CC BY
5
Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Физика. 2024. Т. 24, вып. 2. С. 150-160 Izvestiya of Saratov University. Physics, 2024, vol. 24, iss. 2, pp. 150-160
https://fizika.sgu.ru
https://doi.org/10.18500/1817-3020-2024-24-2-150-160, EDN: YJIWQU
Научная статья
УДК 60:543.645.6:591.342.5
Оптимизация методов выделения и идентификации пептидов, выделенных из личинок НегтеШШисепз
О. С. Ларионова3, Я. Б. Древко, Н. Д. Тычинин, Л. С. Крылова, Б. И. Древко, С. В. Ларионов '
Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии имени Н. И. Вавилова, Россия, 410012, г. Саратов, пр-кт им. Петра Столыпина, зд. 4, стр. 3
Ларионова Ольга Сергеевна, доктор биологических наук, заведующий кафедрой микробиологии и биотехнологии, [email protected], https:// orcid.org/0000-0001-5457-0306
Древко Ярослав Борисович, кандидат химических наук, доцент кафедры микробиологии и биотехнологии, [email protected], https://orcid.org/0000-0003-4007-2140
Тычинин Николай Дмитриевич, аспирант 2-го года обучения кафедры микробиологии и биотехнологии, [email protected], https://orcid.org/ 0009-0001-5620-4550
Крылова Любовь Сергеевна, ассистент кафедры микробиологии и биотехнологии, [email protected], https://orcid.org/0000-0002-5140-3008
Древко Борис Иванович, доктор химических наук, профессор кафедры микробиологии и биотехнологии, [email protected], https://orcid.org/0000-0002-7025-1097
Ларионов Сергей Васильевич, доктор ветеринарных наук, член-корреспондент РАН, профессор кафедры «Болезни животных и ветеринарно-санитарная экспертиза», [email protected], https://orcid.org/0000-0001-5024-161X
Аннотация. Данная статья посвящена выделению и идентификации водорастворимых пептидов, выделенных из биомассы личинок черной львинки Hermetiaillucens. Цель этого исследования заключалась в оптимизации метода выделения и контроля белковых фракций для их препаративного получения. Установлено, что при помощи эксклюзионной хроматографии с использованием сит с размером пор 3.5 и 7 кДа получены белковые фракции с соответствующим интервалом молекулярных масс. При разделении анализируемых фракций методом высокоэффективной жидкостной хроматографии получена смесь трех пептидов с отличием в хроматографическом времени удерживания менее 1 минуты, что было подтверждено тремя параллельными экспериментами по выделению и очистке пептидов. Поскольку белковые фракции 1 и 2 имели сходные значения, а первая и третья - меньшую разницу во времени удерживания, полного разделения данныххроматографических пиков не происходило. Поэтому в дальнейшем из-за сходных физико-химических свойств нами было решено не разделять данные три белковые фракции с различными временами удерживания, а проводить исследования со смесью пептидов. Методом динамического рассеяния света установлено, что размер белков составил от 68 до 141 нм в белковой фракции 1, от 37 до 79 нм в белковой фракции 2 и от 43 до 122 нм в белковой фракции 3. Таким образом, авторами был разработан алгоритм выделения водорастворимых пептидов из личинок насекомых, основанный на разделении белков с использованием диализных мембран и дальнейшим подтверждением их состава и очистки методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектором и методом динамического рассеяния света.
Ключевые слова: водорастворимые пептиды, высокоэффективная жидкостная хроматография, ультрафиолетовый детектор, динамическое рассеяние света
Благодарности: Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 22-26-00167, https://rscf.ru/project/22-26-00167/).
Для цитирования: Ларионова О. С., Древко Я. Б., Тычинин Н. Д., Крылова Л. С., Древко Б. И., Ларионов С. В. Оптимизация методов выделения и идентификации пептидов, выделенных из личинок Hermetia illucens // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Физика. 2024. Т. 24, вып. 2. С. 150-160. https://doi.org/10.18500/1817-3020-2024-24-2-150-160, EDN: YJIWQU Статья опубликована на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International (CC-BY 4.0)
Optimization of methods for isolation and identification of peptides isolated from Hermetia illucens larvae O. S. LarionovaH, Ya. B. Drevko, N. D. Tychinin, L. S. Krylova, B. I. Drevko, S. V. Larionov
Saratov State University of Genetics, Biotechnology and Engineering named after N.I. Vavilov, 4 zd., 3 str. Petra Stolypina prosp., Saratov 410012, Russia
Olga S. Larionova, [email protected], https://orcid.org/0000-0001-5457-0306 Yaroslav B. Drevko, [email protected], https://orcid.org/0000-0003-4007-2140
Article
© Ларионова О. С., Древко Я. Б., Тычинин Н. Д., Крылова Л. С., Древко Б. И., Ларионов С. В., 2024
Nikolay D. Tychinin, [email protected], https://orcid.org/0009-0001-5620-4550 Lyubov S. Krylova, [email protected], https://orcid.org/0000-0002-5140-3008 Boris I. Drevko, [email protected], https://orcid.org/000-0002-7025-1097 Sergey V. Larionov, [email protected], https://orcid.org/0000-0001-5024-161X
Abstract. Background and Objectives: The development of resistance of microorganisms to existing antibacterial agents requires constant updating of existing drugs and research in the search for alternative sources of active substances. In recent years, the problem of the emergence of microorganisms resistant to all existing antimicrobial drugs has become systematic and requires significant attention from researchers to search for alternative sources of active substances. The main problem in the development of drugs based on antimicrobial peptides is the search for optimal solutions in the preparation of these substances. Therefore, optimization and search for methods of isolation, analysis and control of protein fractions of water-soluble peptides used for the subsequent development of antibacterial drugs based on them is an urgent task. Materials and Methods: Optimal conditions and methods have been selected for the preparative production of water-soluble peptides isolated from the biomass of Hermetiaillucens larvae. Optimization and search of methods for isolation, analysis and control of protein fractions of these water-soluble peptides will ensure the accuracy of the results and obtain optimal amounts of protein fractions. Results: It has been found that the use of molecular sieves makes it possible to obtain a mixture of three peptides with a difference in chromatographic retention time of less than 1 minute, which has been confirmed by three parallel experiments on the isolation and purification of peptides. During HPLC it has been noted that protein fractions 1 and 2 have similar values and the first and third protein fractions have a smaller difference in retention time, which is why there is no complete separation of these chromatographic peaks. Comparison of the percentage of the area of the peptides obtained allows us to talk about the possibility of obtaining peptides of the same size from H. illucens larvae by HPLC, and in combination with DLS to obtain protein fractions with very similar physicochemical and physical characteristics, since this type of chromatography separates substancesaccording to their size. Conclusion: The use of high-performance liquid chromatography makes it possible to establish the reproducibility of the method of isolation of antimicrobial peptides by cold extraction with water and further stages of protein purification, salting and molecular sieve chromatography, which, in correlation with DLS analysis, makes it possible to reliably identify the peptides obtained, and the developed technology of isolation and purification makes it possible to produce these proteins on an industrial scale at low cost. Keywords: water-soluble peptides, high-performance liquid chromatography, ultraviolet detector, dynamic light scattering Acknowledgments: The research was supported by the Russian Science Foundation (project No. 22-26-00167, https://rscf.ru/project/22-26-00167/).
