CC BY
169
№ 3 - 2012 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки УДК 616.225.2:615.07:543.544
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ р-АДРЕНОБЛОКАТОРОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ МЕТОДОМ ВЭЖХ
1 12 2
Н.О. Кокорина , В.П. Новоселов ’ , М.А. Ханина
1ГБУЗ «Новосибирское областное бюро судебно-медицинской экспертизы»
(г. Новосибирск)
ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России (г. Новосибирск)
Подобраны условия (pH, экстрагенты) жидкость-жидкостной экстракции Р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола, талинолола) из биологических жидкостей человека (моча, кровь), разработана и валидирована методика их идентификации и количественного определения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Ключевые слова: Р-адреноблокаторы, биологические жидкости, жидкость-жидкостная экстракция, ВЭЖХ, идентификация, количественное определение.
Кокорина Наталья Олеговна — заведующая судебно-химическим отделением Новосибирского областного бюро судебно-медицинской экспертизы ГБУЗ НСО «Новосибирское областное бюро судебно-медицинской экспертизы», рабочий телефон: 8 (383) 346-39-21, e-mail: kokorina@sibsme.ru
Новоселов Владимир Павлович — доктор медицинских наук, профессор, заслуженный врач РФ, заведующий кафедрой судебной медицины ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», ГБУЗ НСО «НОБСМЭ», рабочий телефон: 8 (383) 346-00-19, e-mail: sme@sibsme.ru
Ханина Миниса Абдуллаевна — доктор фармацевтических наук, профессор, заведующая кафедрой фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 225-07-13, e-mail: khanina06@mail.ru
Введение. В настоящее время в лечебной практике широко применяются лекарственные препараты группы Р-адреноблокаторов, обладающие кардиоселективными свойствами. В США Р-адреноблокаторы занимают четвертое место по частоте назначений [1]. В России из наиболее часто назначаемых и доступных по цене являются: атенолол, бетаксолол, бисопролол, метопролол, пропранолол и талинолол. Наряду с положительными лечебными эффектами Р-адреноблокаторы имеют ряд серьезных
побочных эффектов. В связи с этим все чаще стали встречаться сообщения об отравлениях препаратами этой группы.
Для диагностики отравлений в клинической и судебно-медицинской практике в качестве объектов исследований используют кровь и мочу, из которых Р-адреноблокаторы извлекают жидкость-жидкостной (ЖЖЭ) и твердофазной экстракцией. Для обнаружения Р-адреноблокаторов используют хроматографию: в тонком слое сорбента [2],
высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ) с флюориметром и УФ-детектором (описан для бисопролола и метопролола), газовой с хромато-масс-спектрометром. Описанные в литературе методики имеют ряд недостатков: длительность, трудоемкость, высокая стоимость, неоднозначность результатов. Ограниченность применения ВЭЖХ в судебномедицинской практике для идентификации Р-адреноблокаторов связана с отсутствием сведений об оптимальных условиях и степени их изолирования из биологических жидкостей человека. Поэтому разработка экспрессных и достоверных методик извлечения Р-адреноблокаторов из крови и мочи с последующей их идентификацией и количественным определением является актуальной проблемой для судебномедицинской практики.
Цель исследования. Целью настоящего исследования является разработка методики жидкость-жидкостой экстракции Р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) из крови и мочи, их идентификации и количественного определения методом ВЭЖХ.
Материалы и методы исследования. Объектами исследования служили модельные растворы Р-адреноблокаторов (атенолол, бетаксолол, бисопролол, метопролол, пропранолол, талинолол) в 1 н растворе кислоты соляной и биологических жидкостях человека (моча, цельная кровь).
Извлечение Р-адреноблокаторов из модельных растворов проводили ЖЖЭ, качественное обнаружение и количественное определение — методом ВЭЖХ с УФ-детектцией.
Методика ЖЖЭ: точный объем (около 20 мл) модельного водного раствора (раствора мочи, цельной крови) с концентрациями исследуемых Р-адреноблокаторов по 1 мкг/мл помещают в делительную воронку на 100 мл, к раствору добавляют (около 1 мл) 1 н раствора натрия гидроокиси, тщательно перемешивают, рН раствора доводят до 11-12 (по рН-метру или универсальному индикатору), затем приливают 20 мл экстрагента и выдерживают в течение 15-20 мин при комнатной температуре при периодическом перемешивании. Нижний органический слой отделяют. Экстракцию проводят дважды. Органические экстракты объединяют и упаривают до 5 мл (раствор А).
