CC BY
14
ВЕТЕРИНАРИЯ И ЗООТЕХНИЯ
4.2.3. ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ И ИММУНОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ _(БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ)
УДК 579:543.645.6-001.891.53 DOI 10.18286/1816-4501-2022-3-135-141
ОПТИМИЗАЦИЯ СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПЕПТИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ M. DOMESTICA, И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ
Ларионова Ольга Сергеевна, доктор биологических наук, доцент, заведующая кафедрой «Микробиология и биотехнологии»
Крылова Любовь Сергеевна, аспирант кафедры «Микробиология и биотехнологии»
Древко Ярослав Борисович, кандидат химических наук, доцент кафедры «Микробиология и биотехнологии»
Смирнова Ксения Юрьевна, ассистент кафедры «Микробиология и биотехнологии»
ФГБОУ ВО «Саратовский ГАУ»
410012 Россия, Саратов, Театральная пл.1, +7-962-622-33-76, [email protected]
Ключевые слова: водорастворимые пептиды, штаммы, антимикробная активность, острая токсичность.
В статье получены данные по оптимизации способа получения фракций водорастворимых пептидов методом холодной экстракции из биомассы личинок Musca domestica, разделению их с использованием диализных мембран размером менее 3,5 кДа, 3,5-7кДа, 7-14 кДа, более 14 кДа с последующим исследованием методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Установлено время удерживания и хроматографический выход, содержание белка, антимикробные свойства, острая токсичность белковой фракции 2 (БФ2), являющейся фракцией выделенной при использовании мембран 3,5 - 7 кДа. Следовательно, данная фракция имеет массу белков в интервале от 3,5 кДа до 7 кДа. Получены результаты антимикробной активности анализируемой белковой фракции 2 к следующим штаммам: B. cereus 8035, E. aerogenes ATCC-13048, E. coli Мордовия 21. Выявлено, что белковая фракция 2 в концентрации 10 мг/мл, 5 мг/мл, 2.5 мг/мл обладала антимикробной активностью по отношению к E. aerogenes ATCC-13048, E. coli Мордовия 21. Проведена оценка острой токсичности данной фракции на лабораторных мышах при однократном внутрижелудочном и парентеральном введении. Среднесмертельную дозу при внутрижелудочном и парентеральном введении для 20% раствора белковой фракции 2 установить не удалось, так как максимально возможные дозы для данных типов введения не привели к гибели ни одного животного. Установлено, что 20% раствор белковой фракции 2 относится к 4 классу опасности (вещества малоопасные) согласно общепринятой гигиенической классификации.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-26-00167, https://rscf.ru/
project/22-26-00167/
Введение
Антимикробные пептиды (АМП), представляющие собой молекулы, состоящие из 10-100 аминокислот, продуцируются всеми живыми организмами и играют важную роль во врожденном иммунитете [1, 2]. Они обладают широким спектром активности в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий, грибов и некоторых вирусов [3]. Помимо этого, имеются сведения, что они также могут
оказывать цитотоксическое действие в отношении раковых клеток [4].
Актуальность данного исследования обусловлена тем, что антимикробные пептиды имеют большой потенциал в качестве противо-микробных агентов с новыми механизмами действия и могут быть востребованы в медицине и ветеринарии.
