CC BY
28
© Романов Б.К., 2004
УДК 615.074:577.152.081
МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРДИОТРОПНЫХ СРЕДСТВ В КАРДИОМИОЦИТАХ КРОВИ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОИНЪЕКЦИОННОГО АНАЛИЗА
Б. К. Романов
Кафедра фармакологии фармацевтического факультета Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова
Статья посвящена описанию нового метода оценки количественного содержания кальцийрегулирующих кардиотропных средств в кардиомиоцитах млекопитающих методом проточно-инъекционного анализа.
Важнейшим элементом фармакологического исследования является количественное определение исследуемого лекарственного вещества. Это создает предпосылки для доказательного проведения корреляционных взаимосвязей оцениваемых параметров в условиях экспериментального моделирования и его фармакоте-рапевтической коррекции.
Идентификация и количественный анализ лекарственных веществ может проводится по методикам, регламентированным соответствующими фармакопейными статьями. К сожалению, для большого количества лекарственных веществ, методы исследования, применимые к лекарственным формам, не могут быть применены в условиях анализа биологических сред. Причинами этого являются низкая концентрация исследуемого вещества (особенно кардиотропных и психотропных средств), и сложность пробоподготов-ки исследуемого материала, связанная с наличием большого количества балластных веществ.
Для решения задач качественного и количественного анализа в последние годы наиболее широко применяются методы проточно-инъекционного анализа (ПИА), базирующиеся, прежде всего, на гради-
ентных высокоэффективных системах газовой или жидкостной хроматографии с масс-селективным или спектрофотометрическим детектированием анализируемого вещества в проточных кюветах [1].
Предлагаемая методика позволяет проводить количественное исследование в гомогенате кардиомиоцитов млекопитающих лекарственных средств, относящихся к различным химическим группам.
I. Пробоподготовка
Животное (белая крыса) помещается в закрытый эксикатор, на дно которого предварительно укладывается ватный тампон, смоченный эфиром для наркоза. После достижения хирургической стадии эфирного рауш-наркоза, оцениваемой по прекращению двигательной активности скелетной мускулатуры, при сохраненном дыхании и сердцебиении, животное захватывается корнцангом и переносится из эксикатора на операционный столик.
Хирургическими ножницами рассекается передняя брюшная стенка и диафрагма, сердце выводится марлевым тампоном в разрез и затем отсекается у основания. Предсердия отсекаются, а полученный миокард желудочков быстро промывается от крови в ледяном (0-4°С) изотоническом
растворе хлорида натрия, высушивается на беззольной фильтровальной бумаге и взвешивается на электронных весах «OHAUS».
Гомогенат готовится из ткани миокарда левого желудочка, после быстрого рассечения ножницами на мелкие части. Необходимое количество перемешанных кусочков миокарда левого желудочка немедленно гомогенизируется до суспензированного состояния (60 секунд при 1500 об/мин) в гомогенизаторе «Diax 900» (насадка «06G») в 50 объемах 0,15 М ледяного (0-4°С) раствора хлорида натрия для получения исходного гомогената.
500 мкл исходного гомогената помещается пипеточным дозатором с одноразовым наконечником на 500 мкл в пластиковую центрифужную пробирку с упорными плечиками и с герметичной пластиковой крышкой. Содержимое пробирок подвергается быстрому замораживанию до -70°С в морозильной установке «Sanyo» (Япония), затем пробирки загружаются в ультразвуковую ванну «Сонар» (Россия) на 5 минут (температура воды в ванне - 37°С), после чего гомогенат центрифугируется в микроцентрифуге «Eppendorf 5403» при 1500 g в течение 10 минут. Выход надосадка - безъядерного гомогената, составляет не менее 200 мкл.
200 мкл безъядерного гомогената помещается пипеточным дозатором с одноразовым наконечником на 200 мкл в пластиковую центрифужную пробирку с упорными плечиками и с герметичной пластиковой крышкой. Препаративное ультрацентрифугирование проводится при 4°C в на-
польной препаративной центрифуге «J-6M» при 20000 g в течение 30 минут, с контролем седиментации частиц в интерференционной системе Рэлея.
Надосадочная жидкость (лизосомаль-но-митохондриальная фракция) отфильтровывается на тефлоновом мембранном элюационном фильтре «Hamilton» с диаметром отверстий 0,45 мкм. Выход для ВЭХЖ при давлении на поршень в 8 кг составляет 100 мкл [4].
II. ВЭЖХ-спектрофотометрическое определение концентрации лекарственных средств методом ПИА
Определение концентрации лекарственных веществ различной степени полярности - верапамила, дилтиазема, дигоксина и нонахлазина проводится в полученном конечном гомогенате миокарда методом обращенно-фазового высокоэффективного жидкостного хроматографического анализа в градиентной системе «Stayer» фирмы Аквилон [1].
