CC BY
48
MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
Уколов А.И., Радилов А.С.
МЕТОДОЛОГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОМАРКЁРОВ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХРОМАТОМАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
ФГУП «НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России, 188663,Санкт-Петербург
В статье рассмотрены результаты разработки и применения хроматомасс-спектрометриче-ской методологии обнаружения и идентификации биомаркёров экспозиции и биомаркёров эффекта органических соединений. Результаты внедрения методологии получены при обосновании предельно допустимых концентраций смесей алифатических углеводородов (УВ) С-С и С—С0 (ГН 2.1.6.1338-03 с изм. от 30.08.16), гидроксиламина и 1,4-дихлоргексафторбутена-2 (ДХГФ). В результате оценки идентифицированных биомаркёров показано, что биомаркёры ДХГФ, гидроксиламина и смесей углеводородов с числом атомов углерода от 1 до 10 достаточно чувствительны для мониторинга биологически недействующих уровней и пригодны для использования в практике экспериментальной токсикологии и для целей гигиенического регламентирования.
Ключевые слова: методология; биомаркёр; ГХ-МС; ВЭЖХ-МС; кровь; моча.
Для цитирования: Уколов А.И., Радилов А.С. Методология определения биомаркёров органических соединений с использованием хроматомасс-спектрометрии. Медицина экстремальных ситуаций. 2018; 20(3): 439-450.
Для корреспонденции: Уколов Антон Игоревич, канд. хим. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории аналитической токсикологии ФГУП «НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России, 188663,Санкт-Петербург. Е-mail: AntonUkolov@gmail.com
Ukolov A.I., Radilov A.S.
METHODOLOGY FOR DETERMINATION OF BIOMARKERS OF ORGANIC COMPOUNDS USING GAS CHROMATOGRAPHY/MASS SPECTROMETRY
Research Institute of Human Hygiene, Occupational Pathology, and Ecology, Saint Petersburg, 188663, Russian Federation
The article discusses the results of the development and application of the chromatography-mass spectrometry methodology for the detection and identification of biomarkers of exposure and biomarkers of the effect of organic compounds. The results of the implementation of the methodology were obtained in the substantiation of the maximum permissible concentrations of mixtures of aliphatic hydrocarbons (AHC) C1-C5 and C6-C10 (Hygienic regulations (HR) 2.1.6.1338-03 with a change of30.08.16), hy-droxylamine and 1,4-dichlorohexafluorobutene-2 (DHGF). An assessment of the identified biomarkers showed biomarkers of DHGP, hydroxylamine and mixtures of hydrocarbons with 1 to 10 carbon atoms to be both enough sensitive to monitor biologically inactive levels and suitable for the application in the practice of experimental toxicology and for the purposes of the hygienic regulation. Keywords: methodology; biomarker; GC-MS; HPLC-MS; blood; urine.
For citation: Ukolov A.I., Radilov A.S. Methodology for determination of biomarkers of organic compounds using gas chromatography/mass spectrometry. Meditsina ekstremal'nykh situatsiy. Meditsina ekstremal'nykh situatsiy (Medicine of Extreme Situations) 2018; 20(3): 439-450. (In Russ.).
For correspondence: Anton I. Ukolov, MD, Ph.D., leading researcher of the laboratory of the analytical toxicology of the Research Institute of Human Hygiene, Occupational Pathology, and Ecology of the Federal Medical And Biological Agency of Russia, St. Petersburg, 188663, Russian Federation. Research Institute of Human Hygiene, Occupational Pathology, and Ecology of the Federal Medical And Biological Agency of Russia, St. Petersburg, 188663, Russian Federation. E-mail: babakov@rihophe.ru
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest Acknowledgments. The study had no sponsorship. Received 01 June 2018 Accepted 19 September 2018
1 Здесь и далее приведено число атомов углерода в молекуле углеводорода .
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
На предприятиях уничтожения химического оружия, переработки нефти, ракетно-космической отрасли и агрохимии, а также в регионах их размещения в РФ работает и проживает более миллиона человек. В районах расположения объектов химической промышленности вопросы безопасного обращения ряда органических соединений официально не решены до настоящего времени. Технологические условия функционирования объектов промышленности допускают возможность попадания в окружающую среду вредных химических веществ.
Учитывая актуальность исследования влияния токсикантов в концентрациях, релевантных их содержанию в окружающей среде [1], современные методы мониторинга должны обеспечивать достаточную чувствительность для определения даже нетоксических концентраций химических веществ [2]. Определение биомаркёров низкоуровневого воздействия фосфор-органических соединений, в частности отравляющего вещества RVX2, позволяет решать токси-колого-гигиенические, судебно-медицинские и криминалистические задачи, проводить мониторинг и оценку возможного влияния объектов уничтожения химического оружия на персонал и население зоны защитных мероприятий. Идентификация чувствительных биомаркёров алифатических УВ, распространённых органических загрязнителей атмосферного воздуха, необходима для мониторинга персонала и населения, проживающего вблизи нефтеперерабатывающих заводов. Для мониторинга не только профессионально обусловленного воздействия фосфорорганических пестицидов (ФОП), но и низкоуровневого хронического воздействия пестицидов, присутствующих в окружающей среде, в том числе опосредованного через продукты питания [3], необходимы высокочувствительные методики анализа биологических образцов, которые отсутствовали в Российской Федерации.
На сегодняшний день в практике химико-токсикологических лабораторий отсутствуют методы химического и биологического мониторинга, основанные на новых подходах с
2 О-изобутил^-(2-диэтиламиноэтил)метилтиофосфонат -фосфорорганическое отравляющее вещество, аналог VХ.
