CC BY
60
DOI: 10.24411/2074-5036-2019-10044 УДК: 579.62
Ключевые слова: насекомые, Galleria mellonella, антимикробные пептиды, высокоэффективная жидкостная хроматография, антимикробная активность.
Key words: insects, Galleria mellonella, antimicrobial peptides, high performance liquid chromatography, antimicrobial activity.
Крылова Л. С., Ремизов Е. К., Смирнова К. Ю., Ларионова О. С.
ИНДИКАЦИЯ ПЕПТИДОВ ИЗ БИОМАССЫ ЛИЧИНОК НАСЕКОМЫХ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ
INDICATION OF PEPTIDES FROM BIOMASS LARVA OF INSECTS AND STUDY OF THEIR
ANTIMICROBIAL ACTIVITY
ФГБОУ ВО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова». 410012, Россия, г. Саратов, Театральная пл., д. 1 FSBEU HE «Saratov State Agrarian University named after N. I. Vavilov». 410012, Russian Federation, Saratov, Teatralnaya sq., 1
Крылова Любовь Сергеевна, студентка 4 курса. E-mail: krilovalyubov@yandex.ru
Krylova Lubov Sergeevna, 4thyear student. E-mail: krilovalyubov@yandex.ru Ремизов Евгений Кириллович, аспирант 2 года обучения. E-mail: evg1994rem54@mail.ru. Тел.: +7(906)150-88-99 Remizov Evgenii Kirillovich, post-graduate student. E-mail: evg1994rem54@mail.ru. Tel: +7(906)150-88-99 Смирнова Ксения Юрьевна, аспирант 1 года обучения. E-mail: smirnova.ku@mail.ru. Тел.: +7(919)837-12-39 Smirnova Ksenia Yurievna, post-graduate student. E-mail: smirnova.ku@mail.ru. Tel: +7(919)837-12-39 Ларионова Ольга Сергеевна, д. б. н., доцент, заведующий кафедрой «Микробиология, биотехнология и химия».
E-mail: larionova1@mail.ru. Тел: +7(962)622-33-76 Larionova Olga Sergeevna, Doctor of Biology, Associate Professordocent, Chief of the department of Microbiology, Biotechnology and Chemistry Dept. E-mail: larionova1@mail.ru. Tel: +7(962)622-33-76
Аннотация. Разработана оригинальная методика выделения антимикробных пептидов из биомассы личинок Galleria mellonella с последующим разделением белковых фракций методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с предварительным поиском оптимальной системы растворителей и условий для проведения хроматографирования. Изучена антимикробная активность пептидов по отношению к S. typhimurium 1626, S. aureusATCC 6538(209-P), E. coli 1027, B. cereusATCC10702. Доказана, антимикробная активность пептида 4.2 по отношению к B. œreus ATCC 10702, S. typhimurium1626, E. mli 1027 и пептида 6.1 к B. cereus ATCC 10702 и S. typhimurium1626. Выявлено, что пептид 4.2 обладает более высокой антибактериальной активностью по отношению к B. cereus ATCC 10702 в концентрации 0,625 мг/л, и высокой по отношению к S. typhimurium 1626, E. mli 1027 в концентрации 10 мг/л. Пептид 6.1 высокоэффективен и подавляет рост B. cereus ATCC 10702 в концентрации 0,625 мг/л, в отношении S. typhimurium1626 эффективна только концентрация - 10 мг/л. Summary. The original method for obtaining antimicrobial peptides from the biomass of Galleria mellonella larvae followed by separation of protein fractions by high performance liquid chromatography (HPLC) with a preliminary searching of the optimal solvent system and conditions for chromatography was developed. The antimicrobial activity ofpeptides as related to S. typhimurium 1626, S. aureus ATCC 6538 (209-P), E. coli 1027, B. cereus ATCC 10702 was studied. Antimicrobial activity of peptide 4.2 as related to B. cereus ATCC 10702, S. typhimurium1626, E. rnli 1027 and peptide 6.1 as related to B. cereus ATCC 10702 and S. typhimurium 1626 was proved. It was revealed, that peptide 4.2 has the highest antibacterial activity against to B. cereus ATCC 10702 at a concentration of 0.625 mg / l, and high to S. typhimurium 1626, E. rnli 1027 at a concentration of 10 mg / l. Peptide 6.1 is highly effective and inhibits the growth of B. cereus ATCC 10702 at a concentration of 0.625 mg /1, with respect to S. typhimurium 1626 only a concentration of 10 mg /1 was effective.
