CC BY
12УДК 632.937.21
ОПТИМИЗАЦИЯ ПРЕПАРАТИВНЫХ ФОРМ НА ОСНОВЕ МИКРОБОВ-АНТАГОНИСТОВ ДЛЯ ЗАЩИТЫ КАРТОФЕЛЯ ОТ БОЛЕЗНЕЙ
И.И. Новикова*, И.В. Бойкова*, В.А. Павлюшин*, В.Н. Зейрук**, С.В. Васильева**
*Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
**Всероссийский НИИ картофельного хозяйства им. Лорха, Московская обл.
Проведен подбор компонентов и разработаны рецептуры сухой (СП) и жидкой (СК) препаративных форм на основе отселектированного штамма Bacillus subtilis-W5-12/23 для проведения испытаний биологической эффективности в защите картофеля от болезней в полевых условиях и при хранении клубней. Показано, что введение в состав препаративной формы бензоата натрия в концентрации 0.2% обеспечивает жизнеспособность клеток и высокую целевую активность штамма-продуцента в жидкой препаративной форме. Подобран состав сухой препаративной формы, включающий 8% сульфата аммония, 3% лигнинсульфоната натрия и 3% аэросила. Наработаны 2 опытные партии жидкой и сухой препаративных форм нового биопрепарата на основе Bacillus subtilis И-5-12/23 ВИЗР.
Ключевые слова: микробы-антагонисты, фитопатогенные грибы и бактерии, штамм-продуцент, препаративная форма, спорообразующие бактерии, бациллы, опытная партия, биосинтез, ферментация, питательная среда, распылительная сушка, картофель, Bacillus subtilis.
Одна из актуальных проблем ХХ! века -обеспечение растущего народонаселения планеты безопасным продовольствием. На решение этой проблемы направлены усилия и средства многих высокоразвитых стран. В этой связи разработка технологий повышения продуктивности сельскохозяйственных культур за счет эффективной фитосанитарной оптимизации агроэкосистем и применения экологически безопасных средств защиты растений весьма актуальна.
Анализ фитосанитарного состояния посадок картофеля в России указывает на нарастание распространенности и вредоносности многих болезней, таких как фитофтороз, ри-зоктониоз, парша серебристая, сухая гниль, макроспориоз, фомозная гниль. Бактериозы картофеля - черная ножка (Erwinia carotovora), кольцевая гниль (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicum), бурый слизистый бактериоз (бурая гниль) картофеля (Ralstonia solanacearum) - также являются серьезными препятствиями для получения стабильного урожая картофеля высокого качества. По данным ВНИИ картофельного хозяйства, среднегодовой недобор урожая картофеля только от основных заболеваний составляет 29% от валового сбора. Распространенность парши обыкновенной клубней в средней и сильной степени достигает 19-21%, что исключает возможность использования этой части уро-
жая на семенные цели. В хозяйствах, интенсивно возделывающих картофель, в период хранения из-за развития гнилей теряется до 15-20% клубней.
В последние годы проводится активный поиск штаммов для создания новых эффективных микробиологических средств защиты растений, основанных на биологически активных веществах, антибиотиках или живых культурах бактерий-антагонистов возбудителей микозов и бактериозов картофеля и других важнейших сельскохозяйственных культур. Бактерии-антагонисты способны индуцировать системную устойчивость к фитопато-генам. В числе препаратов, действующих на возбудителей бактериозов, можно назвать фунгицид ТМТД, японский синтетический антибиотик Касумин, синтетические препараты Катапол и Катазар. Однако, по мнению ряда специалистов, обработка клубней препаратами на основе живых культур бактерий P. fluorescens, P. putida, B. subtШs, таких, как Га-маир, Алирин-Б, Фитоспорин или Планриз, более эффективна.
Одно из условий высокой эффективности и стабильности биопрепаратов - это качество препаративной формы (Войнова и др., 2009, Логинов и др., 2007).