использованием метаболического профилирования. В то же время, внедрение методологии, сочетающей методы определения ксенобиотиков и методы метаболического профилирования, позволит значительно повысить информативность мониторинга, обеспечить надёжность диагностики, получить дополнительные сведения о тяжести последствий и патогенезе отравления, повысить эффективность мониторинга хронического воздействия негативных химических факторов на персонал и население, а также получить новые знания о механизмах действия неизученных соединений. Совместный учёт биомаркёров экспозиции и эффекта позволит вплотную подойти к обоснованию биологических ПДК. Новые биомаркёры могут существенно дополнить результаты «классических» токсикологических исследований химических соединений с ранее неизученным токсическим действием и метаболизмом. К таким малоизученным соединениям относится гидроксиламин и 1,4-дихлор-1,1,2,3,4,4-гексафторбутен-2 (хладон КЬ316, далее - ДХГФ).
Материал и методы
В работе использован метод систематического токсиколого-аналитического скрининга, который подробно рассмотрен ранее [4, 5]. Методики количественного определения промышленных загрязнителей и токсичных органических соединений в биопробах включают:
- методику определения 16 летучих промышленных загрязнителей (аллилхлорид, акрилонитрил, бутилхлорид, дисульфид углерода, диэтиловый эфир, гексахлорэтан, мета-крилонитрил, метилакрилат, метилметакрилат, нитробензол, пентахлорэтан, тетрагидрофу-ран, транс-1,4-дихлор-2-бутен, хлорацетони-трил, этилметакрилат, 2-нитропропан) в цельной крови и моче в диапазоне концентраций 1-20 нг/мл. Методика аттестована: свидетельство № 222.0319/01.00258/2013;
- методику определения фосфорорганиче-ских пестицидов в цельной крови и моче на уровне 1 нг/мл методом газовой хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием. Методика аттестована: свидетельство № 222.0320/01.00258/2013;
MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION
- методику определения ДХГФ в плазме крови и моче на уровне 5 нг/мл методом ГХ-МС;
- методику определения гидроксиламина (ГА) в плазме крови и моче с пределом обнаружения 30 нг/мл при использовании метода ГХ-МС и 0,1 нг/мл при использовании метода ГХ-МС/МС [6].
Методика метаболического профилирования биологических образцов с использованием сочетания ГХ-МС низкого и ВЭЖХ-МС высокого разрешения приведена в [7], методики определения свободных и этерифицированных жирных кислот в плазме крови и гомогенатах органов приведены в [8-10].
Результаты и обсуждение
Инструментальная часть предлагаемой методологии является существенным расширением «классического» токсиколого-аналитического скрининга за счёт объединения в рамках одной методологии методов выявления биомаркёров экспозиции в токсиколого-аналитическом скрининге, пакета методик количественного анализа, определения токсикокинетических параметров биомаркёров, а также методов выявления биомаркёров эффекта с помощью метаболического профилирования.
Обнаружение и идентификация лекарственных и наркотических веществ в образцах крови и мочи пациентов с различными типами отравлений
Особенностями нового подхода определения различных химических соединений в биосубстратах является использование твёрдофазной микроэкстракции для определения летучих соединений в паровой фазе, сочетание пяти дери-ватизирующих агентов - МСТФА, СН31, ТФА, МТБСТФА и уксусного ангидрида, экстракционное вымораживание при различных значениях рН, а также автоматическая обработка масс-хроматограмм. Минимизировать вероятность ложноотрицательных ответов предложено с помощью настройки автоматической интерпретации хроматомасс-спектрометрических данных, предусматривающей получение условно лож-ноположительных ответов в каждом рапорте с их последующей экспертной проверкой. Использование баз данных газохроматографиче-ских индексов удерживания позволяет мини-
мизировать вероятность ложноположительных ответов [11, 12].
Примеры, показывающие необходимость включения стадии парофазного анализа в скрининг, получены при апробации метода определения токсичных соединений в крови и моче пациентов отдела клинической токсикологии НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе [5]. Из сравнения результатов опроса пациентов и результатов скрининга следует, что данные химико-токсикологического анализа, проведённого методом ГХ-МС, существенно дополняют и корректируют априорные сведения о причинах отравления.
Использование нескольких дериватизиру-ющих агентов, наряду с анализом экстрактов без дериватизации, позволяет значительно повысить эффективность обращения к базам данных в токсиколого-аналитическом скрининге [4]. Поскольку искомое вещество заранее неизвестно, невозможно предсказать, какой способ дериватизации будет оптимален при его определении, а также в виде какого производного он окажется представленным в доступных базах данных, поэтому целесообразно на стадии подготовки проб аликвотировать экстракты и обрабатывать их разными дериватизирующими агентами. При этом вероятность открытия и последующего подтверждения искомого ксенобиотика возрастает многократно.
Дополнительная апробация разработанных методов систематического токсиколого-анали-тического скрининга была проведена при выполнении межлабораторного сличительного теста: в тестовой пробе, приготовленной организаторами эксперимента путём пулирования мочи нескольких пациентов, были обнаружены пропофол, диазепам, хлорпромазин и два его метаболита, галоперидол и его метаболит, пи-ровалерон и т. н. «АВ-СНМШАСА» - синтетический каннабиноид имидазольного ряда. Проверка полученных результатов автоматической интерпретации масс-спектров была выполнена путём сравнения величин экспериментально зарегистрированных газохроматографических линейных индексов удерживания с доступными справочными значениями. Подтверждение полученных результатов было выполнено путём определения точных масс аналитов методом
441
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Рис. 1. Схема деградации различных аддуктов ДХГФ с глутатионом. Показаны обнаруженные метаболиты.
