CC BY
77
УДК: 616-006-0+543.5.068.7(571.56)
К. В. Комзин, П. Г. Петрова
ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДИКИ ПОДГОТОВКИ ПРОБ ДЛЯ СПЕКТРАЛЬНОГО БИОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА СЫВОРОТКИ КРОВИ
Представлена информация о результатах работы, проведенной на базе учебно-научных лабораторий Медицинского института Северо-Восточного федерального университета, целью которой являлась оптимизация методики подготовки проб [1, 2, 3] для спектрального биохимического анализа сыворотки крови с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. Описана новая версия вышеуказанной методики пробоподготовки, отличающаяся уменьшенными сроками и относительно низкой трудоемкостью, а также четко обозначенными сроками и условиями производимых операций.
Ключевые слова: ВЭЖХ-спектральный анализ сыворотки крови, пробоподготовки для ВЭЖХ.
K. V Komzin, P G. Petrova
The Optimization of the Technique of Sample Preparation for Spectral Biochemical Analysis of Blood Serum
There is information about results of the work held on the base of educational-scientific laboratories of the Medical Institute of the North-Eastern Federal University, the aim of which was an optimization of the technique of sample preparation for spectral biochemical analysis of blood serum with use of high-efficiency liquid chromatography. The result of the work is a new version of the technique of sample preparation, which differs by the absence of high level of reproducibility, less labor-intensive and clearly defined terms and conditions of the operations produced.
Key words: HELC-spectral analysis of blood serum, sample preparation for HELC.
В последнее время в системе практического здравоохранения всё острее ощущается нехватка высокоточных методов диагностики онкологических заболеваний на ранних стадиях, которые можно бы было использовать в целях массового обследования населения. На протяжении последних лет многие научные школы пытаются решить эту проблему различными способами. Что касается результатов этих разработок, на данный момент одним из наиболее оптимальных подходов к решению вышеуказанной проблемы, на наш взгляд, является спектральный биохимический анализ сыворотки крови. Данный метод основан на обнаружении «сигнальных изменений» биохимического состава крови, характерных для онкологических заболеваний [1, 2]. Технически детекция этих изменений
осуществляется при помощи высокоточного химикоаналитического метода - высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Извлечение диагностической информации из полученных информа-
КОМЗИН Кирилл Васильевич - аспирант кафедры нормальной и патологической физиологии Медицинского института СВФУ им. М.К. Аммосова.
E-mail: de trout@mail.ru
ПЕТРОВА Пальмира Георгиевна - д. м. н., профессор, директор Медицинского института СВФУ им. М.К. Аммосова.
E-mail: mira44@mail.ru
ционных матриц (хроматограмм) происходит благодаря математическим алгоритмам, построенным на принципах многомерного энтропийного анализа, разработанного академиком А. Н. Панченковым [1, 3].
Основным препятствием, затрудняющим успешное внедрение данного способа диагностики в широкую медицинскую практику, является несовершенство методики подготовки пробы для данного анализа. Главным обязательным условием пригодности методики пробоподготовки к хромотографическому анализу с последующей математической обработкой является высокий уровень воспроизводимости получаемых хроматограмм в пределах одной пробы. Существующая методика пробоподготовки [3] включает две стадии: высушивание и экстракцию. Сыворотка крови в количестве 1 мл, полученная стандартным путем, наливается в чашку Петри ^=40 мм), высушивается на воздухе при комнатной температуре до состояния сухой корочки, после чего помещается в эксикатор с хлоридом кальция и досушивается в течение 14 дней. Полученный сухой остаток перемалывается на планетарной мельнице при 750 об/мин в течение 3 мин. Готовится навеска перемолотой пробы в количестве 40 мг, насыпается в пробирку типа «Эппендорф», заливается 85%-м метанолом. Экстракция происходит в течение часа при комнатной температуре и постоянном встряхивании на шейкере при 500 об/мин.
ІЗ?
Рис 1. Общий вид хроматограммы метанольного экстракта сыворотки крови, полученной с использованием модифицированной пробоподготовки. Стрелками показаны регулярные пики с канала 200 нм.