For citation: Larionova O. S., Drevko Ya. B., Tychinin N. D., Krylova L. S., Drevko B. I., Larionov S. V. Optimization of methods for isolation and identification of peptides isolated from Hermetia illucens larvae. Izvestiya of Saratov University. Physics, 2024, vol. 24, iss. 2, pp. 150-160 (in Russian). https://doi.org/10.18500/1817-3020-2024-24-2-150-160, EDN: YJIWQU
This is an open access article distributed under the terms of Creative Commons Attribution 4.0 International License (CC0-BY 4.0)
1. Актуальность
Развитие резистентности микроорганизмов к представленным на фармацевтическом рынке антибактериальным средствам требует постоянного обновления существующих препаратов и проведения исследований в области поиска альтернативных источников действующих веществ. Следует отметить, что первый задокументированный прецедент резистентности микроорганизмов при антимикробной терапии у людей был зарегистрирован в 1940-х годах для пенициллина, что произошло всего через несколько лет после его коммерциализации [1]. Однако в последние годы проблема появления микроорганизмов, устойчивых ко всем существующим антимикробным препаратам, приобрела систематический характер и требует существенного внимания от исследователей к поиску альтернативных источников действующих веществ [2-5]. Исследования, направленные на получение антимикробных пептидов (АМП) с заданными свойствами, являются в настоящее время одним из актуальных направлений в мировой фармацевтике, что связано с их высокой эффективностью и низкой вероятностью
селекции устойчивых к АМП штаммов микроорганизмов. На данный момент времени поиск антимикробных пептидов, выделяемых из насекомых, интересует мировое научное сообщество, что подтверждается выделением пептидов, обладающих антимикробной активностью к Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Bacillus coagulans, Citrobacter freundii, Francisella tularensis, Streptococcus sanguinis и Staphylococcus aureus [6-11]. Также некоторые пептиды показывали свою высокую эффективность в отношении вирусов, препятствуя их репликации [12, 13]. Исследования антибактериальной активности пептидов, выделенных из личинок, сосредоточены на корреляции отдельных фракций, полученных из различных видов насекомых, против ряда грамположитель-ных и грамотрицательных бактерий [14-22]. Вместе с тем основной проблемой в разработке препаратов на основе антимикробных пептидов является поиск оптимальных решений для препаративного получения данных субстанций.
Изыскание оптимальных методов выделения, анализа и контроля белковых фракций водорастворимых пептидов, используемых для после-
дующей разработки антибактериальных препаратов на их основе, является актуальной задачей.
2. Материалы и методы
Получение водорастворимых пептидов из биомассы личинок черной львинки H. illucens проводили в несколько стадий. Первоначально выполняли гомогенизацию биомассы с дальнейшей экстракцией водорастворимых пептидов дистиллированной водой с последующим центрифугированием для отделения побочной липидной фракции. На втором этапе использовали метод высаливания белков сульфатом аммония [23]. Далее проводили разделение пептидов при помощи эксклюзионной хроматографии при использовании сит с размером пор 3.5 и 7 кДа (MEMBRA-CEL, Франция). В качестве подвижной фазы использовали дистиллированную воду для снижения негативного влияния солевых растворов и других веществ на белки. Содержание белка в исследуемых фракциях определяли по методу Лоури на спектрофотометре «ShimadzuUV-1280» (Shimadzu Corporation, Япония) при длине волны 450 нм [24].
В дальнейшем для более четкой идентификации нами использовался метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ-детектором (стайер-Аквилон, Россия). Хромато-графический анализ химической чистоты получаемых пептидов осуществлялся на хроматографе Стайер Аквилон (Аквилон, Россия) с УФ-детек-тором и колонке BioSep-SEC-s2000 (Phenomenex, США) при использовании в качестве элюен-та дистиллированной воды и скорости потока 0.5 мл/мин и длине волны 254 нм. Изучение размера полученных пептидов после разделения на диализных мембранах проводили методом динамического рассеяния света (ДРС) на приборе Zetasizer (Malvern Instruments, Великобритания). Все измерения проводились в 10-миллиметровой кювете, в качестве растворителя использовали дистиллированную воду. Исследования проводили на базе центра коллективного пользования «Симбиоз» с применением научного оборудования в области физико-химической биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов - обособленного структурного подразделения Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра «Саратовский научный центр Российской академии наук» (г. Саратов).
