ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ НЕМАТОД СЕМЕЙСТВА STEINERNEMATIDE (NEMATODA: RHABDITIDA) НА ИСКУССТВЕННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНЕРТНОГО НОСИТЕЛЯ Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

54

УДК 632.937.01:576.895.132:57.083.12/.13

Вестник защиты растений, 1, 2003

ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ НЕМАТОД СЕМЕЙСТВА STEINERNEMATIDAE (NEMATODA: RHABDITIDA) НА ИСКУССТВЕННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНЕРТНОГО НОСИТЕЛЯ

Л.Г.Данилов, В.Г.Айрапетян, Т.Ю.Нащекина, В.С.Турицин

Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург

Определены оптимальные соотношения компонентного состава искусственных питательных сред, влияние степени дисперсности инертного носителя, количества инокулятов симбиотиче-ских бактерий и инвазионных личинок на рост и развитие энтомопатогенных нематод семейства Steinernematidae применительно к условиям их промышленного производства.

Практическое использование биологических препаратов на основе энтомопатогенных нематод (ЭПН) как и других средств защиты растений от вредных организмов во многом определяется возможностями массовой наработки в объемах, удовлетворяющих спрос на потребительском рынке.

В настоящее время в мировой практике получили развитие три направления в разработке технологий массового производства ЭПН: на насекомых, жидкофаз-ное - в ферментерах, твердофазное - с использованием инертных носителей. Если первое направление связано с освоением и использованием в основном в условиях научно-исследовательских учреждений, когда требуются небольшие объемы нематодных культур для лабораторных и полевых испытаний, то второе и третье направления связаны с разработками промышленных технологий производства препаратов на основе ЭПН.

С учетом актуальности проблемы разработки промышленных технологий производства этих препаратов нами с 1990 г. проводились исследования по разработке способа массового производства энтомопа-тогенных нематод на искусственных питательных средах (ИПС) с использованием инертных носителей. Использование

инертных носителей при культивировании нематод на ИПС впервые было предложено Р.А.Беддингом (Bedding,1981, 1984). По этому методу гомогенатом компонентов питательной среды пропитывается инертный носитель - полиуретановая губка. Р.А.Беддинг адаптировал разработанный им способ применительно к коммерческому производству в Австралии и в КНР (Friedman,1990).

В связи с разработкой промышленной технологии производства нематодных препаратов нами были проведены исследования по отработке отдельных элементов технологии производства нематод на ИПС растительного и животного происхождения с адаптацией и совершенствованием методов Р.А.Беддинга (Bedding, 1981, 1984), В.М.Вутса (Wouts,1981), и китайских энто-могельминтологов (Xu et al., 1989; Han, Wouts, 1990; Han et al.,1992).

Применительно к условиям промышленного производства биологических препаратов на основе ЭПН, проведено изучение влияния компонентного состава питательных сред, степени дисперсности твердого носителя ИПС, количества инокуля-тов инвазионных личинок нематод и их симбиотических бактерий на рост и развитие нематодно-бактериальных комплексов.

Методы и

Биологическую основу получения массовой культуры нематод на искусственных питательных средах (ИПС) составляют чистые отселектированные маточные культуры сим-биотических бактерий и моноксенные культуры инвазионных личинок нематод.

В опытах использованы нематоды вида Steinernema carpocapsae штамм "а^кйсв", вы-

деленые из личинок жуков-щелкунов в Ленинградской области (Пойнар,Веремчук,1970), и Steinernema feltiae штамм SRP18-91, выделенные из почв садов Псковской области (Иванова и др., 2000). На основе нематод S. carpocapsae в Российской Федерации создан и зарегистрирован биологический препарат не-мабакт, а на основе вида S. feltiae, соответст-

Вестник защиты растений, 1, 2003 венно, препарат энтонем-F. Наработки опытных партий препаратов осуществляются на опытно-технологической линии ВИЗР. Основные параметры компонентного состава питательных сред в опытах взяты с учетом результатов практического их использования на опытной линии.

