CC BY
33
УДК 543.54:543.51:543.05
Вестник СПбГУ. Сер. 4. Т. 2 (60). 2015. Вып. 4
А. И. Уколов, Т. И. Орлова, А. С. Радилов
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ХРАНЕНИЯ ОБРАЗЦОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ МЕТОДОМ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОМАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека, Российская Федерация 188663, Ленинградская обл., Всеволожский р-н, г. п. Кузьмоловский, ст. Капитолово, корп. 93
Предложены рекомендации по надлежащему хранению образцов плазмы крови с целью проведения количественного хроматомасс-спектрометрического определения свободных (СЖК) и этерифицированных жирных кислот (ЭЖК). Перечень целевых соединений включает 19 насыщенных кислот (С6—С24) и 20 ненасыщенных кислот (С16 —С24), в том числе ю-3, ю-6, ю-9 и полиненасыщенные жирные кислоты. Для одновременного извлечения СЖК из матрицы и дериватизации использован метод экстрактивного алкилирования йодистым метилом. Надлежащие условия хранения не должны приводить к изменениям концентраций определяемых соединений, превышающим методическую погрешность измерений. Показано, что образцы сохраняют пригодность для анализа СЖК и ЭЖК в течение одного цикла замораживания/размораживания и до 14 дней хранения при —20°С. При этом СЖК проявляют большую стабильность, так, их определение возможно и после двух циклов замораживания/размораживания и даже после хранения образцов при +4°С в течение двух дней. Библиогр. 13 назв. Ил. 2. Табл. 3.
Ключевые слова: кровь, хранение, жирные кислоты, экстрактивное алкилирование, хроматомасс-спектрометрия.
A. I. Ukolov, T. I. Orlova, A. S. Radilov
OPTIMIZATION OF STORAGE CONDITIONS OF BLOOD PLASMA SAMPLES FOR GC-MS QUANTIFICATION OF FATTY ACIDS
Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology, Build. 93, Kapi-tolovo Station, g/p Kuz'molovsky, Vsevolozhsky District, Leningrad Region, 188663, Russian Federation
In this paper, we proposed guidelines for proper storage of plasma samples for the purpose of quantitation of free (FFA) and esterified fatty acids (EFAs). List of target compounds includes 19 saturated acids (C6—C24) and 20 unsaturated fatty acids (C16—C24) including rn-3, rn-6, rn-9 polyunsaturated fatty acids. For the simultaneous extraction of FFA from the matrix the and derivatization we used extractive alkylation with methyl iodide. Proper storage conditions should not lead to changes in the concentration of the compounds in excess of methodical error of measurement. It is shown that the samples remain suitable for FFA and EFA analysis during one cycle of freezing/thawing, and 14 days of storage at —20°C. Thus FFA exhibit greater stability: their determination is possible after two cycles of freeze/thawing, or even after storage of samples at +4°C for two days. Refs 13. Figs 2. Tables 3.
Keywords: blood, storage, fatty acids, extractive alkylation, GC-MS.
Введение. Хроматомасс-спектрометрические методы исследования профилей низкомолекулярных соединений — метаболитов крови и других биологических образцов приобретают всё большее значение в современной токсикологии и фармакологии. Исследование метаболических профилей вносит значительный вклад в развитие лабораторно-клинической диагностики в фармакологии и токсикологии. Например, исследования маркеров липидного обмена (ЖК) — это одно из ключевых направлений в ранней диагностике сердечно-сосудистых рисков, метаболического синдрома, ранних стадий развития различных патологий [1]. Ранее был разработан двухстадийный метод определения свободных и этерифицированных жирных кислот (СЖК и ЭЖК)
в плазме крови [2, 3]. Однако практика показала, что первоначальный состав определяемых соединений в образце подвержен изменениям в результате хранения образцов плазмы [4, 5].