3. Результаты и их обсуждение
Получение новых антибактериальных веществ является актуальной задачей в связи с ростом числа антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов и необходимостью поиска новых решений для эффективного лечения инфекционных заболеваний. Однако для успешного решения задачи получения новых антибактериальных веществ необходимо подобрать оптимальные методы для определения чистоты получаемых соединений. В том числе для АМП на данный момент времени не разработано достаточно достоверных методов анализа, позволяющих идентифицировать и определять чистоту соединений. Для идентификации пептидов нами предлагался метод динамического рассеяния света, который позволяет достаточно достоверно определить размер частиц и наличие микропримесей в растворе [25]. Однако для определения чистоты продукта наиболее эффективным способом, принятым в мировой фармакопее, является хроматография. Для определения и разделения белков нами была выбрана жидкостная хроматография, так как использование газовой хроматографии теоретически невозможно в связи с необходимостью перевода исследуемого образца в газообразное состояние, что достигается за счет использования высоких температур и не может быть применено к белкам. Наиболее распространенным и достоверным способом определения чистоты получаемых веществ с невысокой температурой разложения является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, который и применяется в повседневной фармацевтической практике. Для анализа полученных пептидов нами в качестве элюента использовался раствор фосфатно-солевого буфера, что было связано не с его ионной силой или разделяющей способностью, а необходимостью создания одинаковых условий хроматографи-рования по водородному показателю, который соответствовал при анализе рН = 7.4. Колонкой для анализа была выбрана BioSep-SEC-s2000. Среди различных методов хроматографии хроматография исключения размера (SEC) может рассматриваться как основной метод определения характеристики белков на основе молекулярной массы [26]. SEC представляет собой неразрушаю-щий метод разделения, который может разделять и количественно оценивать белковые смеси, и поэтому он наиболее ценен для контроля качества в производстве белка и для разработки процесса очистки биофармацевтических препаратов. На данный момент времени одной из наиболее
распространенных проблем, связанных с идентификацией биофармацевтических препаратов на основе белка, является изменение структуры белка более высокого порядка, приводящее к постоянному частичному разрушению или агрегированию. В последние годы большое внимание уделялось агрегации белка, поскольку она может повлиять на активность и растворимость белка или даже вызвать нежелательные иммунные реакции [27, 28]. Таким образом, можно предполагать, что для терапевтического применения белков возможность их агрегации представляется важной проблемой, предопределяя тем самым значительный интерес к методам их идентификации и изучения физико-химических характеристик [29].
Одним из наиболее успешно используемых методов разделения является жидкостная хроматография с использованием колонок, разделяющих белки в зависимости от их размера, т. е. в соответствии с их гидродинамическим радиусом за счет взаимодействия с пористой структурой хромато-графической колонки. Белки с высокой массой при прохождении колонки не попадают в поры и выходят первыми, а молекулы меньшего размера могут задерживаться в порах колонки и, как следствие, иметь большее время удерживания. Чтобы достичь
необходимой дифференциации во времени хроматографии, колонка должна иметь достаточно большое количество пор и однородность. В отличие от других режимов хроматографии, SEC полагается на отсутствие какого-либо взаимодействия между анализируемым раствором и подвижной фазой. Основные принципы данной хроматографии описаны в литературе [30, 31]. SEC является идеальным решением для отделения и анализа белков от загрязняющих веществ, которые могут включать в себя агрегаты, клеточный мусор и другие примеси, возникающие в результате деградации с минимальной подготовкой образца. Кроме того, SEC может использоваться для оценки молекулярной массы с использованием калибровочных стандартов или абсолютных методов (рассеяние света) или для очистки образца.
Оптимальная скорость потока элюента нами была определена в 0.5 мл/мин, петля составляла 71.2 мкл. Анализ белковых фракций без разделения (без этапа проведения эксклюзионной хроматографии при использовании сит) показал наличие широкого спектра примесей (рис. 1).
Однако использование молекулярных сит позволило получить смесь трех пептидов с отличием в хроматографическом времени удерживания менее 1 мин (рис. 2-4), что было
Рис. 1. Хроматограмма белковых фракций, выделенных из биомассы личинок H illucens без разделения (цвет онлайн) Fig.1. Chromatogram of protein fractions isolated from the biomass of H. illucens larvae, without separation (color online)
шЛР
12- ...
10- ...
5- | | ...
6- И'J ...
4- 5 ---
2- -- Ч"! --
1
■ i V—l
t 2 3 4 6 7 S 9 10 11 12 13 14 11 16 J 7 IS 19 20 21 22 23 24 25 26 7 2S 29 30 ■TdEU-
РЕЗУЛЬТАТЫ РАСЧЕТА Метод расчета: Абсолютная концентрация
Станцарт: Нет
Ho Время Пложапь Пложадь
мин irAU+сек %
1 3.025 96,40 30.00
2 3.85 16.45 5.12
3 4.329 43.91 15.22
4 5.77 143.53 46,22
5 7.355 11.04 3. 44
5 30.01 321.34 100.00
Рис. 2. Хроматограмма белковой фракции 1, выделенной из биомассы личинок H. illucens (цвет онлайн) Fig. 2. Chromatogram of the protein fraction 1 isolated from the biomass of H. illucens larvae (color online)
J ___
■ —
-- J
1 П 1 : ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! " I"4"! ! ! . 7
0 1 2 3 4 5 6 7 f 9 10 11 12 13 14 15 16 Г IS 19 20 21 22 23 24 25 26 21 29 30 МШ-.