- образец: Метанольный экстракт высушенной сыворотки крови
- колонка: 02х75 мм с ProntoSIL-120-5 С18 AQ;
- элюенты: А- [4 М LiClO4-0.1 М НС104]:Н20 (5:95), Б- МеС^
- градиент: от 10 % до 100 % Бза30 мин; 100 % Б5 мин; F=100 мкл/мин; ^50 °С;
- детектор: 200, 210, 220, 230, 240, 250, 280; т=0.18 с;
- объем пробы: 5мкл
После чего проба центрифугируется при 12000g в течение 3 мин. Полученный экстракт в количестве 50 мкл помещается в пробирку автодозатора хроматографа [1, 3]. Однако выполнение этих манипуляций в условиях нашей лаборатории не привело к ожидаемым результатам, на полученных хроматограммах отсутствовали некоторые группы пиков. Несовершенство заключается в длительности сроков, что имеет ключевое значение для диагностики злокачественных новообразований, а также в высокой трудоёмкости производимых операций и их количестве, что неизбежно приводит к влиянию человеческого фактора на результат анализа. Исходя из вышеизложенного, перед нами была поставлена задача: разработать воспроизводимую, менее трудоёмкую методику пробоподготовки с четко обозначенными режимами и минимальным количеством операций, погрешности в которых могли бы существенно сказаться на результатах анализа.
Задача, поставленная перед нами, была решена путем подбора оптимальных условий высушивания и экстракции, с учетом основных принципов влияния внешних факторов на протекание этих двух процессов. Также количество операций, производимых с сывороткой, было минимизировано. Таким образом, оптимизированная пробоподготовка включает следующие манипуляции: сыворотка крови, полученная стандартным путем, в количестве 500 мкл помещается
в пробирку типа «Эппендорф» емкостью 1,5 мл. Открытая пробирка помещается в ячейку термо-шейкера на 24 часа при 60 °С, по истечении указанного времени в нижней трети пробирки образуется прозрачная «пробка» из сухой сыворотки желтокоричневого цвета, которая в нескольких местах прокалывается чистым наконечником на 200 мкл. В пробирку в количестве 500 мкл помещается 85%-й раствор метанола, приготовленный из реактивов градации не ниже: «химически чистый». Закрытая пробирка инкубируется в термошейкере при 50 °С в течение 24 часов при встряхивании на скорости 500 об/мин. По истечении указанного времени проба центрифугируется при 12000g в течение 3 мин. Полученный экстракт в количестве 200 мкл помещается в пробирку автодозатора хроматографа. Параметры хроматографического анализа не отличаются от используемых в предыдущей версии методики [3, 4, 5], за исключением дополнительного цикла регенерации колонки (1000 мкл 100 % элюента Б), добавляемого после каждого анализа.
В процессе работы были проведены 3 серии по 30 повторений анализа одной пробы сыворотки крови, приготовленной с использованием указанной выше методики. Пробы готовились в разных пробирках. Полученные хроматограммы (рис. 1) оцифровывались при помощи программы «Мультихром». За минимальную высоту хроматографического пика было принято
А1 А2 АЗ &1 В2 ВЗ В4 ВЗ В6 С1 С2 СЗ С4 С5 С6 С7 01 02 Е1 Р1 РЗ Р4 Р5 Р6 Р7 01 й2 йЗ Й4 Й5 йб Н1 Н2 НЗ Н4 Н5 Н6 II
Пики (включая нерегулярные)
Рис. 2. Значения максимального «+» и минимального «-» отклонений от среднего времени выхода каждого из регулярных пиков
значение, равное 0,02 о. е. Минимальная площадь пика не ограничивалась. В результате были получены хроматограммы, на которых идентифицировались от 32 до 40 пиков, соответствующих вышеуказанным параметрам, из которых на опорном канале 200 нм регулярно выходило 30 пиков. Всем 40 пикам были даны цифро-буквенные обозначения. Статистически значимых различий между временами выхода обнаружено не было, так как колебания минимальных и максимальных отклонений от среднего времени выхода каждого из пиков составило менее 3 %, что является меньше погрешности прибора, которая составляет 5 % (рис. 2).