Материалы и методы исследований Целью исследования являлась оптимиза-
Таблица 1
Хроматографический выход фракций водорастворимых пептидов при использовании в качестве элюента фосфатно-солевого буфера
Показатель Фракции водорастворимых пептидов
Образец 1 Образец 2 Образец 3 Среднее
Пик 1 Пик 2 Пик 1 Пик 2 Пик 1 Пик 2 Пик 1 Пик 2
Площадь 142,86 120,27 142,16 116,85 128,75 103,03 137,92+/-9 113,38+/-10,33
Процент,% 54 46 55 45 56 44 55+/-1,13 45+/-1,13
ция способа получения водорастворимых пептидов, обладающих антимикробной активностью, для дальнейшего масштабирования процесса, направленного на разработку препаратов на их основе. Для выделения водорастворимых пептидов из биомассы личинок M. domestica использовали метод холодной экстракции, для этого проводили гомогенизацию биомассы личинок. Фракции, полученные данным способом, разделяли методом диализа, используя диализные мембраны менее 3,5 кДа, 3,5-7кДа, 7-14 кДа, более 14 кДа. Таким образом, было получено 4 образца, которые затем исследовали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В данной статье представлены хроматограммы образца 2, полученного в результате диализа через диализную мембрану 3,5-7 кДа. Хроматографический анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Стайер Аквилон с использованием хро-матографической колонки Phenomenex BioSep-SEC-S-2000, длина волны 214 нм и скорости потока 0,5 мл/мин, при использовании в качестве элюента - воды, при этом наблюдали один пик со временем удерживания 5-6 мин. При использовании в качестве элюента фосфатно-солево-го буфера (ФСБ) установлено два пика. Раствор ФСБ готовили следующим образом: 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г Na2HPO4; 0,24 г KH2PO4 растворяли в 800 мл дистиллированной воды и доводили pH до 7,4 соляной кислотой или гидрокси-дом натрия, далее доводили водой до общего объема 1 литр.
Концентрацию белка полученных фракций определяли методом Лоури на спектрофотометре «ShimadzuUV-1280» при длине волны 450 нм [5].
Антимикробную активность белковой фракции 2 определяли методом диффузии препарата в агар, руководствуясь методическими указаниями 0ФС.1.2.4.0010.15 Определение антимикробной активности антибиотиков [6]. В исследовании использовали следующие культуры микроорганизмов: B. cereus 8035 предоставлена Ульяновской ГСХА, E. aerogenes ATCC-13048 по-
лучена из государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспо-требнадзора, E. coli Мордовия 21 предоставлена ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.
Для оценки общетоксического действия раствора белковой фракции 2 на лабораторных животных использовали «Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» [7]. Оценку острой токсичности проводили на мышах при однократном внутрижелудочном и парентеральном введении.
Результаты исследований
Для экстракции водорастворимых пептидов из биомассы личинок M. domestica использовали вышеуказанную методику. Для анализа полученных фракций применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, в качестве элюента использовали дистиллированную воду и фосфатно-солевой буфер.
Таким образом, в результате эксперимента разделением на диализных мембранах были получены 4 белковые фракции, которые в дальнейшем были исследованы на антимикробную активность и установлено, что фракция пептидов 2 с массой от 3,5 до 7 кДа является наиболее перспективной. При анализе методом ВЭЖХ с УФ детектором было установлено, что при использовании в качестве элюента дистиллированной воды наблюдался только один пик, а при использовании фосфатно-солевого буфера установлено два пика с близким временем удерживания, что свидетельствует о наличии в данной фракции как минимум двух разных пептидов. Все хроматограммы записывались в трех по-вторностях для достоверности исследования и исключения ошибок в анализе (табл. 1, Рис. 1-4).
Для определения антимикробной активности белковой фракции 2 (Рис. 5-7) по отношению к штаммам B. cereus 8035, E. aerogenes ATCC-13048, E. coli Мордовия 21 применяли метод диффузии в агар. По результатам исследований белковая фракция 2 обладала выраженной антибактериальной активностью по отношению к грамотрицательным микроорганизмам,
.4711
£ill 1IEVCIII
T i IftMLMJ
№ojr
ühtnuati
v:nep iHiiMHi
>-'T. Al
H'fl/IGJ; Ц|Й|М tt
Ими 1.5 - : KEi ■ s. u/ewirei 1зиплэ
eifwateWiHn1.euan\}»i;<l!iat
¡.(/■H'J«.: jEWll ЗмаДл'
rjv-m :ли-
Hf« 'HÜ
Ii.
ERB
Hfli Hjfl
Ш Щ ПСТГР Q. i
1
»U.{ htl
1.M
t,M
ИЛ» xc 5-AÖO WrtJ J4W» ж
mAV 1 7 1 j " T * й j
ДО 3 j | \ .......1....... 1 j !"I.....T'" 1 1 4 ■
»
forma. i ч j i ........4---- I i V» s " / ' !--/.............. Г i .......
