CC BY
54
5. О текущей ситуации в агропромышленном комплексе Российской Федерации в декабре 2014 года / Министерство сельского хозяйства Российской Федерации. URL: http://\v\v\v.mcx.ru. (Дата обращения -21.04.2015 г.)
6. Смирнова М.Ф и др. Развитие мясного скотоводства в СЗФО Российской Федерации (рекомендации). -
СПб.: ГНУ СЗНИЭСХ Росельхозакадемии, 2012. - 39 с.
7. Смирнова М.Ф., Сафронов C.JL, Смирнова В.В. Сравнительная оценка мясной продуктивности бычков
герефордской и черно-пестрой пород в условиях Ленинградской области // Молочное и мясное скотоводство. - 2013. - №4. - С.30-32.
8. Феклин И.И., Мирошников С.А., Мазуровский JI.3. Основные направления в селекции и воспроизводстве мясного скота в хозяйствах Челябинской области // Зоотехния. - 2008. - № 5. - С. 2-6.
УДК 575.116.4:575.2 Канд. биол. наукН.В. ДЕМЕНТЬЕВА
(ФГБНУ ВНИИГРЖ, dementevaniSimail.ra) Канд. биол наук О.В. МИТРОФАНОВА (ФГБНУВНИИГРЖ, mol969iS>mail.ra) Аспирант А.А. КУДИНОВ (ФГБНУ ВНИИГРЖ, kudinov_aaiS>list.ra)
АНАЛИЗ ЧАСТОТЫ ВСТРЕЧАЕМОСТИ ТРЕХ РЕЦЕССИВНЫХ ЛЕТАЛЬНЫХ МУТАЦИЙ
У КОРОВ ЛЕНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ
ПЦР-ПДРФ, BLAD, CVM, BY, брахиспина
Ленинградская область в последние годы вышла на лидирующие позиции в производстве молочной продукции. Это результат грамотной работы специалистов и широкого распространения голштинизированного черно-пестрого скота, выделенного в отдельный Ленинградский тип породы.
Наибольшее распространение в области получили три линии голштинской породы, основателями которых были быки Вис Айдиал 933122, Рефлешинг Соверинг 198998 и Монтвик Чифтейн 95679. В линии Монтвик Чифтейн существенно повлиял на черно-пеструю породу бык-производитель К.М.А. Белл 1667366. Обладая замечательными способностями по улучшению продуктивных показателей своих дочерей, он оказался носителем летальных рецессивных мутаций, которые были переданы потомкам и получили широкое распространение во многих странах мира [1].
У крупного рогатого скота к настоящему времени выявлено почти полсотни мутаций, которые включены в Международный список летальных дефектов. Этот список периодически пополняется, так как идет открытие новых аномалий [2].
Благодаря развитию генетических методов анализа ДНК молекулярная основа некоторых дефектов была обнаружена. Это позволило создать простые и надежные тест-системы для выявления скрытого носительства [3]. В настоящее время в лаборатории молекулярной цитогенетики ФГБНУ ВНИИГРЖ (Санкт-Петербург) проводится мониторинг популяций крупного рогатого скота на следующие дефекты:
- дефицит адгезивности лейкоцитов или BLAD (Bovine Leucocyte Adhésion Deficiency);
- комплексное уродство позвоночника или CVM (Complex vertebral malformation);
- синдром короткой спины или Brachyspina (Bovine Brachyspina Syndrome).
Основная цель настоящей работы - проанализировать частоту встречаемости рецессивных мутаций у крупного рогатого скота в нашем регионе.
Материалом для работы послужила ДНК, выделенная из крови коров 2011-2012 г. р. голштинской породы 4 племенных хозяйств Ленинградской области (п=155).
Кровь отбирали в микропробирку, содержащую в качестве антикоагулянта 1 каплю 200 мМ ЭДТА. До использования образцы хранили в холодильнике при -20°С.
ДНК выделяли по стандартной методике с использованием протеиназы К («Сибэнзим», Новосибирск) и фенола.
Для выявления мутации BLAD использовали следующие праймеры, синтезированные компанией «Синтол»: 5 ' AGGC AGTTGCGTTC A ACGTG А-3 ' (прямой) и 5'-С С G А С Т С G G TG A TG С С A TTG А -3 ' (обратный). ПЦР проводили в общем объеме 25 мкл, содержащем 1 ед. Taq - полимеразы, по 0,25 тМ каждого dNTP, 67 тМ трис -НС1 рН 8,6, 2,5 тМ
MgCl2, 16,6 шМ NH4OH, по 0,5 мкм каждого праймера и 100-150 нг ДНК В последнее время используем буфер из набора фирмы Интерлабсервис «5х ПЦР-буфер blue».