К условиям хранения можно отнести следующие параметры: продолжительность хранения, температура и количество циклов замораживания и размораживания (далее — циклы з/р). В простейшем случае, до того как образец попадёт в химико-аналитическую лабораторию, он будет заморожен до —20°С (реже до —70°С) в течение 24 ч, и, соответственно, пройдет один цикл з/р. Большой объём отобранных образцов приводит к большей продолжительности хранения, а создание лабораторного «банка» образцов и применение различных методов анализа приведёт к увеличению количества циклов з/р. Исследования влияния таких циклов на концентрации эндогенных соединений в образце стали особенно актуальными в связи с формированием крупных «банков» биологических образцов [6, p. 789-803], которых в настоящее время существует значительное количество [7].
Подробно влияние условий хранения биообразцов на достоверность результатов метаболического профилирования методами ГХ-МС рассмотрено в различных работах, см., например, [8, 9]. Авторами [10] показано, что при соблюдении строгих требований к условиям хранения и транспортировки биологических образцов вариации результатов анализа, обусловленные хранением, значительно меньше, даже чем индивидуальные вариации метаболических профилей. Оценка влияния условий хранения на результаты определения жирных кислот в биологических образцах произведена в нескольких работах. Например, известно увеличение концентраций СЖК при хранении на 32% [11], а также уменьшение концентраций триглицеридов на 19% (основной источник ЭЖК). В работе [12], наоборот, выявлено увеличение концентраций ЭЖК и некоторое уменьшение концентраций СЖК в процессе хранения (1 цикл з/р и хранение при комнатной температуре или при —40°С в течение 6 мес). В некоторых работах изменений в составе ЖК вообще не выявлено (см., например, [13]). Тем не менее в работе [13] отмечается, что выявленные изменения затрагивают только минорные ЖК и не затрагивают основные компоненты жирнокислотного состава образцов. Однако именно концентрации многих минорных ЖК являются важными диагностическими маркерами активности ферментов, например стеарил-КоА-, Д6- и ДБ-десатураз, а соотношение ю-6/ю-3 полиненасыщенных жирных кислот в крови часто связывают с риском возникновения сердечно-сосудистых заболеваний, инсулинорезистентностью и пр.
Таким образом, наблюдается ряд противоречий в результатах оценки влияния условий хранения биологических образцов, что вынуждает провести собственное исследование. Целью работы являлось установление влияния условий хранения на результаты хроматомасс-спектрометрического определения свободных и этерифицированных жирных кислот в плазме крови.
Экспериментальная часть. Определение СЖК и ЭЖК проводили двухстадий-ным методом, разработанным в НИИ ГПЭЧ [1, 2]. Первая стадия — переэтерификация этерифицированных ЖК раствором метоксида калия в метаноле, вторая — экстрактивное алкилирование СЖК и измерение концентраций метиловых эфиров методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием. В работе использовали газовый хроматограф Agilent 7890A с тандемным масс-селективным детектором Agilent 7000 и капиллярной колонкой HP-5MS, 30 м х 2Б0 мкм, толщина слоя фазы 0,25 мкм.
Отбор крови у добровольцев проводили из кубитальной вены в пробирки для гематологии Vacuette с ЭДТА в качестве антикоагулянта. Для получения плазмы кровь центрифугировали 15 мин при 4000g. Образцы плазмы были пулированы и затем аликво-
тированы. Аликвоты объёмом 500 мкл хранили в пробирках типа Eppendorf вместимостью 2 мл.
Чтобы предотвратить возможные реакции окисления в образцах, в серию аликвот перед хранением была добавлена «ловушка радикалов» — 2,6-ди-трет-бутил-4-метил-фенол в концентрации 100 мкг на образец.
Для определения влияния основного белка плазмы крови был проведён модельный эксперимент: приготовлен раствор HSA — человеческого сывороточного альбумина, свободного от жирных кислот (Sigma-Aldrich), концентрацией 40 мг/л, соответствующий естественной биогенной концентрации HSA в плазме крови человека. Затем внесены олеиновая и пальмитиновая кислоты в концентрации 20 мкг/мл. Образец разделён на три аликвоты, первая проанализирована незамедлительно, вторую и третью хранили при —20°С в течение 14 и 28 дней соответственно.
Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью прикладного пакета программ STATISTICA (версия 6.0, StatSoft Inc, США) и Microsoft Excel 2007 с дополнением Multibase 2015. В случае трёх и более выборок различия анализируемых показателей оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим попарным межгрупповым сравнением величин по критерию Фишера. Для выявления взаимосвязей между изучаемыми показателями вычисляли коэффициент корреляции Пирсона.