Для размножения нематод использована среда со следующим компонентным составом: соевая мука 16%, куриное яйцо 20%, кукурузное масло 5%, дрожжи пивные 1%, поролоновая крошка 8% и вода 50%. Отдельные компоненты такой ИПС используются и для культивирования нематод в жидкой питательной среде (Friedman et al., 1989; Buecher, Popiel, 1989). Все опыты с ИПС заложены с использованием колб Эрленмейера объемом 500 см3. Одна колба с 70 г ИПС принималась за повторность. Количество инокулюмов нематод и симбиотических бактерий при определении оптимальных компонентных составов ИПС в опытах выдерживалось на уровнях: по инвазионным личинкам нематод -от 2 до 3 млн на одну колбу с питательной средой и по симбиотическим бактериям - 5 мл суспензии бактериальных клеток в питательном бульоне с концентрацией 2 млрд бактериальных клеток в 1 мл. Температура в процессе развития нематодно-бактериального комплекса составляла 23-25°С.

Пивные дрожжи - дорогостоящий компонент питательной среды, поэтому целесообразно иметь информацию и о возможных заменителях этого компонента. В качестве заменителей пивных дрожжей нами были испытаны дрожжи, используемые в микробиологической и хлебопекарной промышленности.

При определении оптимальных соотношений инокулюмов бактериальных клеток первичные формы симбиотических бактерий, выделенные из инвазионных личинок нематод

S.carpocapsae, размножали в питательном бульоне до получения максимальной концентрации бактериальных клеток в расчете на 1 мл бульона. Объем бактериального инокулюма при всех концентрациях бактериальных клеток составлял 5 мл на одну колбу.

Определение оптимального количества инокулюма инвазионных личинок нематод проведено с использованием в опыте вида S. feltiae. Исходную моноксенную культуру нематод получали путем выделения инвазионных личинок из питательной среды в дистиллированной воде с последующим подсчетом их численности и приготовлением определенных доз по вариантам опыта. В полученные водные суспензии нематод добавляли мертиолат (C2H5HgSC6H4COONa) из расчета получения 0.1% раствора. После стерилизации нематод в мертиолате в течение часа их трижды промывали стерильной водой и вносили в 5 мл воды в каждую колбу с автоклавированной питательной средой и размноженной на ней 2-суточной культурой симбиотических бактерий. Исходная концентрация симбиотических бактерий - 2 млрд бактериальных клеток в 1 мл питательного бульона. Повторность опыта 8-кратная.

Оценку возможного влияния дисперсности инертного носителя (объемы одного фрагмента поролона от 0.125 до 8 см3) на эффективность развитие нематод S. carpocapsae проводили при исходной численностью инокулюма около 3 млн инвазионных личинок в расчете на одну колбу с ИПС и симбиотических бактерий с концентрацией 2 млрд клеток в 1 мл питательного бульона. Повторность в опыте 7-кратная.

Экспериментальные данные обрабатывались на основе методов множественного регрессионного и дисперсионного анализов

Результаты и обсуждение

Использование питательных сред из питательных сред для размножения некомпонентов растительного и животного матод £. feltiae послужил основой для происхождения, как следует из данных изучения и оценки питательной ценности таблицы 1, способствует почти двукрат- сред с таким же и улучшенным компо-ному увеличению выхода биомассы не- нентным составом для размножения нематод £. feltiae с единицы объема пита- матод S.carpocapsae (табл.2). тельной среды по сравнению со средами В отличие от S. feltiae, в питательной животного происхождения. Также было среде на основе гороховой муки развитие установлено, что по питательной ценно- нематод S. carpocapsae заметно угнета-сти куриное яйцо можно заменять в со- лось. На средах с другим компонентным ответствующих пропорциях яичным по- составом выход биомассы нематод суще-рошком, а соевую муку - гороховой. ственно не различался и в лучшем вари-Подобранный компонентный состав анте составлял 38 млн инвазионных ли-

чинок на одну колбу, что вдвое превышало выход биомассы 5. feltiae с этой же питательной среды (табл.1).

