CC BY
58
УДК 636.082.2:575.113
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПЦР ДЛЯ СКРИНИНГА НОСИТЕЛЬСТВА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ АНОМАЛИИ CVM OPTIMIZATION OF PCR CONDITIONS FOR SCREENING OF CARRIERS OF CVM GENETIC ANOMALIES
Мачульская Елена Витальевна, к.б.н., Ковалюк Наталья Викторовна, д.б.н., Шахназарова Юлия Юрьевна,
ФГБНУ СКНИИЖ, Российская Федерация, г. Краснодар
Гырнец Евгений Анатольевич., магистрант
ФГБОУ ВО «Кубанский государственный университет»
Российская Федерация, г. Краснодар
Machulskaya Elena Vitalievna, Cand. Biol. Sc.
Kovalyuk Natalia Viktorovna, Dr. Biol. Sc
Shakhnazarova Yulia Yurievna, research orker
North-Caucasus Research Institute of Animal Husbandry, Krasnodar,
Russian Federation
Gyrnets Evgeniy Anatolevich, Mа student
Kuban State University, Krasnodar, Russian Federation
Аннотация: оптимизирована методика постановки ПЦР при детекции генетической аномалии CVM, проведен скрининг 20 племенных коров.
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция; скрининг; генетическая аномалия CVM.
Abstract: methods of setting PCR for the detection of CVM genetic anomaly were optimized; 20 breeding cows were screened.
Key words: polymerase chain reaction; screening; CVM genetic anomaly.
Генетическое совершенствование пород сельскохозяйственных животных предусматривает международный обмен генофондом с целью использования лучших мировых селекционных достижений [2]. Однако завоз племенного материала из-за рубежа сопряжен с неконтролируемым появлением и распространением наследственных аномалий, способных нанести существенный вред развитию
животноводства и поставить под угрозу биологическую безопасность страны [1].
В лаборатории биотехнологии ФГБНУ СКНИИЖ оптимизирована методика определения достаточно распространенных генетических аномалий (рецессивных мутаций): BY, DUMS, BC, BLAD, CVM, FXID.
CVM - один из широко распространенных рецессивных генетических пороков голштинского скота (complex vertebral malformation) [4]. Частота встречаемости в различных популяциях - от 1 % до 23 %. Причина CVM - мутация в гене SLC35A3 (замена G ^T в позиции 559 четвертого экзона).
Данный ген кодирует белок (UDPN-acetylglucosamine transporter), относящийся к семейству растворимых ферментов переносчиков, транспортирующих нуклеотидсвязанные сахара из цитозоля в компартменты эндоплазматического ретикулума и/ или аппарата Гольджи [6]. В этих органеллах нуклеотидные сахара утилизируются гликозилтрансферазами в ходе синтеза углеводных компонентов гликопротеинов, гликолипидов и углеводородных полимеров. Экспериментально показано, что особи, дефективные по генам таких переносчиков, характеризуются различными дефектами и повреждениями при эмбриональном развитии, главным образом обусловленными неспособностью транспортировать нуклеотидные сахара-субстраты, необходимые для биосинтеза в органеллах глюкозаминоглицина [3].
Характерные признаки телят - носителей CVM - общая недоразвитость, укороченная шея, слившиеся и деформированные позвонки, сколиоз, пороки ребер, а также деформация суставов передних и задних конечностей. К действию этого рецессивного гена относятся, кроме того, пороки сердца.
Существуют различные подходы для выявления данной мутации. Так, нуклеотидную замену G ^T в позиции 559 четвертого экзона гена SLC35A3 можно определить с помощью ДНК - секвенирования. Также возможна идентификация путем постановки так называемой CRS-PCR с привнесением в ПЦР -продукт нового сайта рестрикции [7]. Для идентификации
носителей мутации в нашей лаборатории мы выбрали аллель специфическую полимеразную цепную реакцию [5].
Цель работы - оптимизировать методику постановки ПЦР при скрининге генетической аномалии CVM.
Методика. Исследования были проведены на базе лаборатории биотехнологии ФГБНУ Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства. Объектом исследования была кровь 20 коров голштинской породы.
Для выделения ДНК из образцов крови использовали наборы реагентов Diatom™ DNA Prep 100 ООО «Лаборатория Изоген» г. Москва. Для проведения ПЦР использовали олигонуклеотидные праймеры [5], нуклеотидные последовательности которых, а также размер образующегося ПЦР-продукта, представлены в таблице 1.
Для контроля прохождения реакции и оценки качества и концентрации ПЦР - продуктов проводили электрофорез в 2 % агарозном геле.