К .1. » * 1 J i «
JET.TTbTiTü МЛШ UM« t*=4'T4 KHiT^j^d
к? t«iu
Mm ±EIaDH 1
t « ::
i l.-Mi et.ss 1. ti
] 193,03 l.ib
1 Mtl «11.11 11.34.
i i.fd Ali.ll HO.П0
MW lifiEiiü;: |I:«II:]|| gmui 11
»»кет«": Mfnrc j.i т [Л iKEi i
iii-. HWOii; U/Df/aWJ 15:3*:«
■ .::,..4cii:.Mi,,llB'.Etii>DH-.icj.iÄa Ьт 9кш1скс H/nt/uzi itoirtrt ;ьжи1!
№пв L rrvTiai ni*c-.
Zj-i шм iwuq HiH:Sl
i-рптгг utranvr
1ПЛН1
DH№
«wUl"
bltihin;
TkiiUt:
li^BüIFJH Ar
■IlTMKCita ^М1ДЦЫ1
H*
IL
■TtTHi r.iJ
ии »пи t.s
1
fcM
i. DLl
ficj« ic S'tnoo iüi.s i.ilTUM i«
fCW-Uf^H HHIk Mts? mm: А*™™-« "Tthütil 3tl
Ha Внш T^liEk
Цй1 tA?" 1
1 . ii-i 1Ш14 H.H
2 115. Л li.-J
1 б .52! Hl.11 lau.«
irm гши »ivt^K' TVvi pTM ■ itn-Ki: T« t
Рис. 1. - (Слева) Хроматограмма белковой фракции 2 с использованием в качестве элюен-та дистиллированной воды.
Фпбт suis
* I3?j-:?nt Mo АжЕКЕи
Рис.2. - (Справа) Хроматограмма белковой фракции 2 с использованием в качестве элюен-та фосфатно-солевого буфера (Образец 2.1).
в концентрации 10мг/мл, 5 мг/мл, 2.5мг/мл -по отношению к E. aerogenes ATCC-13048, E. coli Мордовия 21, при этом наиболее эффективной концентрацией по отношению к E. aerogenes ATCC-13048 была 10 мг/мл, при этом отмечали максимальную зону задержки роста бактерий. При оценке влияния белковой фракции 2 на рост B. cereus 8035 изначально было отмечено антимикробное действие, однако в дальнейшем отмечали вторичный рост исследуемого микроорганизма (Рис. 5-7, Табл. 2).
Острую токсичность белковой фракции 2 определяли в экспериментах на лабораторных животных (Табл. 3).
Для испытаний использовали 20% раствор белковой фракции 2, выбор данной концентрации был обусловлен тем, что изучаемая фракция обладала антимикробной активностью в концентрации менее 20%. Перед введением для получения 20% раствора навеску БФ2 массой 5 г помещали в аналитическую колбу объемом 25 мл и доводили до метки физиологи-
Таблица 2
Зоны задержки роста микроорганизмов,
мм
Концентра- B. cereus E. aerogenes E. coli
ция 8035 ATCC-13048 Мордовия 21
10 мг/мл 23* 26 23
5 мг/мл 17* 21 16
2.5 мг/мл - 16 14
1.25 мг/мл - - -
0.625 мг/мл - - -
*- Вторичный рост
ческим раствором, который затем вводили животным в соответствующих объемах. Вводимая доза 0,2 мл для животных массой 20 г - 2000 мг/ кг, 0,5 мл - 5000 мг/кг и 0,7 мл - 7000 мг/кг. Сред-несмертельную дозу при внутрижелудочном и парентеральном введении для 20% раствора белковой фракции 2 установить не удалось, так как максимально возможные дозы для данных типов введения не привели к гибели ни одного животного.
Таким образом, согласно общепринятой
Mi:
H.'-.'ti'i'.ü | , ; 1 ■: 1.
Sil!
н-f-tпза
Ал-гт.
¿ИТ 7 TLriL
_bТ Ь мшгспе
З-кС'.'Ск* I
UA.1!
