CC BY
73
УДК 636.22/.28.082.3:575.1
ВЫЯВЛЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА В ГЕНЕ ЛЕПТИНА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА POLYMORPHISM IDENTIFICATION IN LEPTIN GENE OF
CATTLE
Ковалюк Н.В. д.б.н.
ГНУ СКНИИЖ Россельхозакадемии РФ, г.Краснодар Дениз Ф.
Кубанский государственный университет Kovalyuk N.V., Dr. Sci. Biol.
State Scientific Institution, North-Caucasus Research Institute of Animal Husbandry under Russian Academy of Agricultural Sciences, Krasnodar, Russia Deniz F.
Kuban State University2
Аннотация: оптимизированы условия полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции для выявления аллелей гена лептина крупного рогатого скота.
Ключевые слова: ген LEP; экзон 2; полиморфизм. Summary: the conditions of the polymerase chain reaction and polymorphism analysis of restriction fragment length are optimized for identification of the alleles of leptin gene in cattle. Key words: LEP gene; exon 2; polymorphism.
Методика. Исследования проведены на базе лаборатории биотехнологии СКНИИЖ. Материалом для исследования служили образцы спермы быков - производителей. Для выделения ДНК из образцов использовали наборы реагентов Diatom™ DNA Prep 100 ООО «Лаборатория Изоген» г. Москва. Выявление SNP полиморфизма в гене LEP проводили в 3 точках: Y7F; R25C; A80V. Для амплификации использовали 3 пары праймеров, каждая из которых давала возможность амплифицировать фрагмент, содержащий SNP (соответственно 310 пн, 305 пн и 424 пн) [5]. Анализ рестрикционного полиморфизма проводился с использо-
ванием эндонуклеаз: Bpu14I (точка Y7F), Bsp13I (R25C), BseX3I (A80V).
Результаты исследований и их обсуждение. В последние годы наблюдается устойчивая тенденция усиления проблем с воспроизводством скота молочного направления продуктивности. Считается, что эта проблема, помимо ряда других причин, имеет ярко выраженную генетическую составляющую, связанную с интенсивной селекцией на увеличение молочной продуктивности. Высокая молочная продуктивность отрицательно коррелирует как с фертильностью, так и с продолжительностью хозяйственного использования животных [4]. В настоящее время в мире ведётся поиск генов, ассоциированных с функциональным долголетием коров и репродуктивными качествами. В качестве гена - кандидата в этой связи изучается ген лептина.
Лептин - гормон, вырабатываемый адипоцитами - клетками жировой ткани, играет важную роль в метаболизме, в частности в накоплении жира в организме. Лептин вовлечён в регуляцию пищевого поведения, влияет на функционирование иммунной системы и репродуктивную функцию, а также на рост и конституцию животных [5]. Считается, что лептин обладает плейотропным воздействием на организм [1].
Ген лептина, расположен в 4 хромосоме крупного рогатого скота (описано около 60 его SNP полиморфизмов) Структура гена лептина представлена промоторной областью, 3 экзонами, 2 интронами и 3"UTR областью. Полиморфизмы Я25С и Y7F встречаются во втором, а А80У - в третьем экзоне LEP гена [6].
Показано, что полиморфизм К25С ассоциирован с содержанием жира и белка в молоке, лёгкостью отёлов и продолжительностью стельности [2]. Кроме того, от LEP - генотипа зависит продолжительность функционального использования коров. Так, установлено, что коровы с генотипом СС (точка К25С гена лептина) имеют в 3,14 раз больший риск выбраковки, чем животные с гетерозиготными генотипами, а коровы с генотипом FF (точка Y7F гена лептина) в 3,64 более высокий риск выбраковки, чем коровы с генотипом УГ[2]. Также показано влияние LEP-А80У полиморфизма на продолжительность хозяйственного использования и уровень рентабельности животных [1, 2, 3].