Время между выходом отдельных пиков составляло большую величину, чем промежутки, в которых ожидался их выход. Перекрывания этих промежутков между собой не наблюдалось, за
исключением пиков F5 и F6, времена выхода которых перекрылись в конце 23 минуты, что следует учесть при дальнейшем наборе экспертно-диагностических баз (рис. 3).
Исходя из вышесказанного, можно заключить, что полученные хроматограммы являются достоверно
воспроизводимыми, что, в свою очередь, даёт нам возможность утверждать, что разработанная нами методика пробоподготовки для спектрального
4ЧЧ1 'Г чччччччч 4 4 4' 1 1 1
АІА2 АЗ ВІ 82 63
1 1 1 1 1 1 1 ' 1 1! 875 1 і 1 > 1 і 1 і 1 і 1 і 1 1 1 1 14' ■ 1 1 1 14' 1 1 1
В4 В5 В6 СІ С2 СЗ С4 С5 С6 С7
1 . 1 1 1 14 ' I ' ' 14 ' ' 4 ' ч ч ч 1750 1 1 1
□1 02 Е!
, Т"Р 1 Т | | | 1 14' 14 1 І' 1 ' Т Ч "т 4_ 14' 1 1
1 1 ■ ■ ПН 1 ■
Р1 рз и п н, Р7
. 1 ч . 1 . 1 . 1 1 1 . 1 1 1 1 1 . 1 . 1 . 1 . 1 . 1 II III 1 ІІІІІІ 4 4 4' 3500 1 1
ОІ 02 « « 05 04 НІ Н2 НЗ Н4 Н5 Н6
Рис. 3. Временная разверстка выхода пиков на хроматограммах. Серединная линия соответствует среднему времени выхода пика. Внешним границам тёмных зон соответствуют минимальные и максимальные значения времен выхода соответствующих пиков
биохимического анализа сыворотки крови также является воспроизводимой. По сравнению с предыдущей версией была снижена трудоемкость пробо-подготовки, а также стали четко обозначенными сроки и условия операций.
Л и т е р а т у р а
1. Экология и здоровье человека на Севере [Электронный ресурс]: материалы межрегиональной научно-
практической конф., Якутск, 9-10 ноября 2012 г. / гл. ред. П. Г. Петрова. Якутск.: 2012. 1 электрон. опт. диск (CD-ROM).
2. Насонов С. В., Алексеева О. П. Диагностика и дифференциальная диагностика заболеваний желудка с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки крови // Медицинский альманах, 2008. - № 1. - С. 47-49.
3. Способ дифференциальной диагностики злокачественных новообразований и соматических незлокачественных заболеваний [Текст]: пат. 2335768 Рос. Федерация: МПК G 01 № 33/50 / Игнатьев А. А., Насонов С. В., Казаковцев А. В., Челышев И. В.; заявитель и патентообладатель ООО «Медицинская диагностика». № 2006137773/15;
заявл. 26.10.2006; опубл. 10.05.2008.
4. Перельройзен М. П., Барам Г. И., Азарова И. Н.
Массовая концентрация УФ-поглощающих веществ. МВИ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [Текст]: методика выполнения измерений № 67-06.
№ ФР.1.31.2006.02966. - Новосибирск: ЗАО Институт
хроматографии «Эконова», 2006.
5. Перельройзен М. П., Барам Г. И., Азарова И. Н. Хроматографические и спектральные параметры УФ-поглощающих веществ. МВИ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [Текст]: методика выполнения измерений № 38-03. № ФР.1.31.2003.00951. - Новосибирск: ЗАО Институт хроматографии «Эконова», 2006.
6. Насонов С.В. Программа для обработки спектров и создания экспертных диагностических систем DataStat [Текст]: свидетельство о регистрации программы для ЭВМ № 200761453. - Нижний-Новгород, 2007.
7. Насонов С. В. Диагностика и дифференциальная диагностика заболеваний желудка с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки крови [Текст]: дис. ... канд. мед. наук: 14.00.05: защищена 22.01.2009: утв. 15.07.2009 / Насонов Сергей Викторович. -Н. Новгород, 2009. - 113 с. - Библиогр.: с. 1-113.