FE ЗУЛЫАТЫ РАСЧЕТА Метод расчета: Абсолютная концентрация
Стандарт: Нет
No Время Пложапь Пложапь
МИД irAU+сек %
1 3.056 81. 53 21.90
2 4,275 56.39 15.14
3 5.753 234.54 62. 96
3 30.01 372.52 100.00
Рис. 3. Хроматограмма белковой фракции 2, выделенной из биомассы личинок H. illucens (цвет онлайн) Fig. 3. Chromatogram of the protein fraction 2 isolated from the biomass of H. illucens larvae (color online)
Рис. 4. Хроматограмма белковой фракции 3, выделенной из биомассы личинок H. illucens (цвет онлайн) Fig. 4. Chromatogram of the protein fraction 3 isolated from the biomass of H. illucens larvae (color online)
подтверждено тремя параллельными экспериментами по выделению и очистке пептидов из той же биомассы (табл. 1).
Следует отметить, что при проведении эксперимента в трех повторностях при соотношении белковой фракции 1 и белковой фракции 2 регистрировали более сходные значения, а отличие от белковой фракции 3 заключалось в том, что полученные белковые фракции 2 и 3 имели меньшую разницу во времени удерживания, из-за чего полного разделения данных хрома-тографических пиков не происходило. Поэтому далее нами было принято решение не разделять данные три белковые фракции с различным
временем удерживания из-за сходных физико-химических свойств, а проводить исследования динамического рассеяния света со смесью пептидов.
Сравнение выхода фракции по площади анализируемых пептидов позволяет предположить возможность получения пептидов одинакового размера из личинок Н. Шисет вышеуказанным методом выделения и очистки, а в сочетании с ДРС (рис. 5-7) - получение белковых фракций, обладающих очень близкими физико-химическими и физическими характеристиками, так как данный вид хроматографии производит разделение веществ в соответствии с их размером [32].
Таблица 1 / Table 1
Сравнительная характеристика белковых фракций, полученных из биомассы личинок H. illucens
методом ВЭЖХ
Comparative characteristics of protein fractions obtained from the biomass of H. illucens larvae by HPLC
№ образца/ Sample no. Время удерживания белковой фракции, мин / Retention time of protein fraction, min Площадь пика белковой фракции, мВА с / The peak area of the protein fraction, mAU-с
фракция 1 / fraction 1 фракция 2/ fraction 2 фракция 3/ fraction 3 фракция 1 / fraction 1 фракция 2/ fraction 2 фракция 3/ fraction 3
1 3.02 3.85 4.33 96.4 65.36 148.53
2 3.06 4.28 5.76 81.58 56.39 234.54
3 3.16 5.18 5.83 46.94 112.38 92.35
M ± m 3.08 ± 0.08 4.44 ± 0.77 5.31 ± 0.96 74.97 ± 28.72 78.04 ± 34.03 158.47 ± ± 81.04
Z-Average (mn|: 829,453
Standard Deviation: О
%SM Deviation. 0
Variance: 0
Derived Count Rate fkcps): 170402.273077..
Standard Deviation: 0
%Std Deviation: 0
Variance: 0
Eize Main Et= CSV
d.rem K.rybs' N.rvbs'::
0.4050 5.0
■14632 0.0
0.53S5 0.0
0.6213 0.0
0.71Э6 0.0
■3,5332 0.0
■3.9649 0.0
1.H7 0.0
1,294 0.0
1.499 0.0
1.736 0.0
2,010 0.0
2.325 0.0
2.6S6 0.0
3,122 0.0
3,616 0.0
4,157 0.0
4.545 0.0
Era 1'мг Et= CSV
1 ПГГ N.rybs' N.rvbs'::
5 F-5 5.0
6.633 0.0
7,631 0.0
8,721 0.0
10.10 0.0
11,70 0.0
"3.J4 0.0
t5,63 0.0
18,17 0.0
21.01 0.0
24.36 0.0
28,21 0.0
32,67 0.0
37. Б4 0.0
43,52 0.0
63.76 0.0
63.77 0.0
3B.ee 4.9
Eize 1'мг Std CSV
1 n m N.rvbs' Г: N.~bsr : =
75.52 19,3
91,23 30,6
106,7 25,6
122,4 12,7
141.8 З.Э
164,2 0,6
193.1 0.0
223.2 0.0
255,0 0,0
295,3 0.0
342,0 0.1
396,1 0,3
455.7 0.6
631,2 0.7
615,1 0,5
7" 2 4 0.3
526,0 0.1
965,4 0.0
See Mesn Std CSV
d.nm N.rybs' Г: N.rvbs' : =
ttoe 3.0
128t 0.0
14-54 0,0
1718 0.0
1353 0.0
2336 0,0
2669 0.0
30S1 0.0
355-0 0,0
4146 0.0
4501 0.0
556-3 ■5,0
6439 0.0
74E6 0.0
5635 0,0
1.033=4 0.0
Statistics Graph (1 measurements)
_ 30
if
I
100
Size r d nrn)
Mean . rth +/-1 Standard Deviation error bai
Рис. 5. Изучение белковой фракции 1, выделенной из биомассы личинок H illucens методом ДРС (цвет онлайн) Fig. 5. Study of protein fraction 1 isolated from the biomass of H. illucens larvae by the DLS method (color online)
Z-Average (rim): 1074,773
Standard Deviation: 0
Я-i Sid Deviation: 0
Variance: 0
Derived Count Rate (kcps): 355,380835549..