Таблица 1. Влияние компонентного состава искусственных питательных сред _на выход биомассы feltiae_

V - тдтт п Выход нематод, Компонентный состав ИПС , _

_млн/колбу

Соевая мука (16%), куриное яйцо (20%)* Соевая мука (16%), яичный порошок (5.7%)** Соевая мука (16%), рыбная мука (5.7%)** Гороховая мука (16%), куриное яйцо (20%)* Гороховая мука (16%), яичный порошок (5.7%)** Гороховая мука (16%), рыбная мука (5.7%)** Соевая мука (16%)*** Гороховая мука (16%)***

нср0.95_

*Плюс кукурузное масло - 5%, дрожжи пивные 1%, поролоновая крошка 8%, вода -50%. **То же, вода -64.3%. ***То же, вода - 70%.

Таблица 2. Влияние компонентного состава искусственных питательных сред на выход _биомассы 5. carpocapsae_

V - тдтт п Выход нематод, Компонентный состав ИПС

Соевая мука -16%* 38.0 ± 1.39

Гидролизат сои -16%* 35.3 ± 3.6

Гороховая мука -16%* 17.2 ± 1.93

Соевая мука -16%** 33.3 ± 2.06

Соевая мука -16%*** 35.6 ± 2.29

НСР0.95 3.48

*Плюс куриное яйцо - 20%, дрожжи пивные 1%, поролоновая крошка 8%, вода -50%, кукурузное масло - 5%. **То же, подсолнечное

масло - 5%. ***То же, рапсовое масло - 5%.

Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют о возможности использования гидролизата сои в качестве заменителя соевой муки, а дорогостоящее кукурузное масло можно заменять подсолнечным и рапсовым.

Изучалось влияние дрожжевых добавок к ИПС на выход биомассы S. carpocapsae (табл.3). Все включенные в опыт дрожжевые добавки оказывают одинаковое влияние на развитие нематод

Вестник защиты растений, 1, 2003 в ИПС. В качестве полноценного заменителя пивных дрожжей, как показали полученные данные, могут быть использованы более дешевые пекарские дрожжи.

Таблица 3. Влияние дрожжевых добавок

к ИПС на выход биомассы 5. carpocapsae

ъ- - тдтт п Выход нематод, Компонентный состав ИПС _млн/колбу

Соевая мука-16%, БВК-2.4* Соевая мука -16%, нефтяные дрожжи 2.4% * Соевая мука -16%, пекарские дрожжи - 2.4%* Соевая мука -16%, пивные дрожжи - 1%* *Плюс куриное яйцо - 20%, кукурузное масло - 5%, поролоновая крошка 8%, вода -50%

Установлена прямая зависимость выхода биомассы нематод с ИПС от исходного титра бактериального инокулюма (исходной концентрации бактериальных клеток симбиотических бактерий) (табл.4), описываемая с высокой точностью (Р>0.999) следующим уравнением:

В= 3.9 + 12^ - 1.227D2, (1)

где В - выход биомассы нематод с 70 г ИПС, D - титр бактериального инокулюма.

Таблица 4. Зависимость выхода биомассы

5. carpocapsae от титра бактериальных _клеток в инокулюме_

Количество бактериальных Выход нематод,

клеток, млрд/мл инокулюма млн/колбу

1 15.0 ± 1.80

2 23.6 ± 1.89

4 33.5 ± 0.98

НСР0.95 2.48

Согласно уравнению (1) на рисунке 1 можно видеть, что выход биомассы нематод на 1 мл бактериальной суспензии выше при низких значениях титра бактериального инокулюма. По ряду технологических причин экономичнее титр бактериального инокулюма, равный 3 млрд бактериальных клеток в 1 мл бактериальной суспензии. Так, в интервале от 0.5 до 3 млрд бактерий в 1 мл выход биомассы возрастает в 3 раза (от 10 до 30 млн нематод на 70 г питательной среды) в