ВЭЖХ-МС высокого разрешения, отклонения составили не более 1 ррт. Несмотря на то, что анализ был выполнен в отсутствие образцов сравнения определяемых веществ, все тестовые вещества были идентифицированы верно и ни одного ложноположительного результата получено не было.
Таким образом, внедрение нового метода систематического токсиколого-аналитического скрининга в практику клинической токсикологии позволяет успешно выполнять обнаружение и идентификацию значительного количества разнообразных ксенобиотиков в крови и моче.
Установление механизмов действия и особенностей метаболизма ксенобиотиков при экспериментальном моделировании интоксикаций
Метаболическое профилирование позволяет выявлять ранее неизвестные механизмы токсического действия опасных химических соединений, а главное, предлагать способы высокочувствительной диагностики отравлений [13]. При использовании предложенной методологии удалось определить метаболизм неизученного ранее хладона RL 316 (рис. 1). Для выявления его метаболитов использовали сочетание ГХ-МС паровой фазы, ГХ-МС экстрактов и ВЭЖХ-МС высокого разрешения. Всего в результате исследований выявлено и идентифицировано 15 различных ранее неизвестных метаболитов. Установлено, что основным путём превращений ДХГФ в организме является образование аддуктов с глутатионом (I), и их дальнейшая деградация до цистеиновых аддуктов (П-У), аце-тилцистеиновых аддуктов (У1-1Х). Также среди
продуктов распада аддуктов, выявлены метил-сульфид (X), метилсульфоксид и тиокетон -1,4-дихлор-1,1,3,4,4-бутантион-2 (XI), который оказался наиболее чувствительным маркёром, обнаруженным в крови при экспонировании крыс 18,8 мг/м3 ДХГФ в воздухе.
Экспозиция крыс высокими концентрациями ДХГФ (600 мг/м3) оказывает влияние на биосинтез изолейцина, цикл трикарбоновых кислот, метаболизм пировиноградной кислоты, гликолиз, а также метаболизм инозитолфосфа-та. В то же время, 30-дневное воздействие более низких концентраций (84,4 мг/м3) приводит к меньшим изменениям в метаболоме плазмы крови: наряду со значительным уменьшением концентраций 3-фосфоглицерата в плазме крови, выявлено влияние ДХГФ на метаболиты пути превращений гулоновая кислота ^ глюкуро-новая кислота ^ мио-инозитол.
Отношение концентраций гулоновой кислоты и инозитолфосфата (рис. 2) оказывается достаточно чувствительным биомаркёром эффекта в первые часы после экспонирования концентрациями ДХГФ: 600,0; 84,4 и 18,8 мг/м3.
Наряду с определением влияния новых промышленных хладагентов на эндогенный метаболизм, предложенная методология была использована для установления путей превращений гидроксиламина. Гидроксиламин является реак-ционноспособным соединением, вступающим в различные реакции, среди которых основными являются окислительно-восстановительные, а также реакции образования оксимов (изонитро-зосоединений) с альдегидами и кетонами, которые широко представлены в крови и моче.
MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION
S 5 P
CD ^ О .
U" s 0 ^ £
§ ' s 5 -
O O s
ш ш t ÉÛ
s о ^ о
1 1 n &
CD O S *
i £ 1 ш
1,8 1,6 1,4 1,2 1
0,8 0,6 0,4 0,2 0
1,08
0,8
0,55
1,05
0,43
à
0,27
600 0 ч
600 24 ч
84,4 ± 6,5 18,8 ± 0,6 4,7 ± 0,2 Концентрация ДХГФ, мг/м3
Контроль
Рис. 2. Отношение концентраций гулоновой кислоты и инозитолфосфата в крови крыс, экспонированных различными концентрациями ДХГФ. Здесь и на рис. 4, 5: * — статистически значимые отличия (р < 0,05 по сравнению с контрольной группой).
В соответствии с перечнем выявленных in vitro возможных метаболитов был произведён их поиск в образцах крови и мочи, отобранных у крыс после в/ж введения ^DL50 раствора ГА. Структуры обнаруженных метаболитов приведены на рис. 3 приблизительная количественная оценка дана в табл. 1.
В моче, в отличие от крови, выявлены ок-симы моносахаридов (соединения V-VII). Высокие концентрации оксимов моносахаридов в моче и низкие (ниже предела обнаружения) в плазме можно объяснить активной экскреторной и/или метаболической функцией почек при трансформации и выведении ГА. В эксперименте in vitro было установлено, что оксимы V-VII могут образовываться при взаимодействии ГА с сахарами крови. В моче приблизительная суммарная концентрация этих оксимов составляет более 0,5 мг/мл. Интересно заметить, что и in vitro, и in vivo соответствующие аддукты образуются только альдозами, а не кетозами.
Для выявления наиболее чувствительного маркёра экспозиции ГА был произведен скрининг аддуктов ГА в крови и моче крыс, получавших раствор ГА с питьевой водой в течение 30 дней. Наиболее чувствительным биомаркёром экспозиции ГА оказалась его неметаболи-зированная форма и аддукт с пировиноградной кислотой - пируватоксим (II), обнаруженный в моче крыс, получавших 22 мкг/кг ГА в питьевой воде (минимальная доза). Моча явилась наиболее перспективной матрицей для мониторинга низкоуровневого воздействия. Так, в крови
оксим глицеральдегида (I) можно обнаружить только у группы крыс, получавших высокую дозу ГА. Результаты свидетельствуют о том, что ГА, несмотря на высокую реакционную способность, тем не менее, обнаруживается в крови и моче. Возможно, наличие ГА в крови даже при низкоуровневом воздействии объясняется тем, что, при утилизации повреждённых эритроцитов происходит высвобождение ГА, и обратное поступление его в кровяное русло.