Особенностью системы «Stayer» является способность к формированию состава подвижной фазы на линии высокого давления и, тем самым, к реализации ВЭЖХ-метода анализа с градиентным элюированием компонентов разделяемой смеси.
В системе используются исключительно полимерные (ПИИК) коммуникации, материал которых не вступает в реакции взаимодействия с компонентами анализируемых смесей.
Внешний диаметр коммуникаций высокого давления составляет 1/16”.
Внутренние диаметры капилляров высокого давления:
Место установки Внутренний диаметр
От насоса до смесителя 0,5 мм
От смесителя до инжектора 0,25 мм
От инжектора до колонки 0,17 мм
От колонки до детектора 0,25 мм
Коммуникации низкого давления (за исключением промывных), изготовлены из тефлона.
Объем петли инжектора, в которую шприцом Хамильтона вводится проба конечного гомогената - 50 мкл.
В состав системы для работы с неустойчивыми, летучими или короткоживу-щими соединениями могут быть включены дополнительные устройства - термостат колонок, системы постколоночной дериватизации, системы пробоподготов-ки и концентрирования образца, рециклер растворителя, мембранные системы подавления фоновой электропроводности (для ионной хроматографии), дополнительные защитные системы (фильтры, колонки) и т.д.
Наибольшие сложности в работе, как правило, связаны с подбором необходимого материала колонок для хроматографической системы. Анализ литературных данных [2, 3] и наш собственный опыт [1] работы с различными группами кардио-тропных лекарственных средств позволяет рекомендовать следующие стационарные (неподвижные) фазы для выбора конкретного материала хроматографических колонок:
Si (Silica) - классический нормально фазовый материал - немодифицирован-ный силикагель. Применяется для разделения полярных неионных органических соединений.
С1 (TMS, SAS) - обращенно-фазовый материал, обладающий высокой селективностью при разделении полярных соединений и соединений с большим количеством функциональных групп. Менее всего удерживает соединения с алкильными группами в неполярных растворителях.
С2 (RP-2) - обращенно-фазовый материал, обладающий меньшим чем С4, С8 и С18 и большим, чем С1 удерживанием.
С3 - обращенно-фазовый материал, применяемый в так называемой хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) пептидов и белков.
С4 - обращенно-фазовый материал, применяемый для HIC и ион-парной хроматографии. В неполярных растворителях обладает меньшим удерживанием, чем фазы С8 и С18. Данный материал является идеальным для анализа больших белков и гидрофобных пептидов.
С5 - обращенно-фазовый материал. Может использоваться для обращенно-фазового разделения гидрофобных белков и пептидов. Более устойчив к гидролизу чем С4.
С6 - обращенно-фазовый материал. Применяется для ион-парной хроматографии. Обладает меньшим удерживанием, чем С8 и С18.
С8 (MOS, RP-8, LC8) - обращенно-фазовый материал. По селективности близок к С18, однако обладает меньшим по сравнению с ним удерживанием. Широко используется в анализе лекарств, нуклеотидов, стероидов и т.д. Этот материал хорошо подходит для разделения пептидов и небольших гидрофильных белков.
С18 (ODS, RP-18, LC-18) - классический обращенно-фазовый материал, обладающий наибольшим удерживанием в неполярных растворителях. Прекрасно работает в ион-парной хроматографии. Имеет широчайший спектр применений (разделение не только кардиотропных средств, но и пептидов, нуклеозидов, нуклеотидов, стероидов, витаминов, жирных кислот и пр.). Этот материал используют также для разделения небольших гидрофильных пептидов.
Phenyl - обращенно-фазовый материал с уникальной селективностью, используемый для разделения ароматических соединений и для HIC.
CN (CPS, PCN) - может применяться как нормально-фазовый, так и обращенно-фазовый материал. Будучи слегка полярной, эта фаза обладает отличной селективностью при разделении полярных соединений в нормально-фазовой и об-ращенно-фазовой хроматографии. Кроме того, сорбенты данного типа быстро уравновешиваются, что является ценным свойством при работе в режиме градиентного элюирования. Данный материал используется для анализа различных фарм. препаратов (например, антидепрессантов и пр.).
NH2 (APS) - этот материал можно использовать для нормально-фазовой, обращенно-фазовой и ионообменной хроматографии (слабый анионообмен-ник). В обращенно-фазовой хроматографии используется для разделения углеводов. В нормально-фазовой хроматографии сорбенты данного типа по селективности являются хорошей альтернативой немодифицированному селикагелю, при этом они не деактивируются небольшими количествами воды. В ионообменной хроматографии, являясь слабыми анио-нообменниками, применяются для разделения анионов и органических кислот с использованием в качестве подвижных фаз буферных растворов.
