CC BY
47
УДК 611.018.63
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВКЛАДА ЗНАЧИМЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ В ФОРМИРОВАНИЕ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ МИОКАРДА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ
Л.Г.Прошина, Л.М.Антонова, Н.П.Федорова, О.С.Быкова, М.В.Григорьева, Е.А.Викторова
Институт медицинского образования НовГУ, [email protected]
Изучены гистохимические и иммуноцитохимические особенности кардиомиоцитов в экспериментальных моделях стресса и диабета. Выявлено, что стресс и диабет вызывают функциональную и структурную перестройку тканей миокарда. Реактивные изменения клеток и тканей миокарда носят адаптивно-компенсаторный характер.
Ключевые слова: адаптация, стресс, гистохимия, иммуноцитохимия, кардиомиоциты, экспериментальный диабет
The histochemycal and immunocytochemycal characteristics of cardiomyocytes in experimental stress and diabetes are investigated. It is found that stress and diabetes result in functional and structural changes of myocardium tissues. Responsive changes in the cells and tissues of myocardium are adaptive-compensatory in nature.
Keywords: adaptation, stress, histochemestry, immunocytochemestry, cardiomyocytes, experimental diabetes
Исследование морфологических основ адаптивных, реактивных и регенераторных изменений миокарда при патологии различного генеза, в частности при стрессе и диабете, является важной составляющей современной медицины. Неоднозначны обсуждаемые вопросы влияния сахарного диабета на процессы регенерации и репарации, а также негативного воздействия его на сердечно-сосудистую систему.
Целью исследования явилось определение вклада значимых показателей морфологических изменений в формирование адаптивных реакций миокарда при экспериментальных воздействиях.
Материалы и методы исследования
Исследование выполнено на крысах-самцах линии Вистар массой 250 г. Животные были разделены на группы:
1 — интактные животные, содержащиеся в обычных условиях вивария.
2 — животные в условиях экспериментального стресса (ЭС). Модель стресса получали путем 10-20-минутного плавания крыс до глубокого утомления в течение 14 дней. В основу формирования модели легли собственные экспериментальные разработки [1] с анализом литературного материала [2]. В качестве критериев развития стресса служили органы стресс-маркеры (надпочечники и тимус), а также критерий выживаемости животных.
3 — животные в условиях экспериментального аллоксанового диабета (АД). Модель аллоксанового диабета формировали путем внутрибрюшинного введения аллоксана в дозе 20 мг/100 г.
С целью изучения морфофункционального состояния миокарда крыс линии Вистар использовали методы световой и электронной микроскопии, а также световой гистохимии. Гистологическую проводку осуществляли по общепринятым методикам. Для элек-тронномикроскопического исследования миокарда ткань фиксировали в 2,5 глутаровом альдегиде на 0,1 М фосфатном буфере в течение 12 часов при 4°С. Заливку материала осуществляли с использованием эпоксидных смол эпон-аралдит, срезы контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца. Для получения представления о метаболической активности кардио-
миоцитов использовали комплекс методов исследования цитохимической активности ключевых ферментов — сукцинатдегидрогеназы (СДГ), лактатдегидрогена-зы (ЛДГ) и гликогена (Г) — по З.Лойда и соавт. (1982).
Результаты исследования
Морфометрический анализ миокарда интакт-ных животных показал, что при средней массе крыс 250,0±16,2 г масса сердца составляет 951,0±41,6 мг. Относительная масса сердца к массе тела (мг на 1 г) равняется 3,8. Ядра кардиомиоцитов овальной формы, светлые, содержат глыбки гетерохроматина и одно или два ядрышка. Диаметр сократительных кар-диомиоцитов контрольных животных составляет 15,2±0,6 мкм, объемная плотность равняется 85,51±5,20 об.%; межклеточное вещество (включающее аморфное вещество и коллагеновые волокна) — 14,49±0,11 об.%. Строма миокарда представлена соединительной тканью, в которой располагаются тонкие пучки коллагеновых волокон. Среди клеточных элементов соединительной ткани преобладают фиб-робласты; тучные клетки встречаются редко и располагаются около сосудов.
Ультраструктура кардиомиоцитов демонстрирует типичное клеточное строение с центрально расположенным ядром (рис.1).
Рис.1. Ультраструктура сократительного миокарда левого желудочка контрольных животных, x8QQQ
Кардиомиоциты отличаются умеренной электронной плотностью цитоплазмы. Оболочки соседних сердечных миоцитов формируют в продольном направлении узкую межклеточную щель. Миофибрил-лы располагаются параллельно продольной оси клеток, а перпендикулярно — выявляются вставочные диски. Вставочные диски выглядят в виде зигзагообразной линии и пересекают миофибриллы на уровне телофрагмы. Между миофибриллами в виде тяжей располагаются митохондрии, имеющие, как правило, овальную форму (рис.1). Среди митохондрий лежат разнообразной формы лизосомы. Пластинчатый комплекс развит относительно слабо и представлен пузырьками, трубочками и цистернами. В миокардиаль-ных клетках выявляются гранулы гликогена, которые располагаются либо одиночно, либо формируют ассоциации между миофибриллами.