Учитывая тот факт, что все обнаруженные метаболиты ГА в крови и мочи крыс были впоследствии выявлены в образцах биологических жидкостей после внесения ГА in vitro, можно предположить, что образование этих оксимов не катализируется ферментами. Это позволяет не вносить изменений в список биомаркёров экспозиции при экстраполяции на человека.
Наряду с биомаркёрами экспозиции был проведён поиск биомаркёров эффекта ГА. В результате показано, что в/ж введение 101,6 мг/кг ГА вызывает снижение концентрации пирувата
IV V-VII
Рис. 3. Структурные формулы метаболитов гидроксиламина в крови и моче.
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Таблица 1
Результаты выявления биомаркёров экспозиции гидроксиламина после внутрижелудочного введения в дозе 101,6 мг/кг DL5o)
Концентрация*, нг/мл
Соединение плазма крови моча
2 ч 24 ч 24 ч
Гидроксиламин 4321±1080 421±131 29 400 ± 7056
I - оксим глицеральдегида 476 ± 286 Следы 35 820 ± 19 343
II - оксим пировиноградной кислоты 259±194 266 ± 173 97 982 ± 85 244
III - оксим N-формилглицина 106 ± 52** 29 ± 8 -
IV - оксим глиоксалевой кислоты 46 ± 26 38 ± 28 -
V-VII оксимы моносахаридов - - > 500000***
Примечание. * - концентрации обнаруженных метаболитов определены относительно внутренних стандартов; ** - указана сумма Е- и 2-изомеров; *** - точное количественное определение затруднительно, суммарное содержание оксимов моносахаридов составляет более 0,5 мг/мл мочи.
в моче в среднем почти в 4 раза. Точная кинетика процесса не была определена, т. к. изменение концентрации зафиксировано в моче, которую собирали в течение 24 ч после отравления. В уровнях лактата в моче не выявлено статистически значимых изменений.
Оценка всех идентифицированных биомаркёров эффекта ГА показала, что наиболее чувствительными биомаркёрами являются концентрации 2-кетокислот в моче. Отношение концентраций 3-метил-2-кетопентановой кислоты и креатинина остаётся сниженным, по сравнению с контрольной группой, даже при низкоуровневом воздействии 2 мг/л раствора ГА в питьевой воде (рис. 4). Снижение концентрации 2-кетокислот возможно связано с оксимирова-нием пирувата, который является предшественником 2-кетокислот в их биосинтезе.
Повышение статистической значимости результатов выявления биомаркёров эффекта, помимо увеличения чувствительности метода, может достигаться путём создания целевых методик профилирования. Измерение профилей свободных и этерифицированных форм жирных кислот (ЖК) является важным инструментом для определения нарушений липидного обмена, а полученные данные позволяют более полно охарактеризовать состояние тканей и органов в период острой интоксикации и в отдалённые сроки после отравления.
Мы проследили динамику тридцати ЖК с длиной цепи от С до С24 в плазме крови при
острой интоксикации крыс КУХ [14]. Было выявлено статистически значимое увеличение суммарных концентраций этерифицированных (на 30%) и свободных форм ЖК (на 81%) в плазме крови через неделю после введения дозы КУХ эквивалентной 2x0,4 DL50. Такое значительное повышение уровней свободных ЖК (СЖК) в крови в поздние сроки после отравления может служить одной из причин развития гипергликемии [15], инсулинорезистентности [16] и метаболического синдрома [17].
Использование разработанного метода определения жирнокислотного состава органов и тканей лабораторных животных позволило получить новые данные о воздействии алифатических УВ с длиной цепи от 6 до 10 атомов на состав липидов головного мозга и печени лабораторных крыс. В ходе экспериментального моделирования интоксикации смесью алифатических УВ С6-С , применение метаболического профилирования биологических образцов впервые позволило выявить ранее неизвестные механизмы воздействия алифатических УВ на головной мозг крыс. Показано, что хроническое ингаляционное воздействие алифатических УВ С6-С10 в концентрации 160 мг/м3 приводит к значительному повышению концентрации лизофосфолипидов, в основном лизофосфати-дилхолинов, в экстракте из головного мозга и плазме крови. Повышение, в основном, обусловлено значительным возрастанием концентраций одного лизофосфатидилэтаноламина:
MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION
s о JO
as
I Ь
CD 1 = §
о 2
S *
~ CD CD
M 0 È
i- *
_ CQ _û
H О
q
о
: S *
0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
449 мг/кг в/ж (/ LDj
50 мг/л 10 мг/л 2 мг/л в воде в воде в воде
Концентрации (дозы) водно-метанольного раствора нитрата гидроксиламина
Контроль
Рис. 4. Отношение концентраций 3-метил-2-кетопентановой кислоты и креатинина в моче крыс, экспонированных различными дозами водно-метанольного раствора нитрата гидроксиламина.
ЛФЭ (20:0)3 и четырёх лизофосфатидилхо-линов: ЛФХ (18:0), ЛФХ (18:1), ЛФХ (18:2) и ЛФХ (20:5).
Обнаруженные нами лизофосфатидилхоли-ны представляют собой продукт частичного гидролиза фосфохолина (ФХ). Дальнейший гидролиз приводит к образованию глицерофос-фохолина и глицерол-3-фосфата. Высокое содержание лизофосфолипидов может являться маркёром деструкции клеточных мембран, что является характерной особенностью нейродеге-нерации при острых или хронических неврологических заболеваниях [18], а также различных патологических процессов в мозге [19].