Правильно подобранная препаративная форма (ПФ) биопрепарата позволяет создать оптимальные условия для доставки д.в. к це-
Вестник защиты растений, 4, 2014 левому объекту, снизить норму расхода препарата на единицу площади, обеспечить равномерное распределение пестицида по обрабатываемой поверхности, продлить сроки его действия, повысить стабильность рецептуры. Современные препаративные формы пестицидов позволяют наилучшим образом реализовать биологический потенциал действующего вещества.
Широкий ассортимент активных соединений с различными физическими, химическими и биологическими свойствами, а также огромное количество вредных организмов - объектов применения, разнообразие способов применения диктуют необходимость создания различных ПФ. Так, смачивающийся порошок, текучая суспензия и многократные эмульсии - улучшенные модификаторами традиционные препараты. К принципиально новым формам относят диспергирующиеся гранулы, суспоэмульсии и микрокапсулы, при получении которых используют новые технологии.
Для изготовления специальных препаративных форм используют различные вспомогательные компоненты: минеральные наполнители, ПАВ, прилипатели, вещества, называемые улучшателями, или модификаторами. Эти компоненты предотвращают расслоение препарата, выпадение осадка в рабочей жидкости, кристаллизацию, пыление и слеживае-мость порошкообразных препаратов, способствуют лучшей смачиваемости самого препарата, препятствуют вспениваемости рабочих суспензий или эмульсий, химическому разложению действующих веществ, коррозии тары и машин, возникновению статического электричества у огнеопасных препаратов, улучшают стабильность в жесткой воде. Реже применяют вещества для маскировки неприятных
Методика
Культуру штамма B.subtilis И-5-12/23 ВИЗР выращивали на искусственной питательной среде следующего состава: кукурузный экстракт (30 г/л), меласса (15 г/л) рН=7.2. Культивирование проводили на лабораторной качалке при 28°С, 220 об./мин., в колбах объемом 750 мл с объемом среды 100 мл в течение 72 часов. Один раз в сутки проводили отбор проб и оценивали развитие культуры с помощью микроскопии (Axio Imager). Биологическую активность культуральной жидкости штамма в отношении тест-культуры определяли с помощью метода лунок. В качестве тест-культур использовали Alternaría solani и Erwinia carotovora, выделенные из растений картофеля.
запахов (дезодоранты) и красители.
В последнее время сформировались следующие основные тенденции в области создания новых препаративных форм:
• переход от традиционных концентратов эмульсий к эмульсионным (текучим) компонентам для уменьшения пожароопасности и дермальной токсичности;
• переход от смачивающихся порошков к суспензионным (текучим) концентратам и во-додиспергирущимся гранулам для получения непылящих, малообъемных, легкоизмеряемых продуктов;
• переход от однокомпонентных к многокомпонентным (смесевым) ПФ, таким, как суспензионные концентраты и суспоэмульсии, которые удобны в обращении и не требуют бакового смешивания;
• введение в ассортимент рецептур с контролируемым высвобождением д.в. (МКС), которые оптимизируют применение СЗР;
• введение в практику водорастворимых упаковок, удобных при приготовлении рабочих составов.
В результате скрининга штаммов бацилл из Государственной коллекции микроорганизмов ГНУ ВИЗР по признаку антагонистической активности в отношении возбудителей болезней картофеля был отобран перспективный штамм B. subtШs - И5-12/23. Цель настоящей работы - подбор оптимальных рецептур сухой и жидкой препаративных форм на основе отселектированного штамма, обеспечивающих жизнеспособность клеток и высокую целевую биологическую активность в течение длительного срока хранения, и наработка опытных партий биопрепарата для проведения испытаний в период вегетации картофеля и хранения клубней.
