CC BY
26УДК 576.895.132
Энтомопатогенные нематоды Республики Саха (Якутия): видовой состав и филетические отношения
Н С. Шепелёва
На территории Республики Саха (Якутия) выделены три вида почвенных энтомопатогенных нематод: Steinernema feltiae, S. Kraussei и Heterorhabditis megidis. По результатам филогенетического анализа ITS-участка рибосомальных последовательностей этих нематод выявлены их родственные связи с энтомопатогенными нематодами из других регионов Российской Федерации и сопредельных стран.
Ключевые слова: почвенные энтомопатогенные нематоды, штейнернематиды, гетерорабдитиды, рибосомальные последовательности, филогенетический анализ.
Three species of soil-inhabiting entomopathogenic nematodes were isolated on the territory of the Republic of Sakha (Yakutia): Steinernema feltiae, S. Kraussei и Heterorhabditis megidis. Phylogenetic analysis of ITS-part of ribosomal sequences has revealed relationship of these nematodes with entomopathogenic nematodes isolated in other regions of Russian Federation and neighboring countries.
Key words: soil entomopathogenic nematodes, Steinemematidae, Heterorhabditidae, ribosomal sequences, phylogenetic analysis.
Введение
Почвенные энтомопатогенные нематоды -это представители двух семейств (Steinernema-tidae - штейнернематиды и Heterorhabditidae -гетерорабдитиды) нематод отряда Rhabditida со сходными особенностями жизненного цикла. Свободно обитающая в почве личинка этих нематод проникает внутрь тела почвообитающих стадий насекомых (личинки двукрылых, перепончатокрылых, жуков и др.) и вносит в полость тела хозяина несколько десятков клеток симбиотических бактерий [1]. Каждому из семейств энтомопатогенных нематод свойственны свои специфичные бактерии: у Steinemematidae - рода Xenorhabdus (Thomas and Poinar, 1979), а у рода Heterorhabditidae - Photorhabdus (Boemare, Akhurst and Mourant, 1993). Быстро развивающиеся бактерии вызывают септицемию насеко-мого-хозяина, которое быстро (24-48 ч) погибает. Внутри погибшего насекомого быстро развивающиеся бактерии лизируют все внутренние органы, подавляя за счет выделения антибиотических соединения развитие любой иной микрофлоры [2]. Развивающиеся нематоды питаются самими бактериями и лизированной массой внутренних органов хозяина, производят одно или два поколения (в зависимости от размера насекомого и интенсивности развития самих
ШЕПЕЛЁВА Надежда Семеновна - аспирант Центра паразитологии, Институт проблем экологии и эволюции РАН, zayac_20@mail.ru.
нематод) и порождают в результате инвазионных личинок, опять выходящих в почву. Инвазионные личинки энтомопатогенных нематод представляют собой личинки 3-й стадии в кути-кулярном чехлике личинок 2-й стадии. Штей-нернематиды обычно быстро сбрасывают кутикулу 2-й стадии, тогда как личинки гетерораб-дитид сохраняют кутикулу 2-й стадии на весь период обитания в почве и теряют ее лишь в момент проникновения в насекомого-хозяина через межсегментные складки.
Такой своеобразный жизненный цикл сделал энтомопатогенных нематод привлекательным объектом для разработки методов биологического подавления насекомых-вредителей сельского хозяйства. В настоящее время в различных странах на рынке средств защиты растений предлагаются несколько препаратов, имеющих в своей основе живых личинок энтомопатоген-ных нематод. Эти препараты содержат инвазионных личинок энтомопатогенных нематод разных видов, специализированных к подавлению различных насекомых: почвообитающих личинок двукрылых, личинок жуков, бабочек-плодожорок [3]. Значительный интерес у специалистов, разрабатывающих методы биологического контроля вредителей, вызывают те культуры почвенных энтомопатогенных нематод, которые проявляют активность при особых условиях внешней среды: например, высоких (более 28°С) или низких (менее 15°С) температурах почвы. В связи с этим поиск и выделение
из почвы энтомопатогенных нематод в регионах с низкими среднегодовыми температурами приобретают и прикладное значение. В данной публикации нами приводятся результаты определения 4 культур почвенных энтомопатоген-ных нематод, выделенных на территории Республики Саха (Якутия) в 2007-2010 годах.