Отношение концентраций ЛФХ (18:1) и ГФХ4 в гомогенате головного мозга увеличивается более чем в 500 раз по сравнению с контрольной группой, в плазме крови, при этом выявлено статистически значимое увеличение данного отношения - в 3,5 раза. По-видимому, гидролиз фосфолипидов приводит к повышению гидрофильности молекул и, как следствие, повышению их концентрации в системном кровотоке. Таким образом, можно предположить, что концентрация ЛФХ в крови отражает воздействие смеси УВ С6-С10 на липидный состав мозга.
3 Общепринятое краткое обозначение липидов: ЛФЭ - лизо-фосфатидилэтаноламины, ЛФХ - лизофосфатидилхолины. В скобках указаны количество атомов углерода в ацильных остатках и количество двойных связей С = С.
4 Глицерофосфохолин (ГФХ)
Мониторинг эффективности антидотной терапии интоксикаций
Установление механизмов действия и метаболизма ксенобиотиков в результате применения разработанной методологии позволяет не только проводить высокочувствительную диагностику отравлений [20], но и оценивать эффективность антидотной терапии.
Так, определение профилей СЖК при интоксикации дозами RVX, эквивалентными 2x0,4 DL50, как было отмечено ранее, позволяет выявить увеличение концентраций данных ЖК в период до 7 дней после отравления. Однако антидотная терапия карбоксимом купирует отставленные последствия отравления, но не купирует эффекты ФОВ в первые часы после отравления (рис. 5). Это позволяет использовать контроль метаболических профилей свободных и этерифицированных ЖК для мониторинга эффективности антидотной терапии при острых отравлениях ФОС.
С использованием концентраций СЖК как биомаркёра интоксикации RVX возможно произвести оценку индекса эффективности (ИЭ) карбоксима в качестве антидота. ИЭ (в %) - это долевая разница показателей тяжести отравления в контрольной группе и группах животных, получавших антидот. ИЭ определяют по формуле:
ИЭ = (И - И)/И х100,
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Рис. 5. Изменение суммарного содержания СЖК в течение 7 дней при введении 2*0,4 DL50RVX (а) без терапии; введение антидота карбоксима (б).
где Ик и Ио - средние значения тех или иных показателей в контрольной и опытной группах соответственно.
Несмотря на то, что терапия отравлений RVX карбоксимом позволяет нормализовать концентрации СЖК в плазме крови, такая антидотная терапия не оказывает влияния на повышенное содержание свободных полиненасыщенных ЖК. На рис. 6 приведён график, иллюстрирующий изменения отношений концентраций ненасыщенных и насыщенных СЖК после введения 2*0,4 DL5o RVX.
ИЭ по показателю концентрации СЖК через 3 ч после введения RVX в дозе 2*0,4 DL50 составляет 37%. При этом терапия карбоксимом не влияет на увеличение индекса - доля ненасыщенных кислот среди СЖК остаётся выше в течение 7 дней. Таким образом, отношения концентраций ненасыщенных и насыщенных СЖК являются чувствительным биомаркёром эффекта RVX даже в условиях антидотной терапии.
Определение токсикокинетических параметров органических соединений и реконструирование абсорбированной дозы
Одним из ключевых элементов предлагаемой методологии определения биомаркёров органических соединений является определение их токсикокинетических параметров. Установление зависимости от времени концентрации биомаркёра экспозиции токсичного химического соединения позволяет провести приблизительную оценку абсорбированной дозы ксенобиотика.
Вывод о количестве абсорбированного химического соединения дозы на основании концентрации его биомаркёра в крови возможно сделать при условии линейной зависимости площади под токсикокинетической кривой (АиС) от дозы, то есть в диапазоне, при котором АиС = f (доза) - линейная функция.
Нами опробована возможность приблизительной оценки абсорбированной дозы ФОП на основании сравнения значений АиС, вычисленных в различные моменты времени, для известной дозы и для искомой. В качестве исходных данных использованы: вид кинетического уравнения, токсикокинетические параметры, время, прошедшее с момента интоксикации до отбора пробы и концентрация ксенобиотика. Далее вычисленные значения АиС были сравнены со значениями для известной дозы ФОП. В результате показано, что отклонение при оценке дозы редко превышает 100% и не зависит от точки отбора пробы крови. Например, при установлении дозы диазинона, вызвавшей отравление, при отборе пробы крови у пострадавшего можно было бы заключить, что реальная доза составляет от 0,06 до 0,17 DL50 при отборе различных точек от 30 мин до 24 ч, а в среднем 0,11 DL50 (в эксперименте на животных - 0,1 DL50).
В результате апробации методологии при экспериментальном моделировании интоксикаций показано, что разработанные методики позволяют выявлять факт ингаляционного поступления УВ С6-С10 в организм на уровне концентраций от 5,2 мг/м3, УВ С]-С5 -от 50,2 мг/м3, ДХГФ - от 18,8 мг/м3. Факт поступления гидроксиламина с питьевой водой -на уровне 0,1 мг/кг, летучих промышленных
MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION
Рис. 6. Изменение содержания ненасыщенных ЖК в общем пуле СЖК после введения 2*0,4 DL RVXбез терапии (а) и с карбоксимом (б).
токсикантов - в течение 6 дней после отравления дозами, эквивалентными от 3*105 DL50 до 9* 103 DL50, фосфорорганических пестицидов -в течение 6 дней после отравления дозами, эквивалентными от 1/50 DL50 до 1/10 DL50 RVX -в течение 7 дней после отравления дозами, эквивалентными от 2*0,4 DL50 даже в условиях антидотной терапии.