Standard Deviation: 0
toStd Deviation: 0
Variance: 0
Ess Meal
d.rrn N.rrDS'
0,4000 0.0
0,4632 0,0
0,5365 0.0
0,6213 0,0
0,7196 0.0
9.4332 0.0
■5.5649 0.0
1.117 0.0
1,294 0,0
1,499 0.0
1,736 0.0
2,010 0.0
2,323 0.0
2,6=6 0,0
3,122 0.0
3,616 0,0
4.157 0.0
4,-549 0.0
Std Osv N.rvbs' ::
Ess Meal Std Csv
d.nnt N.rrDS' N.rvbs' : =
0.0
6.5&3 0,0
7,631 0.0
6,721 0,0
10,10 0.0
11,70 0.0
1 3,54 0.0
16.09 0.0
15,17 0,0
21.04 0.0
24.36 0.0
25.21 0.0
32.67 0.0
37,54 5,9
43,52 25,6
63,76 35,3
55,77 25.7
65.06 5.5
Ess Mean Std CSV
d. пгл N.rvDS' N.rvbs' ■ =
75,52 0.6
91,28 0,0
106,7 0.0
122,4 0,0
141,5 0.0
164,2 0.0
19-5, t 0.0
220,2 0.0
256,0 0,0
295,5 0.0
342,0 0.0
396.1 0.1
465.1 0.1
531,2 0,5
615.1 0.0
712,4 0,0
526,0 0.0
Э65.4 0.3
Ess Mean Std CSV
d. пгл N.rvDS' N.rvbs' ■ =
1106 3.3
1251 0,0
1454 0.0
1715 0,0
1990 0.0
2355 0.0
2665 0.5
3091 0.0
3550 0,0
4'46 0.0
4531 0.0
5563 0.0
6439 0.0
7456 ■5,5
5655 0.0
1.033S4 0,0
Statistics. Graph (1 measurements}
30
100
Size id.nrn)
Mean .■ ith -+/-1 Standard Deviation error tan
Рис. 6. Изучение белковой фракции 2, выделенной из биомассы личинок H illucens методом ДРС (цвет онлайн) Fig. 6. Study of protein fraction 2 isolated from the biomass of H. illucens larvae by the DLS method (color online)
Z-Average (tirn): 118.0343
Standard Deviation: 0
iiStd Deviation: о
Variance: О
Derived Count Rate (kcpsj: 22835,9384230..
Standard Deviation: 0
ii Std Deviation: 0
Variance: 0
See d.nm Meal Number It Std CeV n.irbä- It
:.:
0,4632 0.0
0,5385 0.0
0.8213 0.0
0.71S5 0.0
0,8132 0,0
0,9849 0.0
1.117 0.0
1,254 0.0
- АЬЪ 0.0
1,738 0,0
2,010 0,0
2,323 0.0
2.6S8 0.0
3,122 0.0
3,8! S 0,0
4,187 0,0
+.8*9 0.0
Sine Mean Std Dev
{f.nm Number It N.rrber ii
5,5:5 0,0
6.503 0.0
7,531 0.0
8.721 0.0
10.50 0.0
11,70 0,0
(3.54 0.0
I5.8S 0.0
18.57 0.0
21.04 0.0
24,35 0,0
28,21 0,0
32,87 1.7
37,34 8.7
43,£2 16.3
50,75 22,1
58,77 15,2
88,08 13,2
Eire Wean Std Dev
a.nnp Number It N-rrter X
73,32 8.0
61,28 4.3
105,7 2.2
122,4 1.1
141.8 0.5
164,2 0.2
190.1 0.1
220.2 0.1
255.0 0.0
2S5.3 0.0
342,0 0.0
356,1 0.0
458,7 0.0
531,2 0.0
615,1 0.0
712,4 0.0
825,0 0.0
955,4 0.0
See Mean St-: Dev
d.nm l^rrbs-i: Ь.ггЬег It
11®
1281 0.0
1434 0.0
1718 0.0
13Э0 0.0
23:5 0.0
2669 0.0
3091 0.0
3530 0.0
4145 0.0
4501 0.0
5580 0.0
6439 0.0
7458 0.0
8835 0.0
!,OOOe4 0.0
Statistics Graph (1 measurements;
Size id.nm'
Mean v/ith +/-1 Standard Dsviaticn srrcr fca-
Рис. 7. Изучение белковой фракции 3, выделенной из биомассы личинок H illucens методом ДРС (цвет онлайн) Fig. 7. Study of protein fraction 3 isolated from the biomass of H. illucens larvae by the DLS method (color online)
Таблица 2 / Table 2 Соотношение хроматографических выходов, %
Ratio of chromatographic outputs, %
№ образца/ Sample no. Хроматографический выход, % / Chromatographic output, %
фракция 1/ fraction 1 фракция 2/ fraction 2 фракция 3 / fraction 3
1 31.07 21.06 47.87
2 21.90 15.14 62.96
3 18.65 44.65 36.69
M ± m 24 ± 7 27 ± 18 49 ± 15
Методом динамического рассеяния света было установлено, что размер белков составил от 68 до 141 нм в белковой фракции 1; от 37 до 79 нм в белковой фракции 2 и от 43 нм до 122 нм в белковой фракции 3 соответственно (рис. 5-7). Также для подтверждения того, что полученные вещества являются белками, нами был проведен анализ растворов, используемых для анализа методом ДРС на содержание белка
методом Лоури [24]. Установлено, что чистота белка составляла 93-97%.
Заключение
Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии позволило установить воспроизводимость метода выделения антимикробных пептидов методом холодной экстракции дистиллированной водой и дальнейшими стадиями очистки белков, высаливанием и моле-кулярно-ситовой хроматографии, что, в корреляции с ДРС анализом, позволяет достоверно идентифицировать получаемые пептиды, а разработанный алгоритм выделения и очистки дает возможность производить данные белковые фракции в промышленных масштабах по низкой себестоимости.
Список литературы
1. Wright G. D. QA Antibiotic resistance where does it
come from and what can we do about it // BMC Biology.