Методика исследования
Выделение энтомопатогенных нематод методом живых приманок. Почвенные пробы собирали на пеших или автомобильных маршрутах в окрестностях Якутска (2010 г.) и Алдана (2007 г.). Около 1-2 кг грунта из верхних горизонтов (0-15 см) собирали в полиэтиленовый мешок, который плотно закрывали для предотвращения потери почвой влаги. При транспортировке принимали меры для предотвращения нагрева почвы, используя термостатируе-мый контейнер. Пробы почвы доставляли в лабораторию, где собранную почву разделяли на части объемом 500 мл, для чего почву распределяли (без утрамбовывания!) в пищевые контейнеры соответствующего объема. В почве карандашом делали углубления глубиной 2-3 см, в которые помещали гусениц последнего возраста вощинной моли Galleria mellonella (L.). Гусениц получали в процессе лабораторного культивирования на искусственной среде (мед+глицерин+ мука+дрожжевой экстракт). Погибших гусениц выявляли через 5-7 дней периодическими просмотрами. Гусениц с признаками поражения энтомопатогенными нематодами (ровная коричневатая или желтоватая (реже темно-серая) окраска без пятен, резини-стое внутреннее содержимое трупа насекомого, отсутствие гнилостного запаха от трупа и его содержимого) выкладывали на фильтровальную бумагу в чашки Петри. Бумагу слегка увлажняли для предотвращения потери влаги погибшими гусеницами. При первых признаках миграции нового поколения личинок из трупа насекомого (появление многочисленных движущихся белых личинок на его поверхности) погибших насекомых раскладывали по одному на чашку Петри (обычно пластиковые, диаметром 40 мм), помещенную в контейнер большего размера с тонким слоем воды на дне. Выходящие из насекомого личинки нематод мигрировали на дно контейнера с водой. После 1-2 дней экспозиции суспензию фильтровали на ватном фильтре и хранили в пластиковых флаконах в холодильнике при 4-5°С.
Молекулярно-таксономическое определение энтомопатогенных нематод. Часть суспензии живых инвазионных личинок нематод помеща-
ли в пробирку «Eppendorf» объемом 1,5 мл (общий объем осадка личинок на дне пробирки может быть не более 0,05 - 0,1 мл). Излишнюю воду удаляли тонкой стеклянной пастеровской пипеткой. ДНК из осадка личинок выделяли с помощью колонок Wizard® SV Genomic DNA Purification System по протоколу фирмы «Pro-mega». ПЦР проводили в объеме около 20 мкл с использованием реактивов и по протоколу фирмы «Силекс»- стерильная вода (13,2 мкл), 10х буфер для ПЦР (2 мкл), раствор dNTP (3,2 мкл) , Taq полимераза (0,2 мкл) и по 0,25 мкл праймеров AB28 (5'-ATA-TGC-TTA-AGT-TCA-GCG-GGT-3') и TW81 (5'-GTT-TCC-GTA-GGT-GAA-CCT-GC-3'). Пропись ПЦР: первичная денатурация ДНК при 94°С в течение 3 мин, после чего 9 циклов, состоящих из денатурации при 94°С - 1 мин, отжига при 55°С - 1 мин 30 с и элонгации при 72°С - 1 мин 30 с; затем 24 цикла, состоящие из денатурации при 94°С - 45 с, отжига при 57°С - 1 мин и элонгации цепи при 72°С - 1 мин 20 с; после чего финальная элонгация при 72°С в течение 5 мин. Результаты ПЦР реакции проверяли электрофорезом 1 мкл продукта в 1% агарозном геле (100 V, 80-100 mA, приблизительно 30-40 мин).