Нами проведена оптимизация условий проведения ПЦР для амплификации двух фрагментов экзона 2 и одного фрагмента экзона 3. Использовали следующие последовательности праймеров (таблица 1) [5]:
Таблица 1. Использованные последовательности праймеров
Последовательность праймеров Размеры ПЦР-продуктов, пн
Я25С 2 экзон Т ^ С Б: ССЛОООЛОТОССТТТСЛТТЛ Р:ООТОТСЛТССТООЛССТТСС 305
2 экзон А^Т Р:СТОСОТООТСТЛСЛвСЛСЛССТС К:ЛОООССЛЛЛОССЛСЛОвЛТТСОЛ 310
А80У 3 экзон С ^ Т Р:СЛЛОСЛООЛЛЛТЛОООЛОТСЛТОв Я: СТвОТОЛООЛТСТОТТООТЛОвТС 424
Таблица 2. Условия амплификации (объем реакционной смеси - 25 мкл)
1 цикл 95°С - 30"
95°С - 2 '30"
2 цикл 95°С - 30"
67 °С- 30"
72 °С- 30"
3-29 циклы 95°С - 20"
65 °С- 20"
72 °С- 30"
30 цикл 95°С - 20"
65 °С- 20"
72 °С - 3'
1 Т отжига Количество циклов амплификации Конц. (ЫвС12)
57°С 40 2,5 мМ
Т Количество Конц.
от- циклов ам- (MgCl2
жи- плификации
га
63° 34 2 мМ
C
Т Количество Конц.
от- циклов ам- (MgCl2)
жи- плификации
га
65° 31 1,5 ММ
C
3
Рисунок 1. Влияние изменения температуры отжига прай-меров, количества циклов амплификации и концентрации MgCl2 на выход и специфичность ПЦР- продукта (SNP R25C)
Праймеры синтезированы ЗАО «Синтол» г. Москва.
При постановке реакции с использованием температур отжига праймеров и концентрации хлорида магния, указанной в статье Szyda, J., (2007), получили значительное количество неспецифических фрагментов амплификации (рис. 1.1).
Подобрана единая программа для амплификации (ам-плификатор МС2+ ООО «НПО ДНК-Технология») включающая следующие циклы (таблица 2).
Наиболее оптимальная концентрация MgCl2 составила 1,5 мМ.
Для рестрикции использовали 5 мкл амплификата. Для каждой из эндонуклеаз, указанной в статье Szyda, J., (2007) с использованием программы Primer Premier подобрали доступные изошизомеры (НПО «СибЭнзим» г Новосибирск) (таблица 3).
Таблица 3. Использованные эндонуклеазы рестрикции
SNP Эндонуклеаза Генотип - величина фраг-
рестрикции ментов рестрикции, пн
R25C Kpn2I RR - 305
2 экзон (Bsp13I) CC -283 и 22
Т ^ С CR - 305,283 и 22*
Y7F Bsp119I YY - 310*
2 экзон (Bpu14I) FF - 288 и 22
А^Т YF - 310, 288 и 22
A80V Eco91I АА - 424
3 экзон (BseX3I) VV- 398 и 26
С ^ Т AV- 424,398 и 26
Выводы. Таким образом, нами проведена оптимизация условий ПЦР/ПДРФ для генотипирования по локусу LEP
Список литературы
1. Giblin, L. Association of bovine leptin polymorphisms with energy output and energy storage traits in progeny tested Hol-stein-Friesian dairy cattle sires/ Linda Giblin, Stephen T Butler, Breda M Kearney, Sinead M Waters, Michael J Callanan, Donagh P Berry// BMC Genetics 2010, № 11:73
2. Szyda, J. Evaluation markers in selected genes for association with functional longevity of dairy cattle/ J. Szyda, М. Morek-Kopec, J. Komisarek, A. Zarnecki//BMC Genetics.- 2011.- 12:30
3. Komisarek, J. Impact of LEP and LEPR gene polymorphismson functional traits in Polish Holstein-Friesian cattle/ J.Komisarek//Animal Science Papers and Reports.- 2010.-V.10. -P.133-141
4. Komisarek, J. Impact of leptin gene polymorphismson breeding value for milk production traits in cattle/ J. Komisarek, , J. Szyda, A. Michalak, Z. Dorynek// J. Anim. Feed Sci.- 2005 № 14-P.491-500.
5 Szyda, J. Statistical modeling of candidate gene effects on milk production traits in dairy cattle/ J. Szyda, J. Komisarek // J. Dairy sci.- 2007.- 90-P. 2971-2979
6. Yoon, D.H. Highly polymorphic bovine leptin gene / D.H. Yoon, B.H.Cho, B.L.Park et all // Asian-Aust.J.Anim.Sci.-2005.-V.18. - №11.-P. 1548-1551