Гистологическая картина миокарда в обеих экспериментальных группах характеризовалась отчетливой гетерогенностью популяции кардиомиоцитов. Среди обычных сердечных миоцитов располагаются гипертрофированные и атрофированные. Плотность кардиомиоцитов составила 81,62±0,7 об.% при ЭС и 83,3±0,5 об.% при АД. На долю соединительной ткани приходится 18,38±0,4 об.% и 16,7±0,5 об.% соответственно. Имеет место отек, разрыхление периваскуляр-ной соединительной ткани. Часть капилляров расширены, полнокровны. Клетки эндотелия набухшие, выступают в просвет капилляров. Ряд кардиомиоцитов инфильтрированы мононуклеарными клетками. Миофибриллы претерпевают контрактурные изменения. В одном поле зрения количество клеток, измененных по контрактурному типу, при ЭС составило 18,6±0,5%, а при АД 21,1±0,5%. В кардиомиоцитах с контрактур-ными повреждениями миофибрилл отмечаются сморщенные ядра, которые смещены к периферии клеток.
Исследование миокарда выявило изменения кардиомиоцитов трех типов: в виде контрактур, первичного глыбчатого распада миофибрилл и внутриклеточного миоцитолизиса (рис.2).
Выраженность структурных изменений миокарда и сосудов представлена в табл. 1.
Анализ данных морфометрии показал, что диссоциация кардиомиоцитов, развивающаяся при ал-локсановом диабете, более выражена (увеличение в 1,3 раза) по сравнению с группой животных при экспериментальном стрессе. Кардиомиоциты с картиной глыбчатого распада превалировали (увеличение в 1,3 раза) у крыс со стрессом. Обращают на себя внимание явления миоцитолизиса, ярко выраженные как при диабете, так и при стрессе, но этот процесс на 15,9% был выше при аллоксановом диабете. Контрактурные изменения выявлялись в обеих экспериментальных группах, хотя при экспериментальном стрессе превалировали сегментарные контрактуры.
Таблица 1
Сравнительная характеристика изменений кардиомиоцитов и сосудов в экспериментальных группах (в процентах)
Характеристика изменений миокарда и сосудов Контроль ЭС АД
Диссоциация кардиомиоцитов 12,4±0,3 26,3±0,6* 33,1±0,7*
Фрагментация кардиомиоцитов 9,8±0,2 38,4±0,7* 31,6±0,5*
Глыбчатый распад кардиомиоцитов 7,3±0,4 21,9±0,5* 16,1±0,4
Внутриклеточный отек 8,7±0,3 34,1±0,4* 57,04±0,5*
Субсегментарные контрактуры 12,3±0,3 18,6±0,5 21,1±0,6*
Сегментарные контрактуры 7,2±0,2 19,7±0,5* 12,6±0,3
Миоцитолизис 5,8±0,1 18,6±0,4* 34,5±0,5*
Стазы эритроцитов 6,2±0,3 21,9±0,6* 41,5±0,7*
Стазы лейкоцитов 5,9±0,1 14,2±0,5* 43,7±0,6*
Примечание: * — p < 0,05, по сравнению с контролем.
Рис.2. Окраска по Ли. а — глыбчатый распад кардиомиоцитов при экспериментальном стрессе, диссоциация, миоцитолизис, х400. б — фрагментация кардиомиоцитов при экспериментальном диабете, расширение межклеточного пространства, ярко выраженная фуксинофилия в отдельных кардиомиоцитах (гипоксия кардиомиоцитов), х200
Данные полуколичественного анализа миокарда обеих экспериментальных групп продемонстрировали большую частоту деструктивных изменений и выраженность содержания клеток немышечного гене-за при стрессе по сравнению с диабетом (табл.2)
Таблица 2 Полуколичественная оценка основных морфологических признаков повреждения миокарда (световая микроскопия)
Признак Контроль ЭС АД
Поперечная исчерченность +++ + +
Степень повреждения ткани - +++ ++
Кровоизлияния - - -
Немышечные клетки + +++ ++
Контрактурные ++ +
изменения
Как при аллоксановом диабете, так и при экспериментальном стрессе прослеживается снижение метаболической активности исследуемых ферментов и, следовательно, функциональных возможностей кардиомиоцитов, однако интенсивность падения энзимов в различных ситуациях неоднозначна, что, очевидно, свидетельствует о различном вкладе исследуемых ферментов в патогенез диабета и стресса (рис.3).