Методика анализа качественного состава и количественного содержания Р-адреноблокаторов методом ВЭЖХ: 0,6 мл раствора А переносят в пробирку «Эппендорф», удаляют растворитель при комнатной температуре до сухого остатка, к нему добавляют
0,2 мл 0,1 н раствора кислоты соляной и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 3-5 мин. Затем отбирают 10 мкл надосадочной жидкости и исследуют на жидкостном хроматографе «Милихром А-02» с УФ-детектором (хроматографическая колонка размером 75 х 2 мм, заполненная обращено-фазовым сорбентом ProntoSIL 120-5^18 с размером частиц 5 мкм). Детектирование проводят при длинах волн 210 (опорная), 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм. В качестве подвижной фазы используют: элюент А —
0,1 % — раствор кислоты трифторуксусной, элюент В — ацетонитрил. Режим анализа: регенерация колонки 700 мкл 2 % элюентом В, градиентный режим: элюент В от 2 % до 100 % за 3000 мкл, скорость потока 150 мкл/мин, частота детектирования 0,18 с, температура термостата колонки 35 °С. При необходимости для лучшего разделения всех
компонентов хроматографирование проводят в режиме градиента элюента В от 2 до 50 % за 3000 мкл [3].
Идентификацию Р-адреноблокаторов проводят путем сравнения времен удерживания и спектральных отношений со стандартными веществами, содержание рассчитывают по формуле:
С = Q х S х V! х р % / Умкл х к х У2 мкг/мл,
где Q — калибровочный коэффициент вещества; S — площадь пика вещества на хроматограмме, Аи х мкл; VI — объем, полученного извлечения (мл); Умкл — объем пробы, вводимый в хроматограф (мкл); К — концентрирование пробы перед исследованием методом ВЭЖХ; У2 — объем крови (мочи), взятой на анализ (мл); Р % — процент извлечения вещества из биологической жидкости.
Для количественного определения исследуемых веществ строят калибровочные графики. Для этого готовят исходные растворы Р-адреноблокаторов в 0,1 н растворе кислоты соляной с концентрацией веществ — 100 мкг/мл. Из исходных растворов готовят ряды разведений — растворы с концентрациями Р-адреноблокаторов 40, 20, 10, 10, 5,
1 и 0,5 мкг/мл, которые анализируют методом ВЭЖХ в указанных выше условиях. Калибровочные графики вещества строят с помощью аппаратно-программного комплекса «МультиХром» с использованием метода абсолютной калибровки.
Результаты и обсуждения. У всех исследуемых Р-адреноблокаторов исследованы и определены хроматографические и спектральные характеристики (рис. 1, табл. 1).
Т---------1---------1--------1---------1---------1---------1---------1--------1---------1---------1--------1---------1--------1---------1---------1---------1---------г
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 мни
Рис. 1. Хроматограмма Р-адреноблокаторов: пик 1 — tуд 6,85 мин — атенолол; пик 2 — tуд 11,22 мин — метопролол; пик 3 — tуд 13,31 мин — бисопролол; пик 4 — tуд 13,96 мин — талинолол; пик 5 — tуд 14,45 мин — пропранолол; пик 6 — tуд 14,79 мин —
бетаксолол
Таблица 1
Спектральные характеристики исследуемых Р-адреноблокаторов
Вещество Время удерживания, мин Спектральные отношения
220/210 230/210 240/210 250/210 260/210 280/210 300/210
Атенолол 6,85 1,251 1,131 0,277 0,046 0,090 0,159 0,001
Метопролол 11,22 1,419 0,867 0,034 0,027 0,085 0,174 0,002
Бисопролол 13,31 1,629 1,463 0,100 0,038 0,096 0,140 0,000
Талинолол 13,96 0,477 0,954 1,485 1,215 0,090 0,115 0,078
Пропранолол 14,45 0,960 0,768 0,211 0,023 0,048 0,132 0,111
Бетаксолол 14,79 1,442 0,922 0,039 0,033 0,092 0,191 0,001
Для всех исследуемых веществ построены калибровочные графики, установлена линейная зависимость между площадями хроматографических пиков и концентрациями веществ в интервале 0,5-50 мкг/мл (рис. 2). Калибровочные графики описываются линейным уравнением вида:
С = а + bS,
где С — концентрация вещества, мкг/мл, S — площадь пика хроматографического пика вещества, Аи х мкл.
