CC BY
66
УДК 611.018.63.
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ РЕОРГАНИЗАЦИЯ МИОКАРДА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИАБЕТЕ Л.М.Шевцова, О.С.Быкова, Н.П.Федорова, М.В.Григорьева, Н.Н.Максимюк MYOCARDIUM MORPHOLOGIC REORGANIZATION IN EXPERIMENTAL DIABETES
L.M.Shevtsova, O.S.Bykova, N.P.Fedorova, M.V.Grigor'eva, N.N.Maksimiuk
Институт медицинского образования НовГУ, Lyubov.Shevtsova@novsu.ru
Изучены морфологические особенности реорганизации миокарда при аллоксановом диабете. Проанализировано состояние эндотелиальных клеток сосудистого русла миокарда. Выявлено, что экспериментальный диабет вызывает структурно-функциональную перестройку тканей миокарда, которая носит адаптивный и компенсаторный характер. В морфологическую реорганизацию вовлечены ткани сосудистого русла миокарда. Ключевые слова: миокард, аллоксановый диабет, адаптация
We studied morphological features of myocardium reorganization in alloxan diabetes. The state of endothelial cells of vascular bed of the myocardium is analyzed. It is revealed that experimental diabetes causes structural and functional change in the myocardium which is adaptive and compensatory in nature. The myocardium vasculature is involved in morphologic reorganization.
Keywords: myocardium, alloxan diabetes, adaptation
Патологические изменения сердечнососудистой системы, развивающиеся на фоне сахарного диабета, являются проблемой современной медицины. При сахарном диабете (СД) частота развития сердечно-сосудистой патологии в 3-4 раза выше по сравнению с лицами без СД [1]. Объединение сердечно-сосудистой патологии и сахарного диабета существенно отягощает течение каждого из них. Несмотря на значительные результаты, достигнутые в области фундаментальной медицины, остаются открытыми вопросы, связанные с уточнением клеточных и молекулярных механизмов повреждения миокарда, развивающихся на фоне сахарного диабета [2,3]. Нуждаются в уточнении и вопросы взаимодействия клеточных и неклеточных элементов миокарда в экспериментальных и патологических условиях. Исследование морфологической реорганизации кар-диомиоцитов в процессе развития той или иной патологии является особенно важным как для понимания процессов клеточного ремоделирования миокарда и сердца в целом, так и для оптимизации способов коррекции возникающих деструктивных изменений в тканях сердца. Неоднозначны на сегодняшний день сведения об иммуноцитохимических особенностях тканей миокарда при экспериментальном диабете, роли эндотелиоцитов сосудистого русла миокарда. Все это делает особо актуальным изучение диапазона морфологической реорганизации сердца при диабете и является основанием для выполнения данного вида исследования.
Материалы и методы исследования
Экспериментальное исследование выполнено на 135 крысах-самцах Wistar массой 150-250 г, полученных из питомника ФГПУ «Рапполово» РАМН (Ленинградская обл.). Животные содержались в стандартных условиях вивария, с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях, а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96) и Приказа МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP). Сформировано две группы животных: ин-тактные (50 крыс) и с аллоксановым диабетом (85 крыс). Модель диабета (ЭД) считали сформированной с учетом показателей содержания глюкозы, глюкозо-инсулинового индекса, состояния эндокринной части поджелудочной железы. Содержание глюкозы в сыворотке крови определяли глюкозоок-сидантным методом. Радиоиммунным методом проводили определение иммунореактивного инсулина (ИРИ) в плазме крови. Оценивали глюкозо-инсулиновый индекс (ГИИ) — отношение концентрации глюкозы в ммоль/л к концентрации ИРИ в мкЕд/мл. Состояние эндокринной части поджелудочной железы анализировали по гистологическим препаратам, окрашенным гематоксилином и эозином. Парафиновые срезы миокарда, поджелудочной железы для морфологического исследования окрашивали гематоксилином-эозином по Ван-Гизону, а
также альдегид-фуксином, анализировали с использованием светооптического бинокулярного микроскопа AxioscopeAl (Carl Zeiss, Германия). В работе оценивали интенсивность перекисного окисления липидов в миокарде по содержанию ДК (диеновых конъюгатов) и МДА (малонового диальдегида) вторичного продукта (методом Asacawa Т., 1980). О состоянии антиоксидантной системы судили по активности супероксиддисмутазы. Для оценки содержания коллагена выполнялось иммуногистохимиче-ское (ИГХ) исследование парафиновых срезов миокарда толщиной 5 мкм, применялся иммуноперок-сидазный метод с использованием аффинно-очищенных кроличьих поликлональных первичных антител к антигенам коллагена I и III типов. Оценка результатов проводилась в 10 произвольно выбранных полях зрения при 200-кратном увеличении. Для определения содержания сократительных белков в миокарде использовали моноклональные антитела к тубулину, десмину, миозину и тропонину (фирма «Sigma», США), вторичные антитела, конъюгиро-ванные с пероксидазой хрена (фирма «Boehringer Manheim», Германия). Для оценки повреждения эндотелия был использован метод определения количества циркулирующих эндотелиоцитов [4]. Результаты исследования обработаны с применением программ статистического анализа Microsoft Excel 2003 и пакета программ Statistica 6,0 (Stat-Soft, 2001).
Результаты и их обсуждение
Формирование модели экспериментального сахарного диабета подтверждалось значительными структурными изменениями в эндокринном аппарате поджелудочной железы. Центрально расположенные клетки островка Лангерганса претерпевают деструктивные изменения. Происходило уменьшение числа и объемной плотности панкреатических островков (ОПО) (табл.1), их деформация, появление в них зон некроза. Реакция на инсулин-содержащие В-клетки с альдегид-фуксином практически отсутствовала, что указывало на угнетение диабетогенным агентом биосинтеза гормона. На препаратах, окрашенных гематоксилином-эозином, заметны явления гиперхромии ядер и деформации клеток, снижается плотность капилляров островка, деструктивно изменяются сосуды микроциркуляторного русла, отмечается периваскулярный отек.
Таблица 1
Морфологические изменения поджелудочной железы крыс линии Wistar на фоне экспериментального
аллоксанового диабета (M±m)
Серии эксперимента n М100мм2 ОПО, усл.ед.
Интактные животные 50 58,5±1,3 0,32±0,13
ЭД, 10 суток 28 37,9±1,1* 0,12±0,009*
ЭД, 14 суток 27 36,2±0,7* 0,11±0,008*
ЭД, 21 суток 30 37,5±0,7* 0,11±0,007*
Примечание: *p < 0,05 относительно интактных животных (контроля).
В течение первой недели после введения ал-локсана у крыс нарастало потребление воды, усиливался диурез, изменялись показатели глюкозы, ИРИ и ГИИ. Уровень глюкозы в крови поднимался до 19,40±0,18 ммоль/л, что в 4,5 раза выше значений ин-тактных крыс (4,29±0,44 ммоль/л). ГИИ существенно превышал «единицу» (табл.2).
Таблица 2
Состояние углеводного обмена по показателям плазмы крови крыс линии Wistar на фоне экспериментального аллоксанового диабета (М±т)
Серии эксперимента Глюкоза, ммоль/л ИРИ, мкЕд/мл ГИИ
Интактные животные 4,29±0,44 16,23±0,44 0,27±0,01
ЭД, 10 суток 19,4±0,18* 0,91±0,06* 22,50±1,41*
ЭД, 14 суток 18,37±0,25* 