Отметим, что все образцы были заморожены и разморожены однократно, за исключением исходного.
Результаты и их обсуждение. Для каждого аналита вычислен матричный фактор, равный отношению площади пика аналита в присутствии матрицы к площади пика в отсутствие матрицы (водного раствора аналита). Коэффициенты вариации IS-норма-лизованного матричного фактора не превышают 15%. Матричный фактор составляет от 0,6 до 0,9 для различных кислот (в среднем 0,72±0,08). Зависимости от числа атомов углерода в молекуле не выявлено.
В табл. 1 приведены результаты оценки стабильности СЖК, а в табл. 2 — ЭЖК в плазме крови при различных условиях хранения образцов. Изменения определяемых концентраций ЭЖК и СЖК представлены в процентах от исходных значений. В результате можно рекомендовать следующие надлежащие условия хранения: температура —20°С, продолжительность — не более двух недель и не более одного замораживания образцов. При соблюдении этих условий в образце происходят минимальные изменения. Единственным выявленным отклонением является уменьшение концентрации свободной докозагексаеновой кислоты на 19% через 2 недели при —20°С. Увеличение количества циклов з/р приводит к увеличению концентраций СЖК и уменьшению концентраций ЭЖК, причем третий цикл значительно усугубляет изменения.
Хранение образцов при 4°С в течение двух дней не влияет на концентрации СЖК, тем не менее при такой температуре ЭЖК нестабильны даже в течение 24 ч в образце. Интересно отметить, что понижение температуры хранения до —70°С значительным образом сказалось на концентрациях определяемых соединений.
Модельный эксперимент с использованием раствора альбумина с внесением пальмитиновой и олеиновой кислот показал, что альбумин не влияет на концентрацию пальмитиновой кислоты, концентрация олеиновой при этом уменьшается (рис. 1).
Внесение антиоксиданта в образцы плазмы крови перед хранением (см. эксп. часть) не позволило увеличить продолжительность хранения или количество циклов з/р.
Стабильность жирных кислот в плазме крови при хранении необходимо оценить методами факторного анализа. Такая необходимость обусловлена тем, что факторный
Результаты оценки стабильности свободных жирных кислот в плазме крови при различных условиях хранения образцов
Изменения концентраций СЖК в образце, % от исходных значений
Определяемые жирные при t хранения +4°С при £ хранения — 20°С, при £ хранения — 20°С при £ хранения — 70°С
кислоты в пулированном без замораживания, с повторным без повторного без повторного
образце плазмы крови после дней замораживанием, замораживания, замораживания,
после циклов после дней после дней
1 2 3 1 2 3 14 28 14 28
Додекановая -21 * -38 -53 -76 -30 -62 -64
Миристиновая -21 * -29 * -33 * * -16
Пальмитолеиновая -30 -26 -27 -19 -27 +20 * +38
Пальмитиновая -28 -28 -32 * -22 * * +21
Линолевая -31 -32 -23 +22 +56 +55 * +91
Олеиновая -23 -22 -15 * +34 +36 * +47
Линоленовая -17 -37 -31 -42 -27 ** +31 +27 +60
Элаидиновая * -29 -25 * -16 * * +43
Стеариновая -22 -26 -21 -20 -26 * * +20
Арахидоновая -18 -16 -21 * -18 * * +16
Эйкозапентаеновая * * * * * +20 * +54
Эйкозатриеновая -17 -19 * * +22 * * *
Эйкозадиеновая * * * -20 -24 -18 -17 -18
Докозагексаеновая * +18 +27 * -46 -68 -32 -66
Результаты оценки стабильности этерифицированных жирных кислот в плазме крови при различных условиях хранения образцов
Изменения концентраций ЭЖК в образце, % от исходных значений
Определяемые жирные кислоты в пулированном образце плазмы крови при Ь хранения +4°С без замораживания, после дней при t хранения — 20°С, с повторным замораживанием, после циклов при Ь хранения — 20°С без повторного замораживания, после дней при t хранения — 70°С без повторного замораживания, после дней