BiamMibtbilSjei
Ji^i
Hcigj i
nt: :il
.st!с
«Huui:
_ HJtAl
aw -i.i
7H ни пстиг 1 m'WH
5-si-:.:
HUiUHlflL
fctmertü
КЕЭСОЛЗи
et
; l -:T-;
t.sain «f
-■■■■»luuie HJ i:
. . 5Q TU
«.1? к-.-'mi'
шов сь^*?: vt
rte zcl ысчеть
Егегсл ,Lr:ik n „,i:uat
ШЧ f
111.7t
V +4-■ tr.
^C'nh
лз ■:
11,13
m-:i
Hl.'.:
i.iii
Ei.i:
lflä.ii
Htii ±iLfan ^/ilbT.:^ . :i
• IIH-IHI MW
■ .г. k-TWArX
Рис. 3. - (Слева) Хроматограмма белковой фракции 2 с использованием в качестве элюен-та фосфатно-солевого буфера (Образец 2.2).
Е aerogenes
АТС Ol 3048
Efc \TW/ L * Sr
"■Ч ж
f
Рис. 5. - (Слева) Изучение антибактериальной активности белковой фракции 2 по отношению к E. аerogenes ATCC-13048.
Рис. 4. - (Справа) Хроматограмма белковой фракции 2 с использованием в качестве элюента фосфатно-солевого буфера (Образец 2.3).
E. coli
Мордовия 21
ТШш
Рис. 6. - (Справа) Изучение антибактериальной активности белковой фракции 2 по отношению к E. coli Мордовия 21.
гигиенической классификации ГОСТ 12.1.007-76, в результате проведенных исследований было выявлено, что 20% раствор белковой фракции 2 относится к 4 классу опасности (вещества малоопасные).
Обсуждение
Антимикробные пептиды являются важным звеном врождённого и приобретенного иммунитета макроорганизма, их способны синтезировать практически все живые организмы. Вследствие эволюционного процесса снижения чувствительности микроорганизмов к антимикробным средствам происходит адаптация патогенов к непрерывному контакту с антибиотиками. Тенденция повсеместного не-регламентированного использования антибиотиков приводит к селекции антибиотикорезистентных штаммов [1, 8- 10]. Таким образом, исследования новых перспективных антибактериальных биологических агентов могут стать предпосылкой к разработке высокоэффективных антимикробных препаратов, способных прийти на смену традиционным антибактериальным препаратам [11].
Отличительной особенностью антимикробных пептидов от классических антибиотиков является низкая вероятность развития антибиотикорези-стентности, кроме того АМП обладают противовоспалительными свойствами и противомикробной активностью по отношению к широкому спектру бактерий, грибов и вирусов, вызывая их гибель [12-15].
Проведенные нами исследования позволили выявить антимикробную активность белковой фракции 2, полученной из биомассы личинок Musca domestica. Белковая фракция 2 в концентрации 10мг/мл, 5 мг/мл, 2.5мг/мл обладала антимикробной активностью по отношению к E. aerogenes ATCC-13048, E. coli Мордовия 21. В результате изучения острой токсичности согласно общепринятой гигиенической классификации ГОСТ 12.1.007-76 было показано, что изучаемые БФ2 относятся к 4 классу опасности (вещества малоопасные). Примечательным является антимикробное действие анализируемой белковой фракции по отношению к полевому штамму E. coli Мордовия 21. Следовательно, пептиды, выделенные из биомассы M. Domes-
Таблица 3
Дизайн опыта по проведению острой токсичности
Группа Вид,пол животных Кол-во животных в группе Препарат (вариант опыта) Доза, мг/кг Объем раствора для введения, мл/животное Режим введения
1 Мыши-самцы массой 18-20 г 0 БФ2 (испытуемый препарат) 2000 0,18-0,2 в/б, однократно
2 Мыши-самцы массой 18-20 г 0 БФ2 (испытуемый препарат) 5000 0,45-0,5 в/б, однократно
3 Мыши-самцы массой 18-20 г 0 БФ2 (испытуемый препарат) 7000 0,63-0,7 в/б, однократно
4 Мыши-самцы массой 18-20 г 0 Вода для инъекций (контроль) 1 в/б, однократно
5 Мыши-самцы массой 18-20 г 6 БФ2 (испытуемый препарат) 2000 0,18-0,2 Внутрижелу-дочно, однократно
6 Мыши-самцы массой 18-20 г 6 БФ2 (испытуемый препарат) 5000 0,45-0,5 Внутрижелу-дочно, однократно
7 Мыши-самцы массой 18-20 г 6 БФ2 (испытуемый препарат) 7000 0,63-0,7 Внутрижелу-дочно, однократно
8 Мыши-самцы массой 18-20 г 6 Вода для инъекций (контроль) 1 Внутрижелу-дочно, однократно
В. cereus 8035
Рис. 7. - Изучение антибактериальной активности белковой фракции 2 по отношению к B. cereus 8035.