Введение
Насекомые составляют около 80 % глобального разнообразия видов, их не менее двух миллионов видов, т. е. больше, чем всех прочих животных и растений вместе взятых.
В последнее десятилетие во всем мире наблюдается повышенный интерес к насекомым как источнику высокоусвояемого кормового белка, жира с уникальными свойствами, антиок-сидантов, иммуномодуляторов, сырья для полу-
чения новых лекарственных средств [1, 3]. Немаловажным фактором является возможность культивирования некоторых видов в искусственных условиях, что позволяет использовать их в качестве новых промышленных продуцентов, получать физиолого-биохимические и генетические характеристики конкретной культуры, контролировать процессы биоконверсии субстратов, на которых развиваются насекомые, а также оценивать качественные и количественные показатели продуктов переработки биомассы насекомых для последующего применения в кормах, ветеринарии, фармакологии.
Селекция и распространение бактерий с сильной устойчивостью к лекарствам несет за собой серьезную угрозу здоровью людей и животных во всем мире [6]. Бесконтрольное применение антибиотиков, как и в свою очередь во многом необходимость людей применять про-тивомикробные препараты, в различных целях, в ветеринарии, медицине и сельском хозяйстве способствует постепенной адаптации микроорганизмов из-за селекции антибиотикорезистент-ных штаммов ко многим известным на данный момент антибиотикам [7]. В этой связи ученые во многих странах прикладывают усилия по разработке альтернативных подходов к синтезу или получению антибиотиков [5]. Одним из перспективных направлений для решения этого вопроса стало изучение пептидов, получаемых от насекомых и даже растений. У насекомых антимикробные пептиды (АМП) осуществляют барьерную функцию организма, защищая его от инвазии патогенными микроорганизмами. В процессе эволюции насекомые сформировали огромный антимикробный потенциал с большим разнообразием антимикробных пептидов и, таким образом, являются наиболее перспективным источником для поиска противоми-кробных агентов [2, 4].
Материалы и методы
В качестве антимикробных агентов использовали пептиды, выделенные из личинок большой восковой моли Gallería mellonella. АМП Galleria mellonella предварительно очищали путем высаливания сульфатом аммония, с последующим центрифугированием и диализом против фосфатно-солевого буфера.
Разделение белковых фракций производили методом высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с предварительным
выполнением поиска оптимальной системы растворителей и условий для проведения хро-матографирования. Полученные белковые фракции подвергали лиофилизации и в дальнейших исследованиях использовали лио-фильно высушенные антимикробные пептиды, полученные из личинок Galleria mellonella.
Определение антимикробной активности проводили микрометодом, согласно методике МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Для данного эксперимента использовали культуры S. typhimurium 1626, по-лученнуюый из Туркменской противочумной станции; S. aureus ATCC 6538(209-P), полу-ченнуюый из Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков, г. Москва; E. coli 1027, полученнуюый из Городской санитарно-эпидемиологической станции г. Саратова; B. cereus ATCC 10702, полученнуюый из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИ «Генетика». Инокулюмы микроорганизмов вносили в лунки планшетов, затем в них добавляли испытуемые пептиды в концентрациях 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.31, 0.15 мг/л. Для каждой культуры микроорганизмов и каждой концентрации эксперимент был выполнен в трех повторно-стях. Планшеты помещали в термостат при t 37 °С и через 24 часа производили учет результатов. Учет результатов проводили визуально или спектрофотометрически, сравнивая рост микроорганизма в присутствии антибактериального препарата (АБП) с ростом культуры в ячейке без АБП.