2010. Vol. 8. P. 123. https://doi.org/10.1186/1741-7007-8-123
2. Arias C. A., Murray B. E. Emergence and management of drug-resistant enterococcal infections // Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 2008. Vol. 6, № 5. P. 637-655. https:// doi.org/10.1586/14787210.6.5.637
3. Martens E., Demain A. L. The antibiotic resistance crisis, with a focus on the United States // J. Antibiot. 2017. Vol. 70, № 5. P. 520-526. https://doi.org/10.1038/ ja.2017.30
4. Payne D. J., Gwynn M. N., Holmes D. J., Pompliano D. L. Drugs for bad bugs: Confronting the challenges of antibacterial discovery // Nat. Rev. Drug Discov. 2007. Vol. 6. P. 29-40. https://doi.org/10.1038/ nrd2201
5. Tommasi R., Brown D. G., Walkup G. K., Manchester J. I., Miller A. A. ESKAPEing the labyrinth of antibacterial discovery // Nat. Rev. Drug Discov. 2015. Vol. 14. P. 529-542. https://doi.org/10.1038/ nrd4572
6. Manniello D., Moretta A., Salvia R., Scieuzo C., Lucchetti D., Vogel H., SgambatoA., Falabella P. Insect antimicrobial peptides: Potential weapons to counteract the antibiotic resistance // Cel. Mol. Life Sci. 2021. Vol. 78, № 9. P. 4259-4282. https://doi.org/10.1007/ s00018-021-03784-z
7. Lu H. L., Leger R. S. Insect immunity to Entomopathogenic fungi // Adv. Genet. 2016. Vol. 94. P. 251-285. https://doi.org/10.1016/bs.adgen.2015.11. 002
8. Hultmark D., Steiner H., Rasmuson T., Boman H. G. Insect immunity. Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia // Eur. J. Biochem. 1980. Vol. 106. P. 7-16. https://doi.org/10. 1111/j .1432-1033.1980.tb05991
9. Ursic-Bedoya R., Buchhop J., Joy J. B., Durvasula R., Lowenberger C. Prolixicin: A novel antimicrobial peptide isolated from Rhodnius prolixus with differential activity against bacteria and Trypanosoma cruzi // Insect Mol. Biol. 2011. Vol. 20. P. 775-786. https://doi.org/10.1111/j.1365-2583.2011.01107
10. Vilcinskas A. Anti-infective therapeutics from the Lepidopteran model host Galleria mellonella // Curr. Pharm. Des. 2011. Vol. 17. P. 1240-1245. https://doi. org/10.2174/138161211795703799
11. Vonkavaara M., Pavel S. T. I., Holzl K., Nordfelth R., Sjostedt A., Stoven S. Francisella is sensitive to insect antimicrobial peptides // J. Innate Immun. 2013. Vol. 5. P. 50-59. https://doi.org/10.1159/000342468
12. Kruse T., Kristensen H. H. Using antimicrobial host defense peptides as anti-infective and immunomodulatory agents // Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 2008. Vol. 6, № 6. P. 887-895. https://doi.org/10. 1586/14787210.6.6.887
13. Chernysh S., Kim S. I., Bekker G., Pleskach V. A., Filatova N. A., Anikin V. B., Platonov V. G., Bulet P. Antiviral and antitumor peptides from insects // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. P. 12628-12632. https://doi.org/10.1073/pnas.192301899
14. Thomas S., Andrews A. M., Hay N. P., Bourgoise S. The anti-microbial activity of maggot secretions: Results of a preliminary study // J. Tissue Viability. 1999. Vol. 9, № 4. P. 127-132. https://doi.org/10.1016/s0965-206x(99) 80032-1
15. Bexfield A., Nigam Y., Thomas S., Ratcliffe N. A. Detection and partial characterization of two antibacterial factors from the excretions/secretions of the medicinal maggot Lucilia sericata and their activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) // Microbes Infect. 2004. Vol. 6, № 14. P. 1297-1304. https://doi.org/10.1016/j.micinf.2004.08. 011
16. Huberman L., Gollop N., Mumcuoglu K. Y., Block C., Galun R. Antibacterial properties of whole-body extracts and haemoloymph of Lucilia sericata maggots // J. Wound Care. 2007. Vol. 16, № 3. P. 123127. https://doi.org/10.12968/jowc.2007.163.27011
17. Jaklic D., Lapanje A., Zupancic K., Smrke D., Gunde-Cimerman N. Selective antimicrobial activity of maggots against pathogenic bacteria // J. Med. Microbiol. 2008. Vol. 57 (Pt. 5). P. 617-625. https://doi. org/10.1099/jmm.0.47515-0
18. Arora S., Lim C. S., Baptista C. Antibacterial activity of Lucilia cuprina maggot extracts and its extraction techniques // Int. J. Integr. Biol. 2010. Vol. 9, № 1. P. 4348.
19. Arora S., Baptista C., Lim C. S. Maggot metabolites and their combinatory effects with antibiotic on Staphylococcus aureus // Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 2011. Vol. 10, № 6. P. 1-8. https://doi. org/10.1186/1476-0711-10-6
20. Barnes K. M., Gennard D. E., Dixon R. A. An assessment of the antibacterial activity in larval excretion/secretion of four species of insects recorded in association with corpses, using Lucilia sericata Meigen as the marker species // Bull. Entomol. Res. 2010. Vol. 100, № 6. P. 635-640. https://doi.org/10. 1017/S000748530999071X
21. Masiero F. S., Aquino M. F. K., Nassu M. P., Pereira D. I. B., Leite D. S., Thyssen P. J. First record of larval secretions of Cochliomyia macellaria (Fabricius, 1775) (Diptera: Calliphoridae) inhibiting the growth of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa // Neotrop. Entomol. 2017. Vol. 46, № 1. P. 125-129. https://doi.org/10.1007/s13744-016- 0444- 4
22. El-Bassiony G. M., Stoffolano J. G. In vitro antimicrobial activity of maggot excretions/secretions of Sarcophaga (Liopygia) argyrostoma (Robineau-Desvoidy) // Afr. J. Microbiol. Res. 2016. Vol. 10, № 27. P. 1036-1043. https://doi.org/10.5897/AJMR2016.8102
23. Швайцер М., Грин Б. Э., Сигалл К. И., Лоджи Д. Баркон ньютрасайнс корп. Получение растворимого изолята белка канолы. Патент № 2475036 C2 РФ, МПК A23J1/14, A23J 3/14; № 2011105041/10; Заявл. 10.07.09 ; Опубл. 20.02.13, Бюл. 27. 23 с.