tica, могут быть использованы для разработки антибактериальных препаратов эффективных, в том числе при заболеваниях, вызываемых данными этиологическими агентами.
Заключение
В результате проведенных нами исследований был оптимизирован способ получения водорастворимых пептидов биомассы личинок Musca domestica. Изучена антимикробная активность выделенных белковых фракций, а именно белковая фракция 2 в концентрации 10мг/мл, 5 мг/мл, 2.5мг/мл обладала антимикробной активностью по отношению к E. aerogenes ATCC-13048, E. coli Мордовия 21. Среднесмертельную дозу при внутрижелудочном и парентеральном введении для 20% раствора БФ2 установить не удалось, так как максимально возможные дозы для данных типов введения не привели к гибели ни одного животного. Согласно общепринятой гигиенической классификации ГОСТ 12.1.007-76 была изучена острая токсичность 20% раствора антимикробных пептидов, установлено, что белковая фракция 2 относится к 4 классу опасности (вещества малоопасные).
Библиографический список
1. Insect cecropins, antimicrobial peptides with potential therapeutic applications / D. Brady, A. Grapputo, O. Romoli, F. Sandrelli // International Journal of Molecular Sciences. - 2019. - Vol. 20. - P. 5862. - URL: https://doi.org/10.3390/ijms20235862
2. Chen, C. H. Development and challenges of antimicrobial peptides for therapeutic applications / C. H. Chen, T. K. Lu // Antibiotics. - 2020. - № 9. - P. 1-20. - URL: https://doi.org/10.3390/ antibiotics9010024
3. Diversity, evolution and medical applications of insect antimicrobial peptides / E. Mylonakis, L. Podsiadlowski, M. Muhammed [et al.] // Philosophical Transactions of the Royal Society B.
- 2016. - 371. - Р. 20150290.
4. Peptides with dual antimicrobial and anticancer activities / M. R. Felicio, O. N. Silva, S. Gongalves, N. C. Santos, O. L. Franco // Frontiers in Chemistry. - 2017. - № 5. - P. 5.
5. Protein measurement with Folin phenol reagent / O. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr [et al.] // Journal of Biological Chemistry. - 1951. - Vol. 193, № 1. - P. 265-275.
6. 0ФС.1.2.4.0010.15 Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии в агар : методические указания. - Введ.
- Министерство здравоохранения Российской Федерации.
7. Хабриев, Р. У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых
фармакологических веществ. Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ / Р. У. Хабриев. - Москва, 2005.
8. Synergistic efficacy of Aedes aegypti antimicrobial peptide cecropin A2 and tetracycline against Pseudomonas aeruginosa / Z. Zheng, N. Tharmalingam, Q. Liu, E. Jayamani, W. Kim, B. B. Fuchs, R. Zhang, A. Vilcinskas, E. Mylonakis // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 2017.
- № 61. - P. 7. - URL: https://doi.org/10.1128/ AAC.00686-17.
9. Antimicrobial and Antibiofilm Peptides / A. Di Somma, A. Moretta, C. Cane, A. Cirillo, A. Duilio // Biomolecules. - 2020. - Vol. 10, № 4. - P. 652.
10. Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms / M. Zasloff // Nature. -2002. - Vol. 415. - P. 389.
11. Parachin, Nadia S. New edge of antibiotic development: antimicrobial peptides and corresponding resistance / Nadia S. Parachin, O. L. Franco // Frontiers in Microbiology. - 2014. - P. 1-145.
12. Proteomic аnalysis оf bacteriophage PR - 6 UGSHA / N.A. Feoktistova, D.A. Vasilyev, A.V. Mastilenko, E.V. Suldina, S.N. Zolotukhin, A.L. Toigildin, I.A. Toigildina, A.V. Dozorov, V.A. Isaichev,
A.A. Nafeev, I.L. Obuhov, B.I. Shmorgun // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. - 2019. - Т. 10. - № 2. - С. 1580-1587.
13. Development of PCR detection system of bacteriophages PR4 UGSHA, E7 ULSAU and YE5 ULSAU / N.A. Feoktistova, D.A. Vasilyev, A.V. Mastilenko, E.V. Suldina, E.N. Mallyamova, A.A. Nafeev, A.L. Toigildin, I.A. Toigildina, I.L. Obukhov,
B.I. Shmorgun // Ambient Science. - 2019. - Т. 6. - № 2. - С. 26-30.
14. Анализ протеома бактериофага Bacillus cereus / Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев, А.В. Ма-стиленко, Р.З. Юсупова // Материалы XIV Международной научно-практической конференции «Научно-технический прогресс в сельскохозяйственном производстве». - Великие луки, 2019.
- С. 153-158.
15. Antimicrobial peptide gene induction, involvement of Toll and IMD pathways and defense against bacteria in the red flour beetle, Tribolium castaneum / K. Yokoi, H. Koyama, C. Minakuchi, T. Tanaka, K. Miura // Results Immunology - 2012. -Vol. 2. - P. 72-82. - URL: https://doi.org/10.1016/j. rinim.2012.03.002.
IMPROVEMENT OF THE METHOD OF OBTAINING WATER-SOLUBLE PEPTIDES ISOLATED FROM M. DOMESTICA AND
STUDY OF THEIR PROPERTIES
Larionova O. S., Krylova L. S., Drevko Ya. B., Smirnova K. Yu. FSBEI HE Saratov State Agrarian University 410012 Russia, Saratov, Teatralnaya sq. 1, +7-962-622-33-76, [email protected]
Key words: water-soluble peptides, strains, antimicrobial activity, acute toxicity.
The article presents data on improvement of the method of obtaining fractions of water-soluble peptides by cold extraction from the biomass of Musca domestica larvae, their separation using dialysis membranes with sizes less than 3.5 kDa, 3.5-7 kDa, 7-14 kDa, more than 14 kDa, followed by a study by means of highly effective liquid chromatography. Retention time and chromatographic yield, protein content, antimicrobial properties, acute toxicity of 2 (BP2) protein fraction, which is the fraction isolated when using membranes of 3.5 - 7 kDa, were established. Therefore, this fraction has a mass of proteins in the range from 3.5 kDa to 7 kDa. The results of the antimicrobial activity of the analyzed protein fraction 2 to the following strains were obtained: B. cereus 8035, E. aerogenes ATCC-13048, E. coli Mordovia 21. It was found that the protein fraction 2 at a concentration of 10 mg/ml, 5 mg/ml, 2.5 mg /ml had antimicrobial activity against E. aerogenes ATCC-13048, E. coli Mordovia 21. Acute toxicity of this fraction was assessed on laboratory mice after a single intragastric and parenteral administration. The average lethal dose for intragastric and parenteral administration for 20% solution of protein fraction 2 could not be established, since the maximum possible doses for these types of administration did not lead to death of any animal. It was established that 20% solution of protein fraction 2 belongs to the 4th hazard class (substances of low hazard) according to the generally accepted hygienic classification.