1 2 3 1 2 3 14 28 14 28
Додекановая * * * -36 * * * *
Миристиновая -20 * * -41 * * * *
Пальмитолеиновая * * +18 +50 * * * +24
Пальмитиновая +16 * +16 +28 * * * *
Линолевая +24 * — +76 * * +19 +57
Олеиновая +23 * — +46 * * * +24
Линоленовая — * — +22 * * * *
Элаидиновая +19 * — +39 * +27 +19 +41
Стеариновая * * — +17 * * * *
Арахидоновая * * +24 +76 * -17 -17 -60
Эйкозапентаеновая * 17 +31 +76 * -18 * -34
Эйкозатриеновая * * +22 +54 * * * *
Эйкозадиеновая -16 * * +35 * * * +30
Докозагексаеновая * * +26 +52 -19 -42 -17 -37
20,51
20ц
« 19-
з
1,18,5-
н
я
& 18-
я
о
^ 17,517-
□ олеиновая к-та
□ пальмитиновая к-та
Исходное значение
24 ч при + 4°С 24 ч при - 20°С
Рис. 1. Изменение концентраций пальмитиновой и олеиновой кислот в растворе альбумина при хранении
анализ является основным методом исследования данных в метаболомных исследованиях, следовательно, возникающие отклонения в исходном составе ЖК после предварительного хранения могут привести к ложным выводам.
Рассмотрим группы образцов: «0 циклов», «1 цикл», «2 цикла» и «3 цикла») (рис. 2). PLS-DA анализ полученного массива данных позволяет заключить, что два цикла з/р значимо не отличаются от исходного образца.
Значимость полученных результатов оценивали с помощью так называемого перестановочного теста, реализованного в ПО МиИдЬаБе 2015 (50 перестановок). Основным влиянием на профиль СЖК обладают насыщенные ЖК с низкой концентрацией: ми-ристиновая, додекановая, бегеновая и арахидоновая. На рис. 2, б представлена аналогичная иллюстрация влияния циклов з/р на профили ЭЖК. Установлено, что уже второй цикл з/р образцов вносит достоверные различия в состав ЭЖК. В табл. 3 суммированы основные результаты, полученные в настоящей работе.
1 цикл
4,44
9
О
04 2 цикла
3,348
0 циклов
7,852
3 цикла
3,50
1 цикл
6,59
2
О
Он
в
2 цикла
б
2,834
9 о в
3,63
0 циклов
4,668
3 цикла
РС1(48,3%) РС1(42,9%)
Рис. 2. Графики счетов главных компонент 1 и 2, построенные методом РЬЯ^А, иллюстрирующие сравнение групп образцов: «0 циклов», «1 цикл», «2 цикла» и «3 цикла»: результаты получены при определении СЖК (а) и ЭЖК (б)
Таблица 3
Условия хранения аликвот плазмы крови и результаты их воздействия на первоначальный состав СЖК и ЭЖК в образцах плазмы крови
Описание условий хранения Результат
Замораживание пробы до —20°С, хранение 24 ч и размораживание до +20°С в течение 2 ч при комнатной температуре:
1 цикл Отсутствуют изменения в составе
2 цикл СЖК(Т), ЭЖК(|)
3 цикл СЖК(ТТ), ЭЖКЦ1)
Хранение пробы при +4°С 1-3 дня ЭЖК(|), СЖК стабильны в течение двух дней
Замораживание пробы до —20°С, и размораживание до +20°С в течение 2 ч при комнатной температуре:
хранение 14 дней Свободная докозагексаеновая кислота (|)
хранение 28 дней Значимые изменения различной направленности в составе ЭЖК и СЖК
Замораживание пробы до — 70°С, хранение 14 или 28 дней и размораживание до +20°С в течение 4 ч при комнатной температуре
Добавление в пробу ди-торето-бутилфенола и замораживание пробы до — 20°С, хранение 24 ч и размораживание до +20°С в течение 2 ч при комнатной температуре:
1 цикл Добавление антиоксиданта не повлияло на результаты
2 цикл
3 цикл
Разбавление пробы метанолом (1 к 2), охлаждение —20°С, и нагрев до +20°С в течение 2 ч при комнатной температуре:
хранение 14 дней Значительные изменения в составе ЭЖК и СЖК
хранение 28 дней
Не получивший объяснения факт заключается в том, что понижение температуры хранения образцов до —70°С оказывает негативное влияние на вариацию концентраций СЖК и ЭЖК в образцах плазмы крови. Так, концентрации СЖК изменяются в диапазоне от —17 до +19%, а ЭЖК от —62 до +27%.