ПЦР -продукт очищали электрофорезом в 0,8% агарозном геле (полтора часа). Полоску с продуктом вырезали из геля. Извлечение ДНК из агарозных блоков проводили с помощью набора фирмы «Promega» (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System) по протоколу производителя. Полученную ДНК еще раз очищали преципитацией, добавляя к 200 мкл раствора ДНК 160 мкл 5М раствора ацетата аммония и 1 мл 96% раствора очищенного этанола. После 1 ч инкубации при -70°С осаждали ДНК центрифугированием (13000 об./мин, 15 мин), после чего удаляли надосадочную жидкость и добавляли 700 мкл 80% этанола. После центрифугирования (13000 об./мин, 5 мин) еще раз удаляли на-досадочную жидкость, а осадок (не видимый глазу) подсушивали при 37°С в термоблоке «Термит» (15 мин). Ресуспендировали осадок в 20-30 мкл воды и проверяли количество ДНК в геле с помощью спектрофотометра Nanodrop 2000. Секвенирование проводили в ЦКП «Гено-тех» (бывш. «Геном»), получая результат в виде файлов «ab1», которые читали в программе «Chromas 1.45». Дальнейший анализ последовательностей (построение выравнивания, деревьев, анализ нуклеотидных различий) проводили с использованием программ «Clustal X version 1.81» (Thompson, Gibson, 2000), «Gendoc version 2. 5. 000» и PAUP* 4.0b10. Филогенетический анализ проводили методом максимальной эко-
номии (MP), методом присоединения соседей (NJ) и методом максимального правдоподобия (ML).
Обсуждение результатов
Штейнернематиды
В четырех образцах почвы, собранных в Республике Саха (Якутия), были обнаружены штейнернематиды: а) в пробе, собранной в березняке с примесью ивы близ г. Алдан в 2007 г. Ю.Р. Охлопковым (изолят «Алдан»); б) в пробе из культивируемой огородной почвы близ п. Жатай в 2010 г. (изолят «Жатай»); в) в пробе, взятой на поле под выпасом с плотной дерновиной и высоким содержанием гумуса у аэропорта Маган (изолят «Маган-поле») и г) в пробе (изо-лят «Маган-березняк»), собранной близ дороги Маган-Якутск в березовом перелеске с покровом из опавших листьев и малым количеством травянистых растений из-за активной роющей деятельности грызунов. Молекулярнотаксономическими методами эти пробы определены как Steinernema kraussei (Steiner, 1923) Travassos, 1927 (изолят «Алдан» и изолят «Ма-ган-березняк») и Steinernema feltiae (Filipjev, 1934) Wouts, Mracek, Gerdin et Bedding, 1982 (изолят «Жатай» и изолят «Маган-поле»). Оба эти вида широко распространены по всей Го-
100/100/100
St.oregonense
St.weiseri
88/95/85
97/78/70
100/81/74
71/61/67
100/100/100
95/100/-
96/84/69
I--З^еШае Армения
Т---З^еШае Израиль
----З^еШае Иран
----8^еШае Кабардино-Балкария
----З^еШае Горный Алтай
----З^еШае Япония, о. Хоккайдо
----Б^еШае о. Сахалин
----З^еШае Карачаево-Черкессия
----З^еШае Приморский край
----З^еШае Великобритания А2
----З^еШае Ижевск
----З^еШае Великобритания А1
----81.ГеШае Польша
----81.£еШае Индонезия
----З^еШае Томск
----81.£еШае Бельгия
----З^еШае Швейцария
I--8^еШае Маган поле
Т---З^еШае Жатай
----Б^Пуайсит
□ 81.кгаиз8е1 Алдан
З^кгаиээе! Маган березы
----81:.кгаи88е1 Исландия
----81.кгаи5зе1 Бельгия
----81.кгаиз8е1 Великобритания
----Б^кгашзе! Чехия
----Б^кгаиззе! Италия
----81.кгаи8зе1 Великобритания 216
ларктике, причем для них отмечена определенная стациальная приуроченность: & кгатзё в регионах с умеренным климатом обнаруживаются в основном под пологом леса, тогда как & /вШав чаще выделяют из культивируемой или луговой почвы. На рис. 1 представлены филети-ческие связи выделенных в Якутии штейнерне-матид с другими изолятами этих видов.