NO2 - нормально-фазовый материал, используемый для разделения ароматических соединений и соединений с двойными связями.
OH (Диол, глицерол) - может применяться как нормально-фазовый, так и об-ращенно-фазовый материал. При работе в качестве обращенной фазы используется в гельфильтрационной хроматографии (GFC) пептидов и белков. При использовании в нормально-фазовом варианте обладает сходной с немодифицированным селикагелем селективностью, но не деактивируется небольшими количествами
воды.
SAX (SB, четвертично аммонийное сильное основание) - ионообменный материал, сильный анионообменник (основание). Используется для разделения нуклеотидов, нуклеозидов и органических кислот.
SCX (SA, сульфопропил) - ионообменный материал, сильный катионооб-менник (кислота). Используется для разделения органических оснований и катионов металлов.
WAX (DEAE, диэтиламиноэтил) и PEI (полиэтиленимин) - ионообменные материалы. Слабые анионообменники (кислоты), наиболее широко применяемые для анализа кислых белков и пептидов.
WCX (CM, карбоксиметил) - ионообменный материал. Слабые катионооб-менники (основания) наиболее широко применяемые для анализа основных белков и пептидов.
Методические рекомендации по методике качественного и количественного анализа таких лекарственных средств, как дигоксин, верапамил, дилтиазем и нонах-лазин:
Градиент подвижной фазы образовывают на линии высокого давления, в колонке Phenomenex (модель LUNA C-18, размеры - 150x4,6 мм, диаметр пор - 5 ц) с октадецилом, в подвижной фазе - 1% водный раствор ортофосфорной кислоты (неорганический растворитель) и ацетонитрил (органический растворитель), объем потока 1 мл в минуту, градиент давления 300-100 атмосфер, температура колонки 15-25 градусов, длительность программы - 20 минут с изменением концентрации (градиента) ацетонитрила по следующей программе:
1. С 0 до 3 минуты - 10%;
2. 3-6 минут - увеличение концентрации ацетонитрила с 10% до 25%;
3. С 6 по 8 минуту - 25%;
4. С 8 по 16 минуту - увеличение концентрации ацетонитрила с 25% до 65%;
5. С 16 по 20 минуту - 65%;
6. Уменьшение концентрации ацетонитрила до 10% на 20 минуте;
7. С 20 по 30 минуту - 10% (промывка колонки).
Калибровка проводится методом внутреннего стандарта водными растворами анализируемых лекарственных средств. Захват пиков производится в сканирующем режиме работы спектрофотометра (ИР/УГО). Анализ хроматограмм проводится в среде “Мультихром” (версия 2.0) на рабочей станции в среде Windows.
Верапамил, дилтиазем и нонахлазин дают на выходе монопики, не накладывающиеся друг на друга, и на пики других веществ.
Дигоксин, вследствие гидролитического расщепления в присутствии орто-фосфорной кислоты на гликон и агликон, выходит в виде двух пиков, также изолированных от других компонентов хроматограммы:
1. На 4,17 минуте, при градиенте концентрации ацетонитрила с 10% до 25% - полярная водорастворимая часть (гликон) - Б-дигитоксоза;
2. На 10,8 минуте, при градиенте кон-
центрации ацетонитрила с 25% до 65% - неполярная жирорастворимая часть (агликон).
Соотношение концентраций (площадей под пиками) составляет 17,43 и 83,45 для первого и второго пика соответственно.
Предлагаемая методика пробоподго-товки и реализации ПИА посредством ВЭЖХ-системы при условии проведения исследования спустя 2,5-3,0 часа после запуска системы (для выхода на рабочий режим), и стабильности температуры среды ± 1°С позволяет проводить качественный и количественный анализ с точностью до 5Х10"4.
ЛИТЕРАТУРА
1. Макарова В.Г. Анализ кардиотропных лекарственных средств методом градиентной высокоэффективной жидкостной хроматографии / В.Г. Макарова, Б.К. Романов, Т.А. Кузьмина // Актуальные вопросы здоровья населения Центра России. - Рязань, 2000. - С. 50-52.
2. Versino B., Geyb F. // Сhromatographia. -2000. - N3 (Suppl.).
3. Modern Practice of Liquid Сhromatography / Ed. J.J. Kirkland. - New York: Wiley, 2001.
4. Карпищенко А.И. Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы) / А.И. Карпищенко. - СПб., 2001. - С.36-47.
THE QUALITATIVE DETERMINATION OF CARDIOTHROPIC MEANS IN BLOOD CARDIOMYOCYTES BY DUCT-INJECTION ANALYSIS
B.K. Romanov
The article is devoted to a new method of qualitative determination of calcium-regulating cardiothropic means by duct-inject method.