Заключение. В результате предложены рекомендации по надлежащему хранению образцов плазмы крови. Образцы сохраняют пригодность для анализа в течение одного цикла замораживания/размораживания и до 14 дней хранения при —20°С. Показано, что СЖК проявляют большую стабильность: так, их определение возможно и после двух циклов замораживания/размораживания и даже после хранения образцов при +4°С в течение двух дней. Использование добавок антиоксиданта в плазму крови перед хранением не позволяет увеличить продолжительность хранения или количество циклов замораживания/размораживания. Понижение температуры образцов до —70°С изменяет первоначальный состав СЖК и ЭЖК.
Литература
1. Jones P. M., Bennett M. J. Clinical applications of 3-hydroxy fatty acid analysis by gas chromatogra-phy-mass spectrometry // Biochim. Biophys. Acta. 2011. Vol. 1811. P. 657—662.
2. Уколов А. И., Орлова Т. И., Савельева Е. И., Радилов А. С. Хромато-масс-спектрометрическое определение свободных жирных кислот в плазме крови и моче с использованием экстрактивного ал-килирования // Журн. аналит. химии. 2015. Т. 70, № 9. С. 968—975.
3. Орлова Т. И., Уколов А. И., Савельева Е. И., Радилов А. С. Определение свободных и этерифи-цированных жирных кислот в плазме крови методом газовой хроматоматографии с масс-селективным детектированием // Аналитика и контроль. 2015. Т. 19, № 2. С. 183—188.
4. Bictasha M., Ebbels T. M., Chan Q. et al. Opening up the "Black Box": Metabolic phenotyping and metabolome-wide association studies in epidemiology //J. Clin. Epid. 2010. Vol. 63, N 9. P. 970—979.
5. TeahanO., Gamble S., Holmes E. et al. Impact of analytical bias in metabonomic studies of human blood serum and plasma // Anal. Chem. 2006. Vol. 78, N 13. P. 4307-4318.
6. Directory of on-going research in cancer epidemiology / Eds R. Sankaranarayanan, J. Wahrendorf, E. Demaret. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer. 1996. 848 p.
7. Multiple Risk Factor Intervention Trial Group. Multiple risk factor intervention trial: risk factor changes and mortality results // J. Am. Med. Assoc. 1982. Vol. 248, N 12. P. 1465-1477.
8. Pasikanti K. K., Ho P. C., Chan E. C. Development and validation of a gas chromatography/mass spectrometry metabonomic platform for the global profiling of urinary metabolites // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008. Vol. 22, N 19. P. 2984-2992.
9. WantE. J., Cravatt B. F., Siuzdak G. The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization // Chembiochem. 2005. Vol. 6. P. 1941-1951.
10. DunnW.B., Broadhurst D., Ellis D.I. et al. A GC-TOF-MS study of the stability of serum and urine metabolomes during the UK Biobank sample collection and preparation protocols // Int. J. Epidemiol. 2008. Vol. 37, N 1. P. 23-30.
11. PaltielL., Ronningen K. S., Meltzer H. M. et al. Evaluation of freeze—thaw cycles on stored plasma in the Biobank of the Norwegian Mother and Child Cohort Study // Cell Preserv. Technol. 2008. Vol. 6, N 3. P. 223-230.
12. YiL., He J., Liang Y. et al. Simultaneously quantitative measurement of comprehensive profiles of esterified and non-esterified fatty acid in plasma of type 2 diabetic patients // Chem. Phys. Lipids. 2007. Vol. 150. P. 204-216.
13. Matthan N. R., Ip B., Resteghini N. et al. Long-term fatty acids stability in human serum cholesteryl ester, triglyceride and phospholipid fractions // J. Lipid Res. 2010. Vol. 51, N 9. P. 2826-2832.