Результаты исследований
Разделение антимикробных пептидов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии согласно разработанной нами методике. ВЭЖХ проводили на колонке BioSep S2000 300x2120 мм на длине волны 280 нм, объем петли 1575 мкл, элю-ентом был 0,1 М фосфатный буферный солевой раствор. Аналитические определения проводили в следующих условиях: скорость потока - 1,0 мл/мин, объем вводимой пробы - 20 мкл, температура колонки 25°С. Хро-матограммы, выделенных нами водорастворимых пептидов, из личинок G. mellonella, и обладающих антимикробной активностью, представлены на рис. 1 и 2.
mAU
30- - i -
20- i -
i
10- i
/ i
L i
5 — 0 -1-1-1-1-1-1- 5 20 25 30 35 40 45 0 -1-1-1-1- 5 60 65 70 "5 -и ш-
РЕЗУЛЬТАТЫ РАСЧЕТА Кетод расчета: Абсолютная концентрация Стандарт: Нет
No Время Плошаль Плошаль Название
мин шАи*сек I
1 9.925 4624.66 28.9S
2 12.48 11332.36 71.02
2 76.75 15957.01 100.00
Рис. 1. Хроматограмма пептида 4.2, выделенного из личинок Gallería mellonella.
60- 1
í\
5040-
30-
20-
10-
2 4 6 10 12 14 6 IS 20 22 24 26 2S 30 32 34 36 3S 0 мш
РЕЗУЛЬТАТЫ РАСЧЕТА Метод расчета: Абсолютная концентрация Стандарт: Нет
tío Время Плошаль Плошаль Название
мин mAU*ces 4
1 12.82 20897.49 100.00
Рис. 2. Хроматограмма пептида 6.1, выделенного из личинок Galleria mellonella.
На рисунке 3 представлены результаты изучения антимикробной активности АМП 4.2, выделенного из личинок Galleria mellonella. Согласно представленным результатам выявлено, что данный пептид обладает более высокой антибактериальной активностью по отношению к B. cereus ATCC 10702, S. typhimurium 1626 и относительно высокой по отношению к E. coli 1027 и не вызывает гибели S. aureus ATCC 6538(209-P).
Как видно на рисунке 4, пептид 6.1 инги-бирует рост S. typhimurium 1626 и B. cereus ATCC 10702. Данный пептид высокоэффективен и подавляет рост B. cereus ATCC 10702 в концентрации 0,625 мг/л, в концентрации 10 мг/л эффективен в отношении S. Typhimurium 1626. Что касается E. Coli 1027 и S. aureus ATCC 6538(209-P), изученные нами концентрации пептида 6.1 не вызывают их гибели, возможно ингибирование данных штаммов возможно при более высокой концентрации пептида.
Рис. 3. Антимикробная активность пептида 4.2.
Результаты антимикробной активности антимикробных пептидов 4.2 и 6.1 представлены в таблице 1.
Для подтверждения полученных результатов, нами были сделаны высевы из лунок с высокой (10 мг/л) и низкой (0.625 мг/л) концентрацией пептида на чашки Петри со стерильной средой со следующими штаммами микроорганизмов: S. typhimurium 1626, E. coli 1027, B. cereus ATCC 10702, S. aureus ATCC 6538(209-P). После инкубации в термостате при 37 °С и через 24 часа констатировали отсутствие роста, что являлось подтверждением полученных ранее нами результатов об антимикробной активности, выделенных нами пептидов.
Обсуждение результатов
Исследования, проведенные нами на базе научно-исследовательской лаборатории кафедры микробиологии, биотехнологии и химии, позволили разработать способ получения водорастворимых пептидов из личинок
Рис. 4. Антимикробная активность пептида 6.1.
Таблица 1
Установление антимикробной активности пептидов 4.2, 6.1
Название микроорганизма Пептид 4.2 Пептид 6.1
0.625 мг/л 10 мг/л 0.625 мг/л 10 мг/л
S. typhimurium 1626 + + - +
E. coli1027 - + - -
B. cereus ATCC 10702 + + + +
S. aureus ATCC (6538(209-P) - - - -
Примечание: + установлена антимикробная активность, - не установлена антимикробная активность.
большой восковой моли и изучить их антимикробные свойства. Полученные результаты свидетельствуют, о том, что АМП 6.1 и 4.2 обладают высокой антибактериальной активностью в отношении некоторых бактерий.