Гигиеническое регламентирование органических соединений
Внедрение методологии определения биомаркёров в практику гигиенического регламентирования органических соединений определяет необходимость сравнения чувствительности нового и классического подходов для определения биологически недействующих концентраций.
В настоящее время обсуждается вопрос сравнения чувствительности классических [21] и метаболомных [22] подходов к токсикометрии химических соединений [23], при этом в качестве сравниваемого токсикометрического параметра выбран уровень доз и концентраций, не вызывающий видимых вредных эффектов (No observed Adverse Effect Level, NOAEL). В отечественной практике аналогом NOAEL является максимальная недействующая концентрация (доза). Сравнимая чувствительность методов была достигнута в 75% случаев, в 8% более чувствительным оказалась метаболомика и в 17% - классический подход.
Метаболомный подход к токсикометрии заключался в определении концентрации или дозы, при которой наблюдается «отсутствие постоянного изменения в метаболическом профиле, связанного с вредным эффектом». Поэтому увеличение чувствительности аналитического метода обеспечивает возможность детектирования большего спектра метаболитов и увеличивает шансы обнаружения релевантных биомаркёров или паттернов изменений метаболических профилей и, следовательно, позволяет повысить чувствительность определения показателей вредного действия.
Предлагаемая нами методология позволяет использовать в токсикометрии не только ме-таболомные критерии, описанные выше, но и сочетание биомаркёров экспозиции и биомаркёров эффекта органических соединений. Так, разработанная методология позволила обнаружить биомаркёры экспозиции смесью предельных углеводородов С^С5 - ацетон и н-бутанол, а также установить, что концентрация смеси 50,2 ± 6,1 мг/м3 при хроническом ингаляционном воздействии не вызывает напряжения механизмов биотрансформации и, следовательно, является недействующей [24]. При повышении числа атомов углерода в молекуле алифатического углеводорода возрастает токсичность: более низкая концентрация смеси алифатических УВ С6-С10 31,4 ± 5,6 мг/м3 не приводит к накоплению метаболитов и по этому признаку явля-
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Таблица 2 Сравнение результатов выявления биомаркёров экспозиции и эффекта
Вещество Пороговая концентрация, мг/м3 Наиболее чувствительные биомаркёры (порог обнаружения)
экспозиции эффекта
ДХГФ 18,2 ДХГФ и 1,4-дихлор-1,1,3,4,4-пентафторбутантион-2 в крови (18,2 мг/м3) Гулоновая кислота / инозитолфосфат в крови (18,2 мг/м3)
ГА 0,1 ГА и пируватоксим в моче (0,1 мг/кг) 3-Метил-2-кетопентановая кислота в моче (0,1 мг/кг)
УВ С6-С10 5,2 Кетоны и спирты Сб-С8 в крови и моче (160 мг/м3) Пирофосфат / щавелевая кислота в крови (5,2 мг/м3)
УВ С1-С5 50,2 Ацетон и н-бутанол в крови и моче (250 мг/м3) Глицерол-3-фосфат в крови (50,2 мг/м3)
ется недействующей [25]. Биомаркёрами экспозиции смесью углеводородов с числом атомов от 6 до 10 являются: гексанон-2, гептанон-2, гексанол-1, октанола-1, 2,5-гександион - наиболее токсичный метаболит н-гексана, а также ди-метилпирролнорлейцин - селективный и специфичный биомаркёр хронического воздействия н-гексана на центральную и периферическую нервную системы.
Разработанная методология позволила обнаружить биомаркёр эффекта смеси предельных углеводородов С6-С10 - отношение концентраций пирофосфорной и щавелевой кислот, имеющий достаточную чувствительность для выявления экспозиции смесью углеводородов даже на уровне 5 мг/м3 [7]. Ранее описанное повышение концентраций лизолипидов имеет статистически значимые отклонения только при концентрации смеси углеводородов С6-С10 160 мг/м3 [26]. Определение содержания лизо-липидов может являться маркёром разрушения клеточных мембран и позволяет дополнить результаты токсикометрии.
Наиболее чувствительными биомаркёрами эффекта гидроксиламина являются концентрации 2-кетокислот в моче. Концентрация 3-метил-2-кетопентановой кислоты остаётся сниженной, по сравнению с контрольной группой, даже при низкоуровневом воздействии ГА 22,6 мкг/кг в питьевой воде.
Отношение концентраций гулоновой кислоты и инозитолфосфата является достаточно чувствительным биомаркёром эффекта ДХГФ при ингаляционном воздействии на уровне 18,8 мг/м3.
Результаты сравнения чувствительности обнаруженных биомаркёров экспозиции и биомаркёров эффекта с недействующими концентрациями или дозами приведены в табл. 2.
В результате оценки чувствительности идентифицированных биомаркёров показано, что биомаркёры ДХГФ, гидроксиламина и смесей УВ с числом атомов углерода от 1 до 10 достаточно чувствительны для проведения гигиенического регламентирования и токсиколого-гиги-енического мониторинга воздействия с использованием экспериментальных моделей, а также в качестве тестов экспозиции при оценке влияния указанных веществ на здоровье человека.
Выводы
1. Внедрение в практику гигиенического регламентирования, экспериментальной, клинической и аналитической токсикологии, методологии, сочетающей методы определения ксенобиотиков и метаболического профилирования, позволило повысить надёжность диагностики, получить дополнительные сведения о тяжести последствий и патогенезе отравления, повысить эффективность разрабатываемых методов биомониторинга хронического воздействия химических веществ на персонал и население, а также получить новые знания о механизмах действия малоизученных соединений.