исследований
Для приготовления жидкой препаративной формы использовали следующие консерванты: бензоат натрия -0.1%, 0.2%, 0.3%; сорбат калия - 0.1%, 0.2%, 0.3%; бензоат натрия + сорбат калия - 0.1%+0.1%; натрий сернистокислый - 0.01%, 0.02%, 0.05%; кальций уксуснокислый - 0.02%, 0.1%, 0.2%; натрий уксуснокислый - 0.02%, 0.1%, 0.2%.
Приготовление консервантов: 1) готовили растворы бензоата натрия и сорбата калия в концентрации 10%, затем приготовленные растворы вносили в культуральную жидкость штамма для достижения рабочей концентрации 0.1%, 0.2% и 0.3%; 2) готовили растворы натрия серни-стокислого, кальция уксуснокислого и натрия уксусно-
кислого в концентрации 10% и 1%, затем вносили в куль-туральную жидкость штамма для достижения рабочей-концентрации 0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.1% и 0.2%.
Наработку опытных партий проводили в ферментере объемом 100 л, полезным объемом 80 л. Штамм культивировали в течение 72 часов, после чего концентрировали культуральную жидкость методом фильтрации или сепарирования с последующим получением сухой и жидкой
Результаты
Для оптимизация состава препаративных форм заложены лабораторные модельные опыты. Проведено глубинное культивирование штамма-продуцента Bacillus subtilis И-5-12/23 ВИЗР на кукурузно-мелассовой среде. Титр жизнеспособных клеток по окончании ферментации составил 5х 1010К0Е/мл, диаметр зоны отсутствия роста тест-культур Alternaria solani и Erwinia carotovora - 35-40 мм. Полученные образцы жидких препаративных форм заложены на хранение при +40С и при комнатной температуре. На основании полученных результатов выбран оптимальный состав препаративной формы в виде суспензионного концентрата (СК): концентрат биомассы с добавлением бензоата натрия в концентрации 0.2%. Полученные образцы сухой препаратив-
препаративных форм.
Для получения сухой препаративной формы культураль-ную жидкость высушивали. Сепарацию биомассы проводили мембранным методом, высушивание - распылительным. Перед сушкой в концентрат культуральной жидкости добавили 8% хлорида натрия, 3% лигнинсульфоната натрия (аэросил вЮг х пН20, производство Китай). Температура на входе 140°С, на выходе 80°С.
исследований
ной формы также заложили на хранение при комнатной и пониженной температуре.
Ежемесячно осуществляют контроль титра жизнеспособных клеток и антагонистической активности заложенных на хранение образцов. Анализ результатов показал, что через 3 месяца хранения при нормальной и пониженной температуре титр жизнеспособных клеток и антагонистическая активность в образцах не изменились.
Полученные результаты исследований позволили оптимизировать состав сухой препаративной формы в виде смачивающегося порошка (СП): распылительно высушенный концентрат биомассы с добавлением 8% сульфата аммония, 3% лигнинсульфоната натрия, 3% аэросила.
Наработка опытных партий жидкой и сухой препаративных форм для испытания эффективности против болезней картофеля при вегетации и в условиях хранения
Для проведения лабораторных и полевых испытаний на вегетирующих растениях картофеля и в период хранения клубней были наработаны опытные партии жидкой и сухой препаративных форм.
Посевной материал в течение 24 часов выращивали на искусственной питательной среде следующего состава: кукурузный экстракт (30 г/л), меласса (15 г/л), рН - 7.2 в колбах объемом 750 мл, объем среды 100 мл, при температуре 28оС на круговой качалке. Посев в колбы проводили 10-и суточной культурой с пробирок со скошенным агаром. Качество посевного материала контролировали микроскопией в световом микроскопе.
Ферментацию проводили в аппарате объемом 100 л, объем ферментационной питательной среды - 80 л. Объем посевного материала -1.0 л (10 колб). Состав питательной среды аналогичен составу посевной среды.
Процесс ферментации вели в течение 72 часов при температуре 28оС и постоянном пе-
ремешивании (220 об/мин). Расход воздуха 0.8 м3/час = 1.3 об/об среды в минуту. Отбор проб производили через 6, 12, 18, 24, 36, 48, 60, 72 часа после начала культивирования. Пробы исследовали микроскопированием в световом микроскопе, изучали морфологические особенности культуры, определяли наличие посторонней микрофлоры.