Основные этапы ПЦР включали первоначальную денатурацию (95 °С, 1 мн.), затем шла серия из 40 циклов, состоящих из ряда повторяющихся этапов: денатурация - 95°С (1 мн.), отжиг праймеров - 62°С (1 мн.), синтез - 72°С (1 мн.). В заключение шел финальный синтез при температуре 72°С продолжительностью 5 мин.
Полученный продукт амплификации, размером 158 пар нуклеотидов (п. н.) обрабатывали при помощи 3-4 ед. рестриктазы Taql (Fermentas) при температуре 56°С в течение 2 часов. У здоровых животных на электрофорезе видны два фрагмента ДНК, размером 100 п.н и 58 п.н. В этом случае фермент разрезает амплификат полностью. Носители мутации будут гетерозиготными, так как у них исчезает сайт рестрикции для Taq I. На электрофорезе это проявляется в виде трех ДНК фрагментов размером 158 п.н., 100 п.н., 58 п.н соответственно (рис. 1).
58 п.н. 100 п.н. 158 п.н.
Рис. 1. Картина ПЦР-ПДРФ на носительство мутации BLAD у 13 коров: 1, 5, 6, 7 - носители мутации BLAD; 2, 3, 4, 9 - 13 - норма (не носители);
8 - гомозиготный носитель мутации BLAD; М - маркер молекулярных масс pUC19 DNA/Mspl
Выявление мутации CVM осуществляли с применением альтернативных праймеров: прямой №1 (5'- САС ААТ TTG TAG GTC ТСА CTG GAT-3'), прямой №2 (5'- САС ААТ TTG TAG GTC ТСА CTG GAG-3') и обратный (5'- CGA TGA AAA AGG ААС CAA AAG GG-3') [4].
В этом случае необходимо поставить две реакции ПЦР с использованием следующих комбинаций праймеров: прямой №1 + обратный и прямой №2 + обратный. В случае если амплификация произойдет в комбинации прямой №1 + обратный, можно говорить о наличии мутации. На рис. 2 представлены результаты определения носительства CVM у крупного рогатого скота. В связи с тем, что каждый образец представлен в двух реакциях амплификации (аллель-специфическая ПЦР-реакция), на картине видим пары дорожек. Каждая пара соответствует двум реакциям и одной особи.
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 М
147 п.н
Рис. 2. Картина продуктов амплификации на носительство мутации СУМ (дорожки 1-2 и 5-6 -неносители мутации, остальные пары дорожек - носители)
Полимеразную цепную реакцию проводили по опробированной ранее схеме, когда отжиг праймеров проходит при температуре 62°С.
Для определения носительства брахиспинального синдрома также использовали альтернативные праймеры (табл. 1).
Таблица 1. Пары праймеров, использованные для определения брахнспннального
синдрома у коров
Название праймера Праймер участка 5 ' - 3 ' Размер мутантного аллеля Размер не мутантного аллеля
Прямой №1 GCTCAAGTAGTTAGTTGCTCCACTG 409 Ьр (3738 Ьр)
Обратный №1 ATAAATAAATAAAGCAGGATGCTGAAA
Прямой №2 TCACAAAAGGGTAGGAGACTACCATG / 537 Ьр
Обратный №2 GCTTATTGTTTACCCTTGACAGTGG
На каждый образец проводились две реакции ПЦР. Программа включала в себя первоначальную денатурацию при 95°С в течение 5 мин., далее следовало 30 циклов, состоящих из денатурации при 94°С, отжига праймеров при 60°С и элонгации при 73°С. Завершается программа финальным синтезом в течение 5 мин. на 73°С.
После завершения полимеразной цепной реакции было проведено определение генотипов животных в 1,5% агарозном геле.
537 п.н 409 п.н
а)
Ъ)
Рис. 3. Картина распределения фрагментов ДНК при анализе коров на брахиспинальный синдром:
а - две особи носители делении, Ь - две особи неносители делении
В результате на полученных электрофореграммах мы видим фрагмент 409 пар оснований, который соответствует мутантному аллелю BS-мутации, и фрагмент 537 пар оснований, который соответствует не мутантному аллелю (рис. 3). Животные, имеющие оба фрагмента, являются гетерозиготными по мутации BS, а значит, носителями этого дефекта.