—в- _
* ¡: —
Ш -
СДГ
□ К
ЛДГ
□ АД ПЭС
гликоген
Рис.3. Активность СДГ, ЛДГ и гликогена в кардиомиоцитах крыс линии Wistar в I, II и III экспериментальных группах. * — p < 0,05, по сравнению с контролем
Количественный анализ ферментов манифестировал падение активности дыхательных ферментов. Активность СДГ снизилась на 20% при АД, на 13% — при ЭС, активность ЛДГ уменьшилась на 40 и 69%, гликогена — на 63 и 19% соответственно (относительно контрольных животных).
Цитохимическая активность СДГ и ЛДГ продемонстрировала неравномерное расположение гранул формазана в кардиомиоцитах. Параллельно выявлено исчезновение гранул гликогена в значительной части сердечных миоцитов.
Анализ ультраструктурной организации кар-диомиоцитов позволил выявить явления слабо выра-
женного отека ряда сердечных миоцитов в обеих экспериментальных ситуациях. Миофибриллы практически имели обычное строение. Электронномикроско-пическое исследование выявило значительную гетерогенность и деструктивность митохондрий: среди обычных появились гигантские формы. Встречаются митохондрии с фрагментацией и дугообразным стоянием крист, имеет место набухание и гомогенизация (рис.4). Среди деструктивно-измененных митохондрий видны миелиновые фигуры.
Рис.4. Миелиновые структуры, митохондрии с нарушенной ориентацией крист, часть митохондрий претерпевают деструктивные изменения. Встречаются липидные капли. х12000
Митохондрии находятся в различном состоянии: часть из них сопоставимы с группой интактных животных. Количественный анализ электронных микрофотографий свидетельствует о преобладании содержания митохондрий (18,7±0,3) при аллоксановом диабете, в сравнении с животными при стрессе (13,5±0,5), однако их уровень меньше контрольных крыс (24,0±0,5). Число липидных включений при ЭС значительно уменьшено, а в ряде электронных микрофотографий липидные капли практически не встречались (рис.5).
Рис.5. Деформация митохондрий с нарушенной ориентацией крист, разволокнение миофибриллярного аппарата, изменение соотношения темных и светлых дисков в кардиомиоцитах крыс с ЭС, х12000
В области дисков отмечались очаги разрушения миофиламентов. Пучки миофибрилл разобщены, миофиламенты гомогенизированы с нечеткими контурами (рис.5). При АД визуально наблюдается по-
вышенное содержание лизосом и липидных капель. Имеет место выраженный отек саркоплазмы.
Наряду с деструктивными явлениями в миокарде крыс при стрессе и АД обращают на себя внимание полиморфизм и аморфность ядер клеток сократительного миокарда с индукцией образования в них ядрышкового аппарата. Крупные кардиомиоциты содержат гипертрофированное ядро или два ядра. Одноядерные кардиомиоциты имеют одно или два ядрышка с четко контурированным хроматином. Эти изменения могут быть истолкованы как признаки регенераторных процессов в поврежденном миокарде и отмечаются, как правило, при восстановлении поврежденных клеток. Описанные явления коррелируют с увеличением объемной плотности кардиомиоцитов. Вышеописанная морфофункциональная реакция кар-диомиоцитов может быть расценена как проявление процессов регенерации основных структурных компонентов миокарда. Увеличение содержания немышечных клеток, возможно, является адаптивным звеном перестройки миокарда в ответ на экспериментальные воздействия.
Таким образом, вовлечение миофибриллярно-го, митохондриального, ядерного аппаратов при экспериментальном стрессе и аллоксановом диабете в ответные реакции миокарда позволяют определить их
в качестве значимых показателей развития адаптивных и патологических реакций кардиомиоцитов, а также выявить их вклад в патогенез представленной экспериментальной патологии.
Научно-исследовательская работа выполнена в рамках реализации федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 годы.
1. Schegoleva A.N., Koplik E.V., Proshina L.G. Influence of emotional stress on the functional morphology of the cardiac muscle tissue // Actual problems of modern medicine. 2006. V.8. P.176-177.
2. Казаков В.А., Суходоло И.В., Шипулин В.М., Миллер А.А. Ультраструктурные аспекты постинфарктного ре-моделирования левого желудочка // Сибирский медицинский журнал. 2009. №4. Вып.1. С.6-11.
Bibliography (Translitеrated)
1. Schegoleva A.N., Koplik E.V., Proshina L.G. Influence of emotional stress on the functional morphology of the cardiac muscle tissue // Actual problems of modern medicine. 2006. V.8. P.176-177.
2. Kazakov V.A., Sukhodolo I.V., Shipulin V.M., Miller A.A. Ul'trastrukturnye aspekty postinfarktnogo remodelirovaniya levogo zheludochka // Sibirskiy meditsinskiy zhurnal. 2009. №4. Vyp.1. S.6-11.