2. Современные методы биомониторинга должны обеспечивать достаточную чувствительность для определения низких или даже субпороговых концентраций химических веществ, поэтому при разработке новых методов необходимо рассматривать все доступные био-
MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION
маркёры и проводить оценку их чувствительности. Сравнение чувствительности биомаркёров возможно только при условии определения в одном исследовании всех доступных биомаркёров: ксенобиотиков и эндогенных соединений, составляющих метаболические профили, а также традиционных показателей токсического воздействия.
3. Ранее эти направления преимущественно развивались в рамках отдельных исследований и разных научных специальностей, в то время как их интегрирование в систему скрининг-диагностики воздействия химических соединений на платформе хроматомасс-спектро-метрии открывает возможности для совокупного учёта характера и последствий воздействия химического фактора.
4. Применение хроматомасс-спектрометри-ческой методологии определения биомаркёров интоксикации органическими соединениями в практике гигиенического регламентирования, экспериментальной, клинической и аналитической токсикологии расширило возможности по установлению причин отравлений и выявления неизвестного химического фактора.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕРАТУРА
(п. п. 1-3., 15-23 см. в REFERENCES)
4. Уколов А.И., Каракашев Г.В., Уколова Е.С., Савельева Е.И., Радилов А.С. Систематический токсиколого-аналитический скрининг биологических образцов методом хроматомасс-спектрометрии. Примеры обнаружения диазепама, трамадола и прозерина. Масс-спектрометрия. 2013; 10(2): 120-9.
5. Уколов А.И., Уколова Е.С., Савельева Е.И., Радилов А.С. Систематический токсиколого-аналитический скрининг биологических образцов методом газовой хромато-масс-спектрометрии. Апробация метода идентификации токсичных органических соединений. Токсикол. вест. 2014; 125(2): 39-45.
6. Уколов А.И., Радилов А.С. Определение гидрокси-ламина в плазме крови и моче методом газовой хро-матомасс-спектрометрии. Вестник СПбГУ. Физика и химия. 2017; 4(62): 337-45.
7. Уколов А.И., Кессених Е.Д., Радилов А.С., Гончаров Н.В. Токсикометаболомика: поиск маркеров хронического воздействия низких концентраций алифатических углеводородов. Ж. эвол. биохимии и физиологии. 2017; 53(1): 23-32.
8. Орлова Т.И., Уколов А.И., Савельева Е.И., Радилов А.С. Определение свободных и этерифицированных жирных кислот в плазме крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием. Аналитика и контроль. 2015; 19(2): 183-8.
9. Уколов А.И., Орлова Т.И., Радилов А.С. Оптимизация условий хранения образцов плазмы крови для определения жирных кислот методом газовой хро-матомасс-спектрометрии. Вест. СПбГУ. Физика и химия. 2015; 2(60): 365-73.
10. Уколов А.И., Орлова Т.И., Савельева Е.И., Радилов А.С. Хроматомасс-спектрометрическое определение свободных жирных кислот в плазме крови и моче с использованием экстрактивного алкилирования. Ж. аналит. химии. 2015; 70(9): 968-75.
11. Зенкевич И.Г., Уколов А.И. Кодирование особенностей структуры гомологических рядов для использования при аддитивной оценке индексов удерживания. Ж. структ. химии. 2010; 51(4): 671-81.
12. Зенкевич И.Г., Уколов А.И., Кушакова А.С., Густыле-ва Л.К. Возможности идентификации изомерных ал-киларенов с использованием аддитивных схем оценки газохроматографических индексов удерживания. Ж. аналит. химии. 2011; 66(12): 1282-89.
13. Гончаров Н.В., Уколов А.И., Орлова Т.И., Мигаловская Е.Д., Войтенко Н.Г. Метаболомика: на пути интеграции биохимии, аналитической химии, информатики. Успехи совр. биол. 2015; 135(1): 3-17.
14. Уколов А.И., Орлова Т.И., Савельева Е.И., Радилов А.С., Гончаров Н.В. Изменения профилей жирных кислот плазмы крови крыс при введении сублетальных количеств фосфорорганических отравляющих веществ. Токсикол. вест. 2015; 132(3): 2-11.
24. Уколов А.И., Мигаловская Е.Д., Радилов А.С. Хро-матомасс-спектрометрическое исследование плазмы крови крыс, подвергавшихся воздействию алифатических углеводородов с числом атомов углерода от 1 до 5. Medline.ru. 2015; 16(2): 329-34.
25. Уколов А.И., Мигаловская Е.Д., Радилов А.С. Хрома-томасс-спектрометрическое исследование биологических образцов крыс подвергавшихся воздействию алифатических углеводородов с числом атомов углерода от 6 до 10. Medline.ru. 2015; 16(2): 335-43.
26. Уколов А.И., Кессених Е.Д., Орлова Т.И., Савельева Е.И., Радилов А.С., Гончаров Н.В. Влияние хронического ингаляционного воздействия малых доз алифатических углеводородов С6-С10 на метаболические профили головного мозга и печени крыс. Токсикол. вестн. 2017; 144(3): 31-41.
REFERENCES
1. Phillips R.D., Bahadori T., Barry B.E. Twenty-first century approaches to toxicity testing, biomonitoring, and risk assessment: perspectives from the global chemical industry. J. Exposure Anal. Environ. Epidemiol. 2009; 19: 536-43.
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
2. Hartung T., McBride M. Food for Thought ... on mapping the human toxome. ALTEX. 2011; 28(2): 83-93.
3. Margariti M.G., Tsakalof A.K., Tsatsakis A.M. Analytical Methods of Biological Monitoring for Exposure to Pesticides: Recent Update. Ther. Drug Monit. 2007; 29(2): 150-63.