В табл. 2 представлены частоты встречаемости рецессивных мутаций в различных хозяйствах Ленинградской области. Всего нами было протестировано 155 животных.
Носительство мутации BLAD, связанной с нарушением адгезии лейкоцитов, в среднем по 4 хозяйствам составило 2,6%. Мутация обнаружена достаточно давно и тестирование на ее носительство ведется более 20 лет, но полностью избавиться от этого заболевания не удается [6]. В то же время из протестированных нами 50 коров хозяйства №3 носителей не выявлено. Можно предположить, что в хозяйстве ведется анализ быков-производителей на наличие у них этого скрытого дефекта, а также анализ родословных коров.
CVM-дефект тестируется с 2002 года [5,7]. Из проанализированных предприятий следует отметить хозяйство №4, где из 40 животных носители не обнаружены. В хозяйстве №2 было выявлено 3 коровы со скрытым носительством CVM, что составило 11,5% от протестированного поголовья.
Брахиспинальный синдром был описан и начал тестироваться совсем недавно [8]. Поэтому его высокий процент распространения в хозяйствах Ленинградской области хорошо объясним. Всего из 155 коров у 13 животных (8,4%) было выявлено скрытое носительство данного нарушения.
Анализ родословных показал, что носителем и распространителем данного дефекта оказался популярный бык С.Х.Традишн 1682485 из линии Вис Айдиал 933122 и его сыновья - Клейтус
1879085 и Ледман 1983348. В настоящее время менее 5% канадской, 6-8% американской и голландской голштинской популяции крупного рогатого скота могут нести ген ВгасЬузрта [1].
Таблица 2. Частоты встречаемости рецессивных летальных мутаций ВЬАБ, СУМ и В8
в 4 хозяйствах Ленинградской области
Хозяйство Число голов, ВГАБ СУМ BY
11 11 % 11 % 11 %
№1 39 1 2,6 1 2,6 3 7,7
№2 26 2 7,7 3 11,5 2 7,7
№3 50 - - 1 2 6 12
№4 40 1 2,5 - - 2 5
В среднем по 4-м хозяйствам 155 4 2,6 8 5,2 13 8,4
В целом, анализируя ситуацию с распространением носительства рецессивных мутаций в молочных хозяйствах Ленинградской области, можно отметить следующее:
1. Мутация BLAD, несмотря на то, что уже имеет определенную историю, продолжает поддерживаться в скрытом состоянии на уровне 2,6%.
2. CVM-дефект в отдельных хозяйствах не выявлен, а в других популяциях получил широкое распространение.
3. Брахиспинальный синдром требует самого пристального внимания. Частота его встречаемости высока и составляет от 5 до 12% в отдельных хозяйствах и 8,4% в среднем по проанализированному поголовью (155 коров).
Для того чтобы избежать возможной эмбриональной смертности из-за перехода скрытого дефекта в гомозиготное летальное состояние, необходим не только анализ родословных быков-производителей. Желательно проводить тестирование на носительство коров, особенно если в предках у них были носители мутаций.
Литература
1. Барсукова О.Е. Рецессивные генетические дефекты в голштинской породе // Бюлл. ГНУ ВНИИГРЖ,-СПб. 2012. -С.15-17.
2. Смарагдов М.Г. Тотальная геномная селекция с помощью SNP как возможный ускоритель традиционной селекции // Генетика. - 2009. - №6. - С.725-728.
3. Яковлев А., Терлецкий В., Митрофанова О., Дементьева Н. Определение носителей генетических дефектов среди быков-производителей // Молочное и мясное скотоводство.-2004.-Т.6. - С.31-32.
4. Дементьева Н. В., Митрофанова О.В., Тыщенко В.И и др. Встречаемость и значение мутации СУМ у племенных животных Ленинградской области // Молочное и мясное скотоводство. - 2014. - №6,- С.7-9.
5. Pareek C.L., Kamifiski S. Bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) and its worldwide prevalence. // Journal of Applied Genetics.-1996.-v.37.-P. 299-311.
6. Agerholm J.S., Bendixen C, Andersen O, Arnbjerg J. Complex vertebral malformation in Holstein calves // Journal Veterinary Diagnosis Investigation.-2001.-v. 13. P.283-289.
7. Agerholm J.S., McEvoy F. Arnbjerg Brachvspina syndrome in a Holstein calf.J // J Vet Diagn Invest.-2006.-V. 18(4). -P.418-422.