19.0 ± 1.58 18.2 ± 0.74 13.6 ± 1.00 10.9 ± 0.69 15.5 ± 0.76

11.0 ± 1.03

11.8 ± 1.48 10.2 ± 0.70 1.59

23.75 ± 5.25 22.72 ± 5.41

30.05 ± 3.48

27.7 ± 3.27

Вестник защиты растений, 1, 2003

то время как в интервале от 3 до 4.5 млрд

бактериальных клеток прирост биомассы

40 1

о Н-1-1-1-1-1-1-1-1-1

0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Титр бактериальных клеток

Рис.1. Зависимость выхода биомассы нематод (млн) 1- S. carpocapsae от титра бактериальных клеток Xenorhabdus пета^зрЫ1ш (млрд/мл), 2- S. feltiae от исходной численности инокулята инвазионных личинок (млн/мл)

Установлено достоверное влияние количества инокулюма нематод 5. feltiae в ИПС на продуктивный выход инвазионных личинок (табл.5). Рассчитано уравнение, описывающее зависимость выхода биомассы нематод (В) от исходного количества инокулюма нематод ф), внесенных в питательную среду (Р>0.999):

В = 23.5-8.13ZD (рис.1). (2)

Таблица 5. Влияние исходной численности инокулята нематод S. feltiae в ИПС на выход биомассы инвазионных личинок

Количество инокулюма Выход нематод,

нематод в расчете на одну колбу с ИПС, млн млн/колбу

1 15.5 ± 0.45

2 19.4 ± 0.80

4 21.6 ± 0.73

НСР0.95 1.00

Содержательный анализ модели показывает, что увеличение дозы инокулюма выше 2 млн (28.5 тыс. в расчете на 1 г питательной среды) не целесообразно.

Результаты изучения влияния дисперсности инертного носителя в составе ИПС на продуктивный выход нематод в процессе культивирования представлены в таблице 6.

нематод составляет всего лишь 13%.

40 1

о -I-1-1-1-1-1

0 0,5 1 1,5 2 2,5 Длина стороны фрагмента, см

Рис.2. Зависимость выхода биомассы нематод S. carpocapsae от дисперсности (длины стороны фрагмента) инертного носителя в составе искусственной питательной среды

Дисперсность инертного носителя оказывает существенное влияние на развитие нематод, при этом с уменьшением размеров инертного носителя выход биомассы нематод прогрессивно нарастает (рис.2). Уравнение, описывающее зависимость выхода биомассы от линейных размеров носителя (Р.д5>0.999), имеет вид:

В = 20 + 2.21^2, (3)

где В - выход биомассы нематод с 70 г ИПС, L - размер стороны куба, мм.

Таблица 6. Результаты статистической оценки влияния дисперсности инертного носителя в составе искусственных питательных сред на выход биомассы 5. carpocapsae

Объем фрагмента поро- Выход нематод,

лоновой крошки, см3 млн/колбу

0.125 29.0 ± 2.14

1 22.2 ± 0.73

8 20.8 ± 1.26

нср0.95 2.22

Оптимальным можно считать размер инертного носителя со стороной куба не более 5 мм. Дальнейшее увеличение объема носителя приводит к резкому снижению биомассы нематод, получаемой с единицы массы питательной среды.

Таким образом, применительно к ус-

ловиям промышленного производства проведена оптимизация процесса культивирования нематод на искусственных питательных средах. Определены оптимальные соотношения инокулюмов бактериальных клеток и инвазионных личинок нематод в расчете на 1 г питательной среды, соответственно, 2.14-108 и 4.2-104 при объеме отдельных фрагментов

Вестник защиты растений, 1, 2003 инертного носителя 0.125 см3.