Площадь
Рис. 2. Калибровочные графики Р-адреноблокаторов: 1 — бисопролол, 2 — атенолол, 3 — метопролол, 4 — пропранолол, 5 — талинолол, 6 — бетаксолол
Для выявления оптимального экстрагента для ЖЖЭ Р-адреноблокаторов из водных растворов, мочи и крови исследованы смеси растворителей: хлороформ, хлороформ — спирт изопропиловый (9 : 1), хлороформ — ацетон (9 : 1), хлороформ — ацетонитрил (9 : 1). Поскольку константы диссоциации рКа исследуемых Р-адреноблокаторов находятся в пределах 9,4-9,8, то проведены исследования по влиянию рН среды на степень их экстрагирования. В результате выявлены оптимальные условия для ЖЖЭ Р-адреноблокаторов из водных растворов, мочи и крови: рН 11-12 среды, экстрагенты —
смесь растворителей: хлороформ-изопропанол в соотношениях 9 : 1 (для бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) и 3 : 2 (для атенолола).
ВЭЖХ анализ извлечений, полученных ЖЖЭ, в указанных выше условиях, показал, что степень извлечения бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола из мочи и крови составляет 87-92 и 73-85% соответственно, для атенолола из мочи — 63,7 % и крови — 53,5 % (табл. 2).
Метрологические характеристики методики количественного определения исследуемых Р-адреноблокаторов представлены в табл. 2. Предложенная нами методика количественного определения Р-адреноблокаторов надежна и дает воспроизводимые результаты. Ошибка единичного определения при доверительном интервале 95 % не превышает 3,53 %. Валидация методики проводилась по параметрам: правильность, повторяемость, воспроизводимость и линейность. Опыты с добавками Р-адреноблокаторов к исследуемым растворам показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки при использовании данной методики [4, 5].
Таблица 2
Метрологические характеристики количественного определения р-адреноблокаторов в моче и крови (1 мкг/мл)
Исследуемые вещества Хср (п=10) 82 8 8х АХср АХ Степень извлечения, % Еср
Извлечение из мочи смесью растворителей хлороформ-изопропанол (9 : 1)
Бетаксолол 87,04 2,1404 1,4630 0,4626 1,1032 3,26 87,04±3,26 1,19
Бисопролол 88,4 2,4422 1,5628 0,4942 1,1020 3,48 88,40±3,48 1,25
Метопролол 90,2 1,8733 1,3669 0,4328 0,9652 3,05 90,2±3,05 1,07
Пропранолол 87,46 1,4493 1,2094 0,3807 0,8490 2,68 87,46±2,68 0,97
Талинолол 92,01 1,7118 1,3083 0,4137 0,9266 2,92 92,01±2,92 1,00
Извлечение из крови смесью растворителей хлороформ-изопропанол (9 : 1)
Бетаксолол 82,57 7,4934 2,7374 0,8656 1,9301 6,10 82,571±6,10 2,34
Бисопролол 73,09 4,5321 2,1289 0,6732 1,5013 4,75 73,09±4,75 2,05
Метопролол 80,28 9,4662 3,0767 0,9729 2,1691 6,86 80,28±6,86 2,70
Пропранолол 84,80 13,04 3,6111 1,1419 2,5465 8,05 84,80±8,05 3,00
Талинолол 84,0 5,1178 2,2622 0,7154 1,5953 5,04 84,0±5,04 1,90
Извлечение из мочи атенолола смесью растворителей хлороформ-изопропанол (3 : 2)
Атенолол 63,7 4,2277 2,0537 0,6494 1,4482 4,58 63,7±4,58 2,27
Извлечение из крови атенолола смесью растворителей хлороформ-изопропанол (3 : 2)
Атенолол 53,5 4,94 2,2226 0,7028 1,5673 4,96 53,5±4,96 3,53
Выводы. Разработаны и валидированы методики ЖЖЭ Р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола, талинолола) из биологических жидкостей (крови и мочи), их идентификации и количественного определения методом ВЭЖХ.