Как показали полученные данные, развитие глубинной культуры происходило активно, и к 48 часам роста клетки штамма B.subtШs И-5-12/23 ВИЗР начали дифференцироваться: наблюдались клетки с неокрашенной средней частью и большое количество проспор. К 72 часам роста культура перешла к массовому спорообразованию, количество проспор не превышало 10%, вегетативные клетки встречались в единичном количестве. Титр жизнеспособных клеток составил 4х1010К0Е/мл.
Контроль антагонистической активности глубинной культуры в процессе ферментации и опытных партий препарата осуществляли
Вестник защиты растений, 4, 2014 методом лунок по диаметру отсутствия роста тест-культур. Как показал анализ, культураль-ная жидкость штамма-продуцента в отношении тест-культур Alternaria solani и Erwinia carotovora была активна уже на 1 сутки глубинного выращивания штамма. В течение последующих 3-х суток культивирования антагонистическая активность не снижалась. Диаметры зоны отсутствия роста тест-культур составил 30-40 мм.
Объем культуральной жидкости на сливе
составил 78 л. Концентрирование культураль-ной жидкости производили с помощью сепаратора, оснащенного пористой мембраной, размер пор 0.4 мкм.
Из полученного концентрата биомассы получено две опытные партии препаративных форм для проведения испытаний биологической эффективности в отношении возбудителей болезней картофеля в условиях вегетации и при длительном хранении клубней. Характеристики опытных партий представлены в таблице.
Таблица. Характеристика опытных партий препаративных форм на основе перспективных штаммов-продуцентов биопрепарата для защиты картофеля от болезней
Опытная партия препаративной формы на основе штамма Bacillus subtilis И-5-12/23 Масса опытной партии, г, л Титр жизнеспособных клеток (КОЕ/мл, г) Антагонистическая активность, диаметр зоны отсутствия роста, мм
Alternaria solani Erwinia carotovora
Сухая препаративная форма (СП) Жидкая препаративная форма (СК) 1430.2 5.0 7x10" 1.5х1010 34 ± 0.4 36 ± 0.3 30 ± 0.5 35 ± 0.4
Выводы
1. Заложен модельный лабораторный опыт по оптимизации состава жидкой (СК) и сухой (СП) препаративных форм на основе штамма-продуцента Bacillus subtilis И-5-12/23 ВИЗР.
2. Разработаны рецептуры сухой препаративной формы (СП) и жидкой препаративной формы (СК) для проведения испытаний био-
логической эффективности в лабораторных и полевых условиях.
3. Для проведения лабораторных и полевых испытаний на вегетирующих растениях картофеля и в период хранения клубней наработаны 2 опытные партии жидкой и сухой препаративных форм.
Работа выполнена по государственному контракту № 14.М04.12.0006 шифр «2014-14-М.04-0006»по теме: «Разработка технологий получения и применения биопрепаратов для защиты растений от грибных и бактериальных болезней»
Литература
Антипова Т.В., Желифонова В.П., Баскунов Б.П., Озерская С.М., Иванушкина Н.Е., Козловский А.Г.. Новые продуценты биологически активных соединений - грибы рода Pénicillium, выделенные из вечной мерзлоты // Прикл. биохимия и микробиология, 2011, 47, 3, с. 373-385.
Войнова О.Н., Калачёва Г.С., Гродницкая И.Д., Воло-ва Т.Г. Микробные полимеры в качестве разрушаемой основы для доставки пестицидов // Прикл. биохимия и микробиология, 2009, 45, 4, с. 427-431.
Зайцева Т.В. Использование биопрепаратов для контроля серебристой парши на картофеле // Защита и карантин растений, 2014, 8, с. 33-34.