Установлена возможность использования гидролизата сои в качестве заменителя соевой муки, а дорогостоящее кукурузное масло можно успешно заменять подсолнечным и рапсовым. Пивные дрожжи без снижения эффекта заменяются на более дешевые пекарские.

Литература

Иванова Т.С., Данилов Л.Г., Ивахненко О.А. Распространение энтомопатогенных нематод семейств Steinemematidae и Heterorhabditidae в России и их морфологическая характеристика. /Паразитология, 34, 4, 2000, с.323-334.

Пойнар Дж. О., Веремчук Г.В. Новый штамм энтомопатогенных нематод и географическое распространение Neoaplectana carpocapsae Weiser (Rhabditida: Steinernematidae). /Зоол. журнал, 49, 7, 1970, с.966-969.

Bedding R.A. Low cost in vitro mass production of Neoaplectana and Heterorhabditis species (Nematoda) for field control of insect pests. /Nematologica, 27, 1981, p.109-114.

Bedding R.A. Large scale production, storage and transport of the insectparasitic nematodes Neoaplectana spp. and Heterorhabditis spp. /Ann. appl. Biol., 104, 1984, p.117-120.

Buecher E.J., Popiel I. Liquid culture of the entomogenous nematode Steinernema feltiae with its bacterial symbiont. /J. Nematol., 21, 2, 1989, p.199-200.

Friedman M.J. Commercial production and development. /Entomopathogenic nematodes in biological control. /Eds.: R. Gaugler and H.K. Kaya. - Boca Ration, FL: CRC Press, 1990, p.153-172.

Friedman M.J., Langston S.L., Pollitt S. Mass production in liquid culture of insectkilling nematodes. /Int. Patent WO 89/04602. 1989.

Han R., Wouts W.M. Development of Heterorhabditis spp. strains as characteristics of possible Xenorhabdus luminescens subspecies. /Rev. Nematol., 13, 1990, p.411-415.

Han R., Cao L., Liu X. Effect of inoculation um size temperature and time on in vitro production of Steinernema carpocapsae agriotos. /19 Int. Congr.Entomol., Beijing, June 25 - Jule 4, 1992: Proc.: Abstr., - Beijing, 1992, p.318.

Han R., Cao L., Liu X. Relationship between medium composition inoculum um size, temperature and culture fime in the yields of Steinernema and Heterorhabditis nematodes. /Fundam. and Appl. Nematol., 15, 3, 1992, p.223-229.

Wouts W.M. Mass production of the entomogenous nematode Heterorhabditis heliothidis on artifical media. /Nematologica, 13, 1981, p.467-469.

Xu Jie Lian, Yang Ping, Lu Xiu Ling. Effect on the productivity and virulence of the insecticidal nematode Steinernema glaseri in different media. /Acta Entomol. Sinica, 32, 3, 1989, p.317-321.

NEMATODS OF THE STEINERNEMATIDAE FAMILY OPTIMIZATION OF THE CULTIVATION PROCESS OF THE ENTOMOPATHOGEN (NEMATODA: RHABDITIDA) ON ARTIFICIAL NUTRIENT MEDIA WITH INERT CARRIER

L.G.Danilov, V.G.Airapetian, T.Yu.Nashchekina, V.S.Turitsyn An ingredient composition of artificial nutrient media has been developed for mass production of the nematodes S. carpocapsae and S. feltiae. Based on compounds of both animal and plant origin, these nutrient media ensure an almost 2-fold increase in biomass production of the nematodes S. feltiae from a volume unit of nutrient medium compared with media of purely animal nature. From the viewpoint of nutritive value, hen's eggs may be replaced by egg powder as well as soybean flour may be replaced by pea flour. Bakery yeast may be used as a cheaper substitute for brewer's yeast. The following characteristics are considered to be optimal from the viewpoint of practice: the titre of bacterial inoculum - 3 milliard cells in 1 ml of bacterial suspension; inoculum of invasive larvae - 28.5 thousand per 1 g of nutrient medium, dimension of inert carrier particle with cube side no more than 5 mm.