Список литературы
1. Гиляревский С. Р. Роль бета-блокаторов в лечении артериальной гипертензии: мнения, доказательства и реальная практика / С. Р. Гиляревский // Лечащий врач. — 2008. — № 6. — С. 71-74.
2. Кокорина Н. О. Идентификация Р-адреноблокаторов хроматографическим методом / Н. О. Кокорина, В. П. Новоселов, М. А. Ханина // Фармация. — 2009. — № 7. — С. 23-30.
3. Кокорина Н. О. Опыт применения скринингового метода определения лекарственных препаратов в биологических жидкостях методом ВЭЖХ / Н. О. Кокорина, М. А. Ханина // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики / Под ред. В. П. Новоселова, Б. А. Саркисяна, В. Э. Яновского. — Новосибирск — Красноярск : Межрегиональная ассоциация «Судебные медики Сибири», 2007. — Вып. 12. — Ч. 2. — С. 51-53.
4. ОСТ 42-510-98. Правила организации производства и качества лекарственных средств (GMP) : стандарт отрасли. — М., 1998.
5. Guidance for Indastry. Bioanalytical Method Validation // Center for Drug Evaluation and Research, U. S. Food and Drug Administration, U. S. Department of Yealth and Services, Rockville. — Maryland. — May, 2001.
DEFINITION OF SOME p-ADRENOCEPTOR BLOCKING AGENTS IN BIOLOGICAL LIQUIDS BY «HELC» METHOD
N.О. Kokorina1, V.P. Novoselov1'2, M.A. Khanina2
1SBHE «Novosibirsk regional bureau of medicolegal investigation» (Novosibirsk c.)
2SEIHPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment» (Novosibirsk c.)
Conditions (pH, extractant) liquid - liquid abstraction of P-adrenoceptor blocking agents (atenolol, betaxolol, bisoprolol, metoprolol, propranolol, talinolol) from biological liquids of person (urina, blood) are picked up, technique of their identification and quantitative definition by method of highly effective liquid chromatography (HELC) is developed and put to validization.
Keywords: P-adrenoceptor blocking agents, biological liquids, liquid - liquid abstraction, HELC, identification, quantitative definition.
About authors:
Kokorina Natalia Olegovna — head of judicial and chemical unit of Novosibirsk regional bureau of medicolegal investigation at SBHE «Novosibirsk regional bureau of medicolegal investigation», office number: 8 (383) 346-39-21, e-mail: kokorina@sibsme.ru
Novoselov Vladimir Pavlovich — doctor of medical sciences, professor, honored doctor of the Russian Federation, head of legal medicine department at GBOU VPO «Novosibirsk state medical university», SBHE «Novosibirsk regional bureau of medicolegal investigation», office number: 8 (383) 346-00-19, e-mail: sme@sibsme.ru
Khanina Minisa Abdullaevna — doctor of pharmaceutical sciences, professor, head of pharmacognosy and botany chair at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment», work phone: 8 (383) 225-07-13, e-mail: khanina06@mail.ru
List of the Literature:
1. Gilyarevsky S. R. Role of beta-blockers in treatment of arterial hypertension: opinions, proofs and real practice / S. R. Gilyarevsky // Attending physician. - 2008. - № 6. - P. 71-74.
2. Kokorina N. O. Identification P- adrenoceptor blocking agent with chromatographic method / N. O. Kokorina, V.P. Novoselov, M. A. Khanina // Pharmaceutics. - 2009. - № 7. - P. 23-30.
3. Kokorina N. O. Experience of application of sreaning method for definition of medicinal preparations in biological liquids with HELC method / N. O. Kokorina, M. A. Khanina // Actual issues of forensic medicine and expert practice / Under the editorship of V. P. Novoselov, B. A. Sarkisyan, V. E. Yanovsky. - Novosibirsk - Krasnoyarsk: Interregional association «Judicial physicians of Siberia», 2007. - Is. 12. - №. 2. - P. 51-53.
4. AUS 42-510-98. Rules of production organizations and quality of medicines (GMP): branch standard. - M, 1998.OCT 42-510-98.
5. Guidance for Indastry. Bioanalytical Method Validation // Center for Drug Evaluation and Research, U. S. Food and Drug Administration, U. S. Department of Yealth and Services, Rockville. - Maryland. - May, 2001.