Кожемяков А.П., Тимофеева С.В., Попова Т.А. Разработка и перспективы использования биопрепаратов комплексного действия. // Защита и карантин растений, 2008, 2, с.42.
Логинов О.И., Васильева Н.С., Силшцев H.H. Получение сухой препаративной формы биопрепарата сельскохозяйственного назначения «Елена» // Башкирский химический журнал, 2007, 12, 2, с. 45-47.
Логинов Я.О., Худайгулов Г.Г., Четвериков С.П., Ме-лентьев А.И., Логинов О.Н. Биополимер альгинатной природы с преобладанием L-гиалуроновой кислоты // Прикл. биохимия и микробиология, 2011, 47, 3, с. 302-310.
Максимов И.В., Абизгильдина Р.Р., Пусенкова Л.И. Стимулирующие рост растений микроорганизмы как альтернатива химическим средствам защиты от патогенов (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология, 2011, 47, 4, с. 373-385.
Новикова И.И. Эффективность препаративных форм на основе микробов-антагонистов в системах защиты растений от болезней // Материалы 3-го Всероссийского съезда по защите растений, СПб, 2013а.
Новикова И.И. Биологическое разнообразие микроорганизмов - основа для создания новых полифункциональных биопрепаратов для фитосанитарной оптимизации аг-роэкосистем// Материалы 3-го Всероссийского съезда по защите растений, СПб, 20136
Ревина Т.А., Парфёнов И.А., Гвоздева Е.Л., Герасимова Н.Г., Валуева Т.А. Ингибитор химотрипсина и трипсина из клубней картофеля // Прикл. биохимия и микробиология, 2011, 47, 3, с. 373-385.
Сатарова Т.Г., Каменёк Л.К. Препарат для защиты клубней картофеля во время хранения // Защита и карантин растений, 2009, 2, с. 50-52.
Свиридов А.В., Просвиряков В.В., Коломиец Э.И. и др. Эффективность бетапротектина для защиты сахарной свеклы от кагатной гнили // Защита и карантин растений,
44
2011, 11, с. 22.
Ступарь О.С., Шуляковская И.Н. Эффективный биофунгицид для защиты сельскохозяйственных культур // АГРО XXI, 2011, 6, с. 34-39.
Франк Р.И., Кищенко В.И. Биопрепараты в современном земледелии // Защита и карантин растений, 2008, 4, с. 89-90.
Compant S., Brader G., Muzammil S., Sessitsch A., Lebrihi A., Mathieu F. Use of beneficial bacteria and their
secondary metabolites to control grapevine pathogen diseases // BioControl, 2013, 58, р. 435-455.
Manidipa R., Dutta S., Venkata R. Pseudomonads: Potential Biocontrol agents of Rice Diseases // Research Journal of Agriculture and Forestry Sciences,October (2013), 1(9), р. 19-25.
Pushpalatha K.C. Biocontrol Efficiency of Trichococcus spp. against Seed-borne Fungal Pathogen // International Journal of Biotechnology and Bioengineering Research, 2013, 4, 7, р. 665-670.
OPTIMIZATION OF FORMULATIONS ON THE BASIS OF MICROBES - ANTAGONISTS FOR PROTECTION OF POTATOES AGAINST DISEASES I.I.Novikova, I.V.Boykova, V.A.Pavlyushin, V.N.Zeyruk, S.V.Vasilyeva, Different dry and liquid formulations of new biopreparation for potato protection are tested. Optimum components of nutrient medium are selected.
Keywords: microbes antagonists, phytopathogenic fungi and bacteria, strain producer, formulation, biosynthesis, fermentation, nutrient medium, potatoes, Bacillus subtilis.
B.A.naB^romHH vizrspb@mail.ru H.H.HoBHKOBa Irina novikova@inbox.ru
H.B.EoHKOBa Irina boikova@mail.ru B.H.3enpyK vzeyruk@mail.ru
C.B.BacH^beBa vzeyruk@mail.ru