Таблица 1 - Используемые олигонуклеотидные праймеры и получаемый ПЦР - продукт при постановке ПЦР на выявление мутации CVM
CVM Размер ПЦР-продук та, п.н Последовательность праймеров
G ^T, 4 экзон гена SLC35A3 395 CVM G 5' CACAATTTGTAGGTCTCATGGCAG3' CVM T 5' CACAATTTGTAGGTCTCATGGCAT3' CVM R 5'GTTATACTACAGGAGTCACCTCT3'
При скрининге интересующего нас участка экзона 4 гена SLC35A3 для выбора оптимальных условий реакции использовали различные условия амплификации. Режимы амплификации подбирались эмпирическим путем для ДНК-амплификатора МС-2 (производство «ДНК-Технология»). Варьировали температурой отжига праймеров (Т° = 56 - 64 X) и количеством циклов амплификации (кол-во циклов = 30 - 35).
Наилучший режим определяли по максимальному количеству выхода специфического фрагмента.
Результаты исследований и их обсуждение. Наилучший результат по выходу специфического продукта дала полимеразная цепная реакция со следующими условиями амплификации: 94 °С -3 мин. 94 °С - 30 сек.
64 °С - 30 сек. 30 циклов 72 °С - 30 сек. 72 °С - 3 мин.
Для детекции нуклеотидной замены G ^Т в позиции 559 четвертого экзона гена SLC35A3 необходимо поставить две реакции с одной той же ДНК животного. В первой реакции используется пара олигонуклеотидных праймеров СУМ G и СУМ R. Вторая реакция ставится с праймерами СУМ Т и СУМ R, выход специфического продукта при этом должен наблюдаться у носителей мутантного аллеля.
На электрофореграмме (рис. 1) представлены результаты скрининга 20 коров быкопроизводящей группы одного из племенных хозяйств Краснодарского края на наличие генетической аномалии CVM.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Рис. 1 - Электрофореграмма результатов скрининга 20 коров на наличие генетической аномалии CVM 1-й ряд:1-7, 9-18 - ПЦР-продукт реакции ОЯ, 8 - маркер молекулярного веса М50;
2-й ряд: 1-3 - ПЦР-продукт реакции GR, 4 - «-»-контроль GR, 59,11-18 - ПЦР-продукт реакции TR, 10 - маркер молекулярного веса М50;
3-й ряд: 1-5,7-8 - ПЦР-продукт реакции TR, 9 - «-»-контроль TR, 6 - маркер молекулярного веса М50.
Таким образом, видно, что реакция с праймерами CVM G и CVM R прошла у всех 20 исследуемых животных, а реакция с праймерами CVM T и CVM R прошла только у двух животных, которые и являются носителями мутантного аллеля.
Вывод. Для получения выхода специфического ПЦР -продукта в результате амплификации при скрининге на носительство CVM необходимо оптимизировать условия реакции, указанные в литературе.
Список литературы
1. Гладырь, Е.А., Зиновьева, Н.А., Эрнст, Л.К., Костюнина, О.В., Быкова, А.С., Банникова, А.Д., Кудина, Е.П., Брем, Г. Молекулярные методы в диагностике заболеваний и наследственных дефектов сельскохозяйственных животных // Зоотехния. -2009. - № 8. - С . 26-27.
2. Ковалюк, Н.В., Сацук, В.Ф., Волченко, А.Е., Мачульская, Е.В, Шахназарова, Ю.Ю. Использование полиморфизма локуса лептина в селекции крупного рогатого скота айрширской породы // Молочное и мясное скотоводство, 2014.- № 6. - С. 13-15
3. Duncan, R. B. Jr., Carrig, C. B., Agerholm, J. S., Bendixen, C. Complex vertebral malformation in a Holstein calf: report of a case in the USA / / J. Vet. Diagn. Invest. - 2001. - Vol. 13. - P. 333336
4. Nagahata, H., Oota, H., Nitanai, A. et al. Complex vertebral malformation in a stillborn Holstein calf in Japan.// J. Vet. Med. Sci. - 2002. - Vol. 64. - P. 1107-1112
5. Paiva, D.S. et al. Incidence of bovine leukocyte adhesion deficiency, complex vertebral malformation, and deficiency of uridine-5-monophosphate synthase carriers in Brazilian Girolando cattle// Genetics and Molecular Research 12 (3). 2013. Р. 3186-3192
6. Thomsen B., Horn P., Panitz F. et al. A missense mutation in the bovine SLC35A3 gene, encoding a UDP-N-acetylglucosamine transporter, causes complex vertebral malformation / / Genome Res. -2006. - Vol. 16. - P. 97-105
7. Wang, C., Tong, Q., Hu X.Z., et all Identification of complex vertebral malformation carriers in Holstein cattle in south China // Genet. Mol. Res. 10 (4): 2443-2448 (2011)