24. Lowry O. H., Rosebrough N. J., FarrA. L., Randall R. J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193, № 1. P. 265-275.
25. Ларионова О. С., Древко Я. Б., Ханадеев В. А., Гор-шунова С. В., Козлов Е. С., Ларионов С. В. Анализ
белковых фракций водорастворимых пептидов методом динамического рассеяния света // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия : Физика. 2023. Т. 23, вып. 1. C. 37-45. https://doi.org/ 10.18500/1817- 3020- 2023- 23-1- 37- 45
26. Hong P., Koza S., Bouvier E. S. P. A Review size-exclusion chromatography for the analysis of protein biotherapeutics and their aggregates // J. Liq. Chromatogr. RT. 2012. Vol. 35. P. 2923-2950. https:// doi.org/10.1080/10826076.2012.743724
27. Patten P. A., Schellekens H. The immunogenicity of biopharmaceuticals: Lessons learned and consequences for protein drug development // Dev. Biol. (Basel). 2003. Vol. 112. P. 81-97.
28. Rosenberg A. S. Effects of protein aggregates: An immunologic perspective // AAPS J. 2006. Vol. 8. P. 501-507. https://doi.org/10.1208/aapsj080359
29. Philo J. S. A critical review of methods for size characterization of non-particulate protein aggregates // Curr. Pharm. Biotechnol. 2009. Vol. 10. P. 359-372. https://doi.org/10.2174/138920109788488815
30. Striegel A., Yau W. W., Kirkland J. J., Bly D. D. Modern size-exclusion liquid chromatography: Practice of gel permeation and gel filtration chromatography. 2nd ed. New York : Wiley, 2009. 512 p.
31. Wu C. S. Handbook of size-exclusion chromatography and related techniques. New York : Marcel Dekker, 2003. 720 p.
32. Хлебцов Б. Н., Пылаев Т. Е., Ханадеев В. А., Хлеб-цов Н. Г. Применение спектроскопии поглощения и динамического рассеяния света в исследованиях систем золотых наночастиц + ДНК// Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Физика. 2017. Т. 17, вып. 3. С. 136-149. https://doi.org/10. 18500/1817- 3020- 2017-17- 3-136-149
References
1. Wright G. D. QA Antibiotic resistance where does it come from and what can we do about it. BMC Biology, 2010, vol. 8, pp. 123. https://doi.org/10.1186/1741-7007-8-123
2. Arias C. A., Murray B. E. Emergence and management of drug-resistant enterococcal infections. Expert Rev. Anti. Infect. Ther., 2008, vol. 6, no. 5, pp. 637-655. https://doi.org/10.1586/14787210.6.5.637
3. Martens E., Demain A. L. The antibiotic resistance crisis, with a focus on the United States. J. Antibiot., 2017, vol. 70, no. 5, pp. 520-526. https://doi.org/10.1038/ja. 2017.30
4. Payne D. J., Gwynn M. N., Holmes D. J., Pom-pliano D. L. Drugs for bad bugs: Confronting the challenges of antibacterial discovery. Nat. Rev. Drug Discov., 2007, vol. 6, pp. 29-40. https://doi.org/10. 1038/nrd2201
5. Tommasi R., Brown D. G., Walkup G. K., Manchester J. I., Miller A. A. ESKAPEing the labyrinth of antibacterial discovery. Nat. Rev. Drug Discov., 2015, vol. 14, pp. 529-542. https://doi.org/10.1038/nrd4572
6. Manniello D., Moretta A., Salvia R., Scieuzo C., Luc-chetti D., Vogel H., Sgambato A., Falabella P. Insect
antimicrobial peptides: Potential weapons to counteract the antibiotic resistance. Cel. Mol. Life Sci., 2021, vol. 78, no. 9, pp. 4259-4282. https://doi.org/10.1007/ s00018-021-03784-z
7. Lu H. L., Leger R. S. Insect immunity to Ento-mopathogenic fungi. Adv. Genet., 2016, vol. 94, pp. 251-285. https://doi.org/10.1016/bs.adgen.2015. 11.002
8. Hultmark D., Steiner H., Rasmuson T., Boman H. G. Insect immunity. Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia. Eur. J. Biochem., 1980, vol. 106, pp. 7-16. https://doi.org/ 10.1111/j .1432-1033.1980.tb05991
9. Ursic-Bedoya R., Buchhop J., Joy J. B., Durvasula R., Lowenberger C. Prolixicin: A novel antimicrobial pep-tide isolated from Rhodnius prolixus with differential activity against bacteria and Trypanosoma cruzi. Insect Mol. Biol., 2011, vol. 20, pp. 775-786. https://doi.org/ 10.1111/j.1365-2583.2011.01107
10. Vilcinskas A. Anti-infective therapeutics from the Lepi-dopteran model host Galleria mellonella. Curr. Pharm. Des., 2011, vol. 17, pp. 1240-1245. https://doi.org/10. 2174/138161211795703799
11. Vonkavaara M., Pavel S. T. I., Holzl K., Nordfelth R., Sjostedt A., Stoven S. Francisella is sensitive to insect antimicrobial peptides. J. Innate Immun., 2013, vol. 5, pp. 50-59. https://doi.org/10.1159/000342468
12. Kruse T., Kristensen H. H. Using antimicrobial host defense peptides as anti-infective and immunomodulatory agents. Expert Rev. Anti. Infect. Ther., 2008, vol. 6, no. 6, pp. 887-895. https://doi.org/10.1586/14787210.6. 6.887
13. Chernysh S., Kim S. I., Bekker G., Pleskach V. A., Fi-latova N. A., Anikin V. B., Platonov V. G., Bulet P. Antiviral and antitumor peptides from insects. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, vol. 99, pp. 12628-12632. https://doi.org/10.1073/pnas.192301899
