wagner Perm State Medical University,
Immunology department,
Perm, Russia
T.I. Karpunina
Acad. E.A. Wagner Perm State Medical University,
Microbiology and virology department,
Perm, Russia
Annotation. The present study shows that male infertility development is significantly contributed by pathogenic microorganisms which adhere to the sperm cells in asymptomatic bacteriospermia. A high degree of contamination can be considered as a possible cause of generating a large amount of anti-sperm antibodies which alter the qualitative and quantitative characteristics of sperm cells and their activity.
Key words: asymptomatic bacteriospermia, opportunistic pathogens, anti-sperm antibodies, male infertility.
REFERENCES
1. Lebedev V.V. Narushenija muzhskogo re-produktivnogo zdorov'ja i puti ih profilaktiki: avtoref. diss. kand. med. nauk. Moskow, 2012.
2. Bogdanov Ju.A., Karpunina T.I., Zueva T.V. K voprosu o rasprostranennosti muzhskogo bes-plodija. Medicina i obrazovanie v Sibiri, 2013, no. 5, pp. 54—60.
3. Carr B.R. Optimal diagnosis and medical treatment of male infertility. Semin. Reprod. Med., 2013, vol. 31, pp. 231—232.
4. Domes T., Lo K.C., Grober E.D., Mullen J.B., Mazzulli T., Jarvi K. The incidence and effect of bac-teriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil. Steril., 2012, vol. 97, pp. 1050—1055.
5. Weng S.L., Chiu C.M., Lin F.M., Huang W.C., Liang C., Yang T., Yang T.L., Liu C.Y., Wu W.Y., Chang Y.A., Chang T.H., Huang H.D. Bacterial communities in semen from men of infertile couples: metagenomic sequencing reveals relationships of seminal microbiota to semen quality. PLoS One, 2014, vol. 9(10). P. e110152.
6. Semenov A.V. Reproduktivnaja funkcija muzhchin pri hronicheskom bakterial'nom prostatite: klinicheskie i immunologicheskie aspekty: avtoref. diss. dokt. med. nauk. Moskow, 2010.
7. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. WHO (Geneva), 2010. Vol. 270.
8. Kaur S., Prabha V., Sarwal A. Receptor mediated agglutination of human spermatozoa by sper-
—-----------------------------—
~ 23 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999
e-ISSN 2226-7417
On line scientific @ educational Bulletin “Health and Education Millennium”, 2015. Vol. 17. No 11
—-------£4040^---------—
magglutinating factor isolated from Staphylococcus aureus. J. Urol., 2010, vol. 184(6), pp. 2586—90.
9. Mazumdar S., Levine A.S. Antisperm antibodies: etiology, pathogenesis, diagnosis, and treatment. Fertil. Steril, 1998, vol. 70(5), pp. 799—810.
10. Lang T., Dechant M., Sanchez V., Wistuba J., Boiani M., Pilatz A., Stammler A., Middendorff R., Schuler G., Bhushan S., Tchatalbachev S., Wubbel-ing F., Burger M., Chakraborty T., Mallidis C.,
Meinhardt A.. Structural and functional integrity of spermatozoa is compromised as a consequence of acute uropathogenic E. coli-associated epididymitis. Biol. Reprod, 2013, vol. 89(3), pp. 1—10.
11. Rennemeier C., Frambach T., Hennicke F., Dietl J., Staib P. Microbial quorum-sensing molecules induce acrosome loss and cell death in human spermatozoa. Infection and immunity, 2009, vol. 77(11), pp. 4990—4997.