Исходя из полученных данных, можно заключить, что пептид 4.2 обладает более высокой антибактериальной активностью по отношению к B. cereus ATCC 10702 и S. typhimurium 1626 в концентрации 0.625 мг/л, и высокой по отношению к E. coli 1027 в концентрации 10 мг/л и не вызывает гибели S. aureus ATCC 6538(209-P). Пептид 6.1 высокоэффективен и подавляет рост B. cereus ATCC 10702 в концентрации 0,625 мг/л. В отношении S. typhimurium 1626 эффективна только концентрация - 10 мг/л. Однако способность ингибировать рост S. typhimurium 1626 у пептида 6.1 ниже, чем у пептида 4.2 и ограничена концентрацией 10 мг/л. Что касается S. aureus ATCC 6538(209-P), E. coli 1027, то изученные нами концентрации пептида 6.1 не вызывают их гибели, возможно ингибирование данного штамма возможно при высокой концентрации пептида.
Выводы
1. Разработана методика получения водорастворимых пептидов из личинок большой восковой моли Galleria mellonella. Подобраны оптимальные условия для разделения водорастворимых пептидов методом ВЭЖХ, а именно 80 мм при скорости потока 1 мл/мин и длине волны 280 нм, на колонке BioSep SEC S-2000 300х7, время хроматографирования 60 мин, объем вводимой пробы 20 мкл и температуре 25 °С.
2. Пептид 4.2 обладает более высокой антибактериальной активностью по отношению к B. cereus ATCC 10702 и S. typhimurium 1626 в концентрации 0.625 мг/л, и высокой по отношению к E. coli 1027 в концентрации 10 мг/л.
3. Пептид 6.1 обладает антибактериальной активностью в концентрации 0,625 мг/л по от-
ношению к B. cereus ATCC 10702, в концентрации 10мг/мл по отношению к S. typhimurium 1626. Однако способность ингибировать рост S. typhimurium 1626 у пептида 6.1 ниже, чем у пептида 4.2, и ограничена концентрацией 10 мг/л.
4. Изученные нами концентрации пептида 4.2 и 6.1 не подавляли рост S. aureus ATCC 6538(209-P), возможно ингибирование данного штамма возможно при более высокой концентрации данных пептидов.
Список литературы
1. Мартыненко А. А. Антибиотикочувствительность и антибиотикорезистентность эшерихий, выделенных в пти-цехозяйствах центрального региона Украины ./ А. А. Мартыненко // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. 2017, № 3 (35). С. 20-24.
2. Цыдыпов В. Ц., Алексеева С.М., Иванова О.М. Влияние «"Сантела»" как индуктора на возникновение спонтанной эндогенной инфекции. / В. Ц. Цыдыпов, С. М. Алексеева, О. М. Иванова // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. 2017, № 4 (36). С. 13-15.
3. Jozefiak D., Jozefiak A., Kieronczyk B., Rawski M., Swi^tkiewicz S., Dlugosz J., Engberg R.M. Insects - a natural nutrient source for poultry - a review / D. Jozefiak, A. Jozefiak, B. Kieronczyk, M. Rawski, S. Swi^tkiewicz, J. Dlugosz, R. M. Engberg // Annals of Animal Science. 2016. P. 36.
4. Sаnchez, M. L. Natural antimicrobial peptides: pleiotropic molecules in host defense / M. L. Sаnchez, M. M. Martinez, P. C. Maffia // CellBio. - 2013. -Vol. 2. - P. 200--210.
5. Stamer A., Wesselss S., Neidigk R., Hoerstgen-Schwark G. Black Soldier Fly (Hermetia illucens) larvae-meal as an example for a new feed ingredients' class in aquaculture diets / Stamer A., Wesselss S., Neidigk R., Hoerstgen-Schwark G. // Rahmann G., Aksoy U. (Eds.). Proceedings of the 4th ISOFAR Scientific Conference. 'Building Organic Bridges', atthe Organic World Congress 2014, 13-15 Oct. Istanbul, Turkey, 2014. P. 1043-1046.
6. Wang G., Mishra B., Lau K., Lushnikova T., Golla R., Wang X. Antimicrobial peptides in 2014 ./ G. Wang, B. Mishra, K. Lau, T. Lushnikova, R. Golla R., X. Wang // Pharmaceuticals, 2015, 8, P. 123—150.
7. Yu, L.M. CecropinA-magainin, a new hybrid antibacterial peptide against meticillin-resistant Staphylococcus aureus / L.M. Yu, T.T. Yang, X.Q. Wang // Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. - 2015. - Vol. 46. - No. 2. -P. 218-221.