На приведенном древе (рис.1) можно видеть, что выделенные в Якутии штейнернематиды образуют в пределах видов 81втвгпвта /вШав и & кгатзвг две обособленные группы. Bootstrap-поддержка единой группы из двух изолятов & /вШав оказывается довольно слабой (71%), тогда как два обнаруженных изолята & кгап88в1 объединяются с довольно сильной поддержкой (95%). Визуальный анализ выравнивания показывает, что якутским & кгаш8в1 свойственны несколько характерных нуклеотидных замен, отличающих их от почти всех остальных представителей этого вида. Определенное сходство может быть выявлено лишь с изолятами из Исландии и северной части Великобритании. У якутских & /вШав имеется уникальная нуклеотидная замена в ГК1 rDNA, не отмеченная для каких-либо других изолятов этого вида.
Изучение поверхности инвазионных личинок изолятов «Жатай» и «Маган-поле» показало характерную для вида & /вШав структуру латеральных полей - с 4 ребрами в центральной части поля и 2 маргинальными (краевыми) ребрами приблизительно такой же высоты (рис.2, 3, Ж). Имеются также невысокие субмаргинальные ребра, лежащие между центральными и маргинальными ребрами. Различимость субмаргинальных ребер зависит от ракурса наблюдения. Эти ребра хорошо заметны на поверхности передней части тела личинок (рис.2, Е), поскольку расстояние между маргинальными и центральными ребрами здесь увеличивается.
Рис.1. Филетические связи изолятов штей-нернематид, выделенных в Республике Саха (Якутия). Уровни статистической поддержки ветвей (bootstrap) даны для трех методов анализа в формате MP/NJ/ML
. 1 , £ о
м ' -Ї-V
% г
% \ £ 1-І « \ ч * V
\ 1 с ЛІГ’
А '
ж І
| Х16Є 100 Мт
Рис.2. Тонкая морфология поверхности энтомопатогенных нематод, выделенных на территории Республики Саха (Якутия): А-В - НеіегогкаЬЛйз ше&Шз, изолят «Соттинцы»: А - хвостовой конец самца, латерально, Б - передний конец инвазионной личинки в момент сбрасывания кутикулы второй стадии, В - кутикулярный шип инвазионной личинки, используемый для проникновения в насекомое; Г-Д - Бґеіпетета ктатзеі изолят «Маган-березняк»: Г - форма тела инвазионных личинок, Д - строение латерального поля инвазионных личинок; Е-З - якутские Бґеіпегпета/еШае: Е - латеральное поле инвазионной личинки в передней части тела, изолят «Маган-поле», Ж - латеральное поле той же личинки в средней части тела, З - латеральное поле инвазионной личинки изолят «Жатай». Линейка в микронах
Г етерорабдитиды
Нами на территории этнографического музея в Соттинцах был выделен единственный изолят гетерорабдитид. Выделение произведено из супеси под отдельно стоящими соснами, в непосредственной близости (10-12 м) от крыльца дома-музея в Ленском государственном историко-архитектурном музее-заповеднике «Дружба»
в Соттинцах. Молекулярно-таксономическое определение показало, что этот изолят относится к широко распространенному в Евразии виду Hвtвrorhabditis mвgidis. Филогенетический анализ тремя различными методами (рис.3) показал, что якутские Н. mвgidis попадают в большую группу евразийских изолятов, выделенных от Москвы до Якутии. Группа получает сущест-
H.megidis Приморский, Шкотово H.megidis Корея, Андонг H.megidis Приморский МБС “Восток” H.megidis Краснодар H.megidis Приморский, Авангард H.megidis Горный Алтай, Артыбаш H.megidis Новосибирск H.megidis Саха-Якутия, Соттинцы H.megidis Чувашия, Чебоксары
H.megidis Москва
Я. Ьасіегіоркога Карачаево-Черкессия Я. ЬасГегіоркога Молдавия Я.