14. Thomas S., Andrews A. M., Hay N. P., Bourgoise S. The anti-microbial activity of maggot secretions: Results of a preliminary study. J. Tissue Viability, 1999, vol. 9, no. 4, pp. 127-132. https://doi.org/10.1016/ s0965-206x(99)80032-1
15. Bexfield A., Nigam Y., Thomas S., Ratcliffe N. A. Detection and partial characterization of two antibacterial factors from the excretions/secretions of the medicinal maggot Lucilia sericata and their activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Microbes Infect., 2004, vol. 6, no. 14, pp. 1297-1304. https://doi.org/10.1016/jj.micinf.2004.08.011
16. Huberman L., Gollop N., Mumcuoglu K. Y., Block C., Galun R. Antibacterial properties of whole-body extracts and haemoloymph of Lucilia sericata maggots. J. Wound Care., 2007, vol. 16, no. 3, pp. 123-127. https://doi.org/10.12968/jowc.2007.16.3.27011
17. Jaklic D., Lapanje A., Zupancic K., Smrke D., Gunde-Cimerman N. Selective antimicrobial activity of maggots against pathogenic bacteria. J. Med. Microbiol., 2008, vol. 57 (pt. 5), pp. 617-625. https://doi.org/10. 1099/jmm.0.47515-0
18. Arora S., Lim C. S., Baptista C. Antibacterial activity of Lucilia cuprina maggot extracts and its extraction techniques. Int. J. Integr. Biol., 2010, vol. 9, no. 1, pp. 43-48.
19. Arora S., Baptista C., Lim C. S. Maggot metabolites and their combinatory effects with antibiotic on Staphylococcus aureus. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob., 2011, vol. 10, no. 6, pp. 1-8. https://doi.org/10.1186/ 1476-0711-10-6
20. Barnes K. M., Gennard D. E., Dixon R. A. An assessment of the antibacterial activity in larval excretion/ secretion of four species of insects recorded in association with corpses, using Lucilia sericata Meigen as the marker species. Bull. Entomol. Res., 2010, vol. 100, no. 6, pp. 635-640. https://doi.org/10.1017/ S000748530999071X
21. Masiero F. S., Aquino M. F. K., Nassu M. P., Pereira D. I. B., Leite D. S., Thyssen P. J. First record of larval secretions of Cochliomyia macellaria (Fabricius, 1775) (Diptera: Calliphoridae) inhibiting the growth of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. Neotrop. Entomol., 2017, vol. 46, no. 1, pp. 125-129. https://doi.org/10.1007/s13744-016-0444-4
22. El-Bassiony G. M., Stoffolano J. G. In vitro antimicrobial activity of maggot excretions/secretions of Sarcophaga (Liopygia) argyrostoma (Robineau-Desvoidy). Afr. J. Microbiol. Res., 2016, vol. 10, no. 27, pp. 1036-1043. https://doi.org/10.5897/ AJMR2016.8102
23. Schweizer M., Green B. E., Segal K. I., Lodges D. Burcon Nutrascience MB Corp. Soluble Canola Protein Isolate Production. Patent no. 2475036 RF, 2013 (in Russian).
24. Lowry O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with Folin phenol reagent. J. Biol. Chemistry, 1951, vol. 193, no. 1, pp. 265-275.
25. Larionova O. S., Drevko Ya. B., Khanadeev V. A., Gor-bunova S. V., Kozlov E. S., Larionov S. V. Analysis of protein fractions of water-soluble peptides by dynamic light scattering. Izvestiya of Saratov University. Physics, 2023, vol. 23, iss. 1, pp. 37-45 (in Russian). https://doi.org/10.18500/1817-3020- 2023- 23-1- 37-45
26. Hong P., Koza S., Bouvier E. S. P. A Review size-exclusion chromatography for the analysis of protein biotherapeutics and their aggregates. J. Liq. Chro-matogr. RT, 2012, vol. 35, pp. 2923-2950. https://doi. org/10.1080/10826076.2012.743724
27. Patten P. A., Schellekens H. The immunogenicity of biopharmaceuticals: Lessons learned and consequences for protein drug development. Dev. Biol. (Basel), 2003, vol. 112, pp. 81-97.
28. Rosenberg A. S. Effects of protein aggregates: An immunologic perspective. AAPS J., 2006, vol. 8, pp. 501-507. https://doi.org/10.1208/aapsj080359
29. Philo J. S. A critical review of methods for size characterization of non-particulate protein aggregates. Curr. Pharm. Biotechnol., 2009, vol. 10, pp. 359-372. https:// doi.org/10.2174/138920109788488815
30. Striegel A., Yau W. W., Kirkland J. J., Bly D. D. Modern size-exclusion liquid chromatography: Practice of gel permeation and gel filtration chromatography. 2nd ed. New York, Wiley, 2009. 512 p.
31. Wu C. S. Handbook of size-exclusion chromatography and related techniques. New York, Marcel Dekker, 2003. 720 p.
32. Khlebtsov B. N., Pylaev T. E., Khanadeev V. A., Khlebtsov N. G. Application of absorption and dynamic light scattering spectroscopy in studies of gold nanopar-ticle + DNA systems. Izvestiya of Saratov University. Physics, 2017, vol. 17, iss. 3, pp. 136-149 (in Russian). https://doi.org/10.18500/1817- 3020- 2017-17- 3-136-149
Поступила в редакцию 30.10.2023; одобрена после рецензирования 23.01.2024; принята к публикации 21.02.2024 The article was submitted 30.10.2023; approved after reviewing 23.01.2024; accepted for publication 21.02.2024
