CC BY
47
УДК 636.082.2:575.113
ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДИКИ ВЫЯВЛЕНИЯ SNP -ПОЛИМОРФИЗМОВ В ЛОКУСЕ ЛЕПТИНА (LEP) OPTIMIZATION METHODS FOR IDENTIFICATION OF SNP - POLYMORPHISMS IN THE LOCUS LEPTIN (LEP)
Мачульская Елена Витальевна., к. биол. н.
Шахназарова Юлия Юрьевна,
Ковалюк Наталья Викторовна, д. биол. н.
ФГБНУ СКНИИЖ, Российская Федерация, г. Краснодар
Machulskaya Elena Vitalievna, Cand. Biol. Sc.
Shakhnazarova Yulia Yurievna, research worker
Kovalyuk Natalia Viktorovna, Dr. Biol. Sc
North-Caucasus Research Institute of Animal Husbandry, Krasnodar, Russian Federation
Аннотация: оптимизирована методика выявления SNP -полиморфизмов гена лептина (LEP).
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция; ген лептина; продуктивное долголетие; молочная продуктивность.
Summary: optimized method to identify SNP -polymorphisms of leptin gene (LEP).
Key words: polymerase chain reaction; the gene of leptin; productive longevity; milk productivity.
Эффективность развития молочного скотоводства, в первую очередь, зависит от молочной продуктивности коров и сроков их хозяйственного использования.
В качестве потенциальных маркеров молочной и мясной продуктивности крупного рогатого скота могут рассматриваться аллели гена лептина (LEP). Полагают, что лептин может быть ключевой сигнальной молекулой, связывающей питание с репродуктивной функцией. Известно несколько ролей лептина у млекопитающих, большинство из которых связаны с контролем баланса энергии и общего пищевого поведения. Однако учёные полагают, что этот белок также играет важную роль в таких биологических процессах как регулирование воспроизводства и иммунной реакции [2]. Лептин - гормон, вырабатываемый адипоцитами - клетками жировой ткани секретируется в
кровоток и влияет на синтез посредников в гипоталамусе, регулирующих пищевое поведение. Также известно влияние гена лептина на продуктивное долголетие крупного рогатого скота[1, 3]. Ещё была обнаружена взаимосвязь между полиморфизмами гена лептина и сложностью отела, длительностью срока беременности и перинатальной смертностью телят [1].
Ген лептина имеет около 60 SNP - полиморфизмов, но наиболее значимыми в плане продолжительности хозяйственного использования являются три - R25C, Y7F и A80V.
Генотипирование, по указанным выше SNP сайтам, возможно с использованием ПЦР/ПДРФ - технологии.
Однако, при использовании для генотипирования по гену лептина (LEP) методик, описанных в литературе, мы получали, кроме специфического ПЦР - продукта, ещё и неспецифические для данной реакции ПЦР - фрагменты, которые затрудняли дальнейшую детекцию.
Цель исследований - оптимизировать методику ПЦР/ПДРФ при детекции SNP - полиморфизмов гена лептина (LEP).
Методика. Исследования были проведены на базе лаборатории биотехнологии ФГБНУ Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства. Генотипирование по SNP-сайтам гена лептина (R25C, Y7F и A80V) провели с использованием ПЦР/ПДРФ методов. Объектом исследования была цельная кровь коров и телок и криоконсервированная сперма быков-производителей айрширской и голштинской пород.
Для выделения ДНК из образцов семени и крови использовали наборы реагентов Diatom™ DNA Prep 100 ООО «Лаборатория Изоген» г. Москва. Принцип действия набора основан на использовании лизирующего реагента с гуанидинтиоционатом, который предназначен для лизиса клеток, солюбилизации клеточного дебриса, а так же для денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии лизирующего реагента ДНК активно сорбируется на NucleoSTM-сорбенете, затем легко отмываетя от белков и солей спиртовым раствором.
ДНК, элюированная из сорбента ЭкстраГеномТМ, может быть напрямую использована по назначению.
Т° отжига 57° C
Количество циклов амплификации
V ^02 25мМ)
40
1
мкл/ 25 мкл
Т° отжига
Количество циклов амплификации
V
25мМ)
Т° отжига
Количество циклов амплификации
V
25мМ)
63°C
34
0,8 мкл/ 25 мкл
65Т
31
0,6 мкл/ 25 мкл
3
Рисунок 1 - Влияние изменения температуры отжига праймеров, количества циклов амплификации и концентрации MgQ2 на выход и специфичность ПЦР - продукта.
Для проведения ПЦР использовали пары олигонуклеотидных праймеров, описанные в литературе [3], нуклеотидные последовательности которых, а также размеры образующихся ПЦР-продуктов, представлены в таблице 1.
Для контроля прохождения реакции и оценки качества и концентрации ПЦР - продуктов проводили электрофорез в 1.5% агарозном геле.
При детекции участков экзона 2 и экзона 3 гена ЬБР (3 фрагмента) для выбора оптимальных условий реакции использовали различные условия амплификации. Режимы амплификации подбирались эмпирическим путем для ДНК-амплификатора МС-2 (производство «ДНК-Технология»).
Варьировали температурой отжига праймеров (Т° = 57-65 С), количеством циклов амплификации (кол-во циклов = 31- 40) и концентрацией хлористого магния (V (MgCl2 в 25мМ = 0,6 - 1 мкл).
Таблица 1 - Используемые олигонуклеотидные праймеры и получаемые ПЦР - продукты при ПЦР/ПДРФ для ЬБР -генотипирования.
Размеры ПЦР-продуктов, п.н. Последовательность праймеров
Я25С 2 экзон Т ^ С 305 Р:сслааалатасстттслттл я: аататслтсстаалссттсс
У7Р 2 экзон А^Т 310 Р:стасатаатстлсласлслсст С я:лааассллласслслаалттс ал
А80V 3 экзон С ^ Т 424 Р:слласлаалллтлааалатсл таа я: стааталаалтстаттаатлаа тс
Наилучший режим определяли по максимальному количеству выхода специфического фрагмента (рис.1).
Результаты исследований и их обсуждение. Наилучший результат по выходу специфического продукта дала полимеразная цепная реакция со следующими условиями амплификации:
95 °С - 3 мин.
95 °С - 1 мин. 67 °С - 1 мин. 72 °С - 1 мин.
95 °С - 30 сек. 65 °С - 30 сек. 72 °С - 30 сек.
72 °С - 3 мин.
1 цикл
31 цикл
1 цикл
При этом оптимальной концентрацией MgCl2 (MgCl2 25мМ) было определено значение 0,6 мкл/25 мкл реакционной смеси.
Вывод. Для получения максимального выхода специфического ПЦР - продукта в результате амплификации при генотипировании по гену лептина (LEP) необходимо оптимизировать условия реакции, указанные в стандартных методиках.
Список литературы
1. Giblin, L. Association of bovine leptin polymorphisms with energy output and energy storage traits in progeny tested Holstein-Friesian dairy cattle sires L. Giblin, S. Butler, B. Kearney, S. Waters et.al // BMC Genetics 2010. № 11:73
2. Liefers, S. Leptin promoter mutation affects leptin levels and performance traits in dairy cows / Liefers S. [at al.] // Anim. Genet.2005.N. 36. P. 111 - 118.
3. Szyda, J. Evaluation markers in selected genes for association with functional longevity of dairy cattle / J. Szyda, М.
Morek-Kopec, J. Komisarek, A. Zarnecki // BMC Genetics. 2011. 12:30