Рис.3. Филетические связи изолята гетерорабдитид, выделенного в Республике Саха (Якутия). Уровни статистической поддержки ветвей (bootstrap) даны для трех методов анализа в формате MP/NJ/ML
венную поддержку по результатам анализа методами присоединения ближайшего соседа и максимального правдоподобия, и лишь метод максимальной экономии дает слабую поддержку этой группы.
Изучение поверхности инвазионных якутских личинок H. megidis подтверждает результаты молекулярно-таксономического определения. Поверхность кутикулы 2-й стадии покрыта характерными продольными ребрами, тогда как поверхность личинки 3-й стадии гладкая, но имеющая два продольных кутикулярных ребра латеральной дифференцировки кутикулы (рис.2, Б). Другим характерным признаком инвазионных личинок гетерорабдитид является наличие мощного зуба на головном конце личинок 3-й стадии. Известно, что эта структура используется инвазионными личинками гетерорабдитид для пробуравливания покровов насекомых [4]. Дополнительным подтверждением корректности молекулярного определения становится строение хвостового конца самцов якутских H. megidis (рис. 2, А) - с характерным расположением генитальных папилл (ребер копулятивной бурсы).
Выводы
Ранее для территории Якутии был отмечен единственный вид энтомопатогенных нематод -
Steinernema feltiae, выделенный из почвы аласов [5]. Наши исследования показывают, что видовое разнообразие нематод этой экологической группы на территории Республики Саха (Якутия) выше и здесь встречаются виды энтомопа-тогенных нематод, широко распространенные по всей лесной части РФ. В то же время молекулярно-филогенетический анализ позволяет обнаружить у якутских изолятов характерные лишь для них нуклеотидные замены. Молекулярно-филогенетический анализ выявил у якутских представителей вида Steinernema feltiae только им свойственные нуклеотидные замены. Нуклеотидные последовательности двух изоля-тов Steinernema kraussei из Республики Саха (Якутия) также указывают на их обособленное положение среди других популяций этого вида.
Работа поддержана грантом РФФИ 11-04-00590а.
Литература
1. Martens E.C., Goodrich-Blair H. The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation // Cellular Microbiology. - 2005. - V. 7. - P. 1723-1735.
2. Isaacson P.J. and Webster J.M. Antimicrobial activity of Xenorhabus sp RIO (Enterobacteriaceae), symbiont of the entomopathogenic nematode, Steinernema riobrave (Rhabditida: Steinernematidae) // Journal of Invertebrate Pathology. - 2002. - 79. - Р. 146-153.
3. Gradinarov D. New Natural Hosts of Entomopathogenic Nematodes (Rhabditida: Steinernematidae,
Heterorhabditidae) from Bulgaria // Acta zool. bulg. -2003. - 55 (3). - Р. 59-64.
4. Nguyen B. Khuong, Hunt. D. Entomopathogenic nematodes: systematics, phylogeny and bacterial symbionts. // Nematology monographs and respectives. -2007. - V. 5. - Р. 611-692.
5. Иванова Т.С., Данилов Л.Г., Ивахненко О.А. Распространение энтомопатогенных нематод семейств Steinernematidae и Heterorhabditidae в России и их морфологическая характеристика // Паразитология. -2000. - Вып.34, №4. - С. 323-334.
Поступила в редакцию 01.02.2013