Bibliography:
1. Insect cecropins, antimicrobial peptides with potential therapeutic applications / D. Brady, A. Grapputo, O. Romoli, F. Sandrelli // International Journal of Molecular Sciences. - 2019. - Vol. 20. - P. 5862. - URL: https://doi.org/10.3390/ijms20235862
2. Chen, C. H. Development and challenges of antimicrobial peptides for therapeutic applications / C. H. Chen, T. K. Lu // Antibiotics. - 2020. - № 9. - P. 1-20. - URL: https://doi.org/10.3390/antibiotics9010024
3. Diversity, evolution and medical applications of insect antimicrobial peptides / E. Mylonakis, L. Podsiadlowski, M. Muhammed [et al.] // Philosophical Transactions of the Royal Society B. - 2016. - 371. - P. 20150290.
4. Peptides with dual antimicrobial and anticancer activities / M. R. Felicio, O. N. Silva, S. Gongalves, N. C. Santos, O. L. Franco // Frontiers in Chemistry. -2017. - № 5. - P. 5.
5. Protein measurement with Folin phenol reagent / O. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr [et al.] // Journal of Biological Chemistry. -1951. - Vol. 193, № 1. - P. 265-275.
6. General pharmacopoeial monograph.1.2.4.0010.15 Specification of antimicrobial activity of antibiotics by agar diffusion method: instructional guidelines. -. - Ministry of Health of the Russian Federation.
7. Khabriev, R. U. Guidelines for experimental (preclinical) study of new pharmacological substances. Guidelines for study of the general toxic effect of pharmacological substances / R. U. Khabriev. - Moscow, 2005. - 832 p.
8. Synergistic efficacy of Aedesaegypti antimicrobial peptide cecropin A2 and tetracycline against Pseudomonas aeruginosa /Z. Zheng, N. Tharmalingam, Q. Liu, E. Jayamani, W. Kim, B. B. Fuchs, R. Zhang, A. Vilcinskas, E. Mylonakis //Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 2017. - № 61. - P. 7. - URL: https:// doi.org/10.1128/AAC.00686-17.
9. Antimicrobial and Antibiofilm Peptides/A. Di Somma, A. Moretta, C. Cane, A. Cirillo, A. Duilio // Biomolecules. - 2020. - Vol. 10, № 4. - P. 652.
10. Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms / M. Zasloff// Nature. - 2002. - Vol. 415. - P. 389.
11. Parachin, Nadia S. New edge of antibiotic development: antimicrobial peptides and corresponding resistance / Nadia S. Parachin, O. L. Franco // Frontiers in Microbiology. - 2014. - P. 1-145.
12. Proteomic analysis of bacteriophage PR - 6 UGSHA / N.A. Feoktistova, D.A. Vasilyev, A.V. Mastilenko, E.V. Suldina, S.N. Zolotukhin, A.L. Toigildin, I.A. Toigildina, A.V. Dozorov, V.A. Isaichev, A.A. Nafeev, I.L. Obuhov, B.I. Shmorgun // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. - 2019. - T. 10. - № 2. - P. 1580-1587.
13. Development of PCR detection system of bacteriophages PR4 UGSHA, E7 ULSAU and YE5 ULSAU / N.A. Feoktistova, D.A. Vasilyev, A.V. Mastilenko, E.V. Suldina, E.N. Mallyamova, A.A. Nafeev, A.L. Toigildin, I.A. Toigildina, I.L. Obukhov, B.I. Shmorgun // Ambient Science. - 2019. - V. 6. - № 2. - P. 26-30.
14. Analysis of proteome of Bacillus cereus bacteriophage / N.A. Feoktistova, D.A. Vasiliev, A.V. Mastilenko, R.Z. Yusupova // Materials of the XIV International Scientific and Practical Conference "Scientific and Technological Progress in Agricultural Production". -VelikieLuki, 2019. - P. 153-158.
15. Antimicrobial peptide gene induction, involvement of Toll and IMD pathways and defense against bacteria in the red flour beetle, Triboliumcastaneum /K. Yokoi, H. Koyama, C. Minakuchi, T. Tanaka, K. Miura//Results Immunology - 2012. - Vol. 2.-P. 72-82. - URL: https://doi.org/10.1016/j.rinim.2012.03.002.