References
1. Jones P. M., Bennett M. J. Clinical applications of 3-hydroxy fatty acid analysis by gas chromato-graphy-mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta., 2011, vol. 1811, pp. 657—662.
2. Ukolov A. I., Orlova T.I., Savel'eva E. I., Radilov A. S. Khromato-mass-spektrometricheskoe opre-delenie svobodnykh zhirnykh kislot v plazme krovi i moche s ispol'zovaniem ekstraktivnogo alkilirovaniia [Chromatographic-mass spectrometric determination of free fatty acids in blood plasma and urine using extractive alkylation]. Rus. J. Analyt. Chem. [Journal of Analytical Chemistry], 2015, vol. 70, no. 9, pp. 968—975. (In Russian)
3. Orlova T. I., Ukolov A. I., Savel'eva E. I., Radilov A.S. Opredelenie svobodnykh i eterifitsirovannykh zhirnykh kislot v plazme krovi metodom gazovoi khromatomatografii s mass-selektivnym detektirovaniem [GC-MS quantification of free and esterified fatty acids in blood plasma]. Analitika i kontrol' [Analitics and Control], 2015, vol. 19, no. 2, pp. 183-188.
4. Bictasha M., Ebbels T. M., Chan Q. et al. Opening up the "Black Box": Metabolic phenotyping and metabolome-wide association studies in epidemiology. J. Clin. Epid., 2010, vol. 63, no. 9, pp. 970-979.
5. Teahan O., Gamble S., Holmes E. et al. Impact of analytical bias in metabonomic studies of human blood serum and plasma. Anal. Chem., 2006, vol. 78, no. 13, pp. 4307-4318.
6. Directory of on-going research in cancer epidemiology. Eds R. Sankaranarayanan, J. Wahrendorf, E. Demaret. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer. 1996, pp. 789-803.
7. Multiple Risk Factor Intervention Trial Group Multiple risk factor intervention trial: risk factor changes and mortality results. J. Am.. Med. Assoc., 1982, vol. 248, no. 12, pp. 1465-1477.
8. Pasikanti K. K., Ho P. C., Chan E. C. Development and validation of a gas chromatography/mass spectrometry metabonomic platform for the global profiling of urinary metabolites. Rapid Commun. Mass Spectrom., 2008, vol. 22, no. 19, pp. 2984-2992.
9. Want E. J., Cravatt B. F., Siuzdak G. The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization. Chembiochem., 2005, vol. 6, pp. 1941-1951.
10. Dunn W. B., Broadhurst D., Ellis D. I. et al. A GC-TOF-MS study of the stability of serum and urine metabolomes during the UK Biobank sample collection and preparation protocols. Int. J. Epidemiol., 2008, vol. 37, no. 1, pp. 23-30.
11. Paltiel L., Ronningen K. S., Meltzer H. M. et al. Evaluation of freeze—thaw cycles on stored plasma in the Biobank of the Norwegian Mother and Child Cohort Study. Cell Preserv. Technol., 2008, vol. 6, no. 3, pp. 223-230.
12. Yi L., He J., Liang Y. et al. Simultaneously quantitative measurement of comprehensive profiles of esterified and non-esterified fatty acid in plasma of type 2 diabetic patients. Chem. Phys. Lipids., 2007, vol. 150, pp. 204-216.
13. Matthan N. R., Ip B., Resteghini N. et al. Long-term fatty acids stability in human serum cholesteryl ester, triglyceride and phospholipid fractions. J. Lipid Res., 2010, vol. 51, no. 9, pp. 2826-2832.
Стaтья пoступилa в pедaкцию 29 июня 2015 г.
Контактная информация
Уколов Антон Игоревич — кандидат химических наук; e-mail: [email protected]
Орлова Тотпьяна Игоревна — научный сотрудник; e-mail: [email protected]
Радилов Андрей Станиславович — доктор медицинских наук, профессор; e-mail: [email protected]
Ukolov Anton Igorevich — Ph.D.; e-mail: [email protected]
Orlova Tatiyana Igorevna — researcher; e-mail: [email protected]
Radilov Andrey Stanislavovich — Doctor of Medicine, Professor; e-mail: [email protected]