4. Ukolov A.I., Karakashev G.V., Ukolova E.S., Savelieva E.I., Radilov A.S. Systematic toxicological screening of biological samples with GC-MS and HPLC-MS. Examples of determination of diazepam, tramadol and prozeri-ne. Mass-spektrometria. 2013; 10(2): 120-9. (in Russian)
5. Ukolov A.I., Ukolova E.S., Savelieva E.I., Radilov A.S. Systematic toxicological screening of biological samples with GC-MS and HPLC-MS. Aprobation of the method of identification of toxic organic compounds. Toksikol. vest. 2014; 125(2): 39-45. (in Russian).
6. Ukolov A.I., Radilov A.S. Quantification of hydroxyl-amine in blood plasma and urine with the GC-MS. Vest-nik SPbGU. 2017; 4(62): 337-45 (in Russian).
7. Ukolov, A.I., Kessenikh, E.D., Radilov, A.S., Goncharov N.V Toxicometabolomics: Identification of markers of chronic exposure to low doses of aliphatic hydrocarbons. J. Evol. Biochim. Phys. 2017; 53(1): 25-36.
8. Orlova T.I., Ukolov A.I., Savelieva E.I., Radilov A.S. GC-MS quantification of free and esterified fatty acids in blood plasma. Analitika i kontrol. 2015; 19(2): 183-8. (in Russian).
9. Ukolov A.I., Orlova T.I., Radilov A.S. Optimization of storage conditions of blood plasma samples for GC-MS quantification of fatty acids. Vest. SPbGU. 2015; 2(60): 365-73. (in Russian).
10. Ukolov A.I., Orlova T.I., Savelieva E.I., Radilov A.S. Chromatographic-Mass Spectrometric Determination of Free Fatty Acids in Blood Plasma and Urine Using Extractive Alkylation. J. of Anal. Chemistry. 2015; 70(9): 1123-30.
11. Zenkevich I.G., Ukolov A.I. Coding of the structural features of organic compounds for the estimation of chro-matographic retention indices with the use of additive schemes. J. of Struct. Chem. 2010; 51(4): 642-51.
12. Zenkevich I.G., Ukolov A.I., Kushakova A.S., Gustyleva L.K. Identification of isomeric alkylarenes with the use of additive relations for the evaluation of gas-chromato-graphic retention indices. J. of Anal. Chemistry. 2011; 66(12): 1165-72.
13. Goncharov N.V., Ukolov A.I., Orlova T.I., Migalovskaya E.D., Voitenko N.G. Metabolomics: On the Way to an Integration of Biochemistry, Analytical Chemistry, and Informatics. Yspekhi sovr. biologii. 2015; 5(4): 296-307.
14. Ukolov A.I., Orlova T.I., Savelieva E.I., Radilov A.S., Goncharov N.V. Administration of sublethal amounts of organophosphorus agents using antidote therapy changing fatty acid profiles of rat plasma. Toksikol. Vest. 2015; 132(3): 2-11 (in Russian).
15. Randle P.J. et al. The glucose fatty acid cycle in obesity and maturity onset diabetes mellitus. Annu. N. Y. Acad. Sci. 1965; 131: 324-33.
16. Roszczenko A., Rogalska J., Moniuszko-Jakoniuk J., Brzoska M.M. The effect of exposure to chlorfenvin-phos on lipid metabolism and apoptotic and necrotic cells death in the brain of rats. Exp. Toxicol. Path. 2013; 65: 531-9.
17. Kashemsant N. Bucurescu S., Fatehi-Hassanabad Z. Impairment of proinsulin processing in b-cells exposed to saturated free fatty acid is dependent on uncoupling pro-tein-2 expression. Can. J. Diab. 2012; 36: 228-36.
18. Klein J. Membrane breakdown in acute and chronic neurodegeneration: focus on choline-containing phospholipids. J. Neural. Transm. 2000; 107: 1027-63.
19. Lindon J.C., Holmes E., Nicholson J.K. Toxicological applications of magnetic resonance. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 2004; 45: 109-43.
20. Looser R., Krotzky A.J., Trethewey R.N. Metabolite profiling with GC-MS and LC-MS - a key tool for contemporary biology. In: Vaidyanathan, S., Harrigan, G.G., Goodacre, R. (Eds.). Metabolome Analyses - Strategies for Systems Biology. New York: Springer. 2005. 103-18.
21. European Centre For Ecotoxicology and toxicology of Chemicals, 2007. ECETOC Workshop Report 11.
22. van Ravenzwaay B. The sensitivity of metabolomics versus classical regulatory toxicology from a NOAEL perspective. Toxicol. Lett. 2014; 227: 20-8.
23. Weckwerth W., Morgenthal K. Metabolomics: from patter recognition to biological interpretation. Drug Discov. Today. 2005; 10: 1551-8.
24. Ukolov A.I., Migalovskaya E.D., Radilov A.S. GC-MS-SPME analysis of blood plasma from rats exposed by aliphatic Cj-C5 hydrocarbons. Medline.ru. 2015; 16(2): 329-34 (in Russian).
25. Ukolov A.I., Migalovskaya E.D., Radilov A.S. GC-MS and HPLC-MS analysis of biological samples from rats exposed by aliphatic C6-C10 hydrocarbons. Medline.ru. 2015; 16(2): 335-43 (in Russian).
26. Ukolov A.I., Kessenikh E.D., Orlova T.I., Radilov A.S., Goncharov N.V Impact of chronic inhalation of low doses of aliphatic hydrocarbons C6-C10 on metabolic profiles of rats brain and liver. Toksikol. vest. 2017; 144(3): 31-41. (in Russian).
Поступила 01 июня 2018 Принята в печать 19 сентября 2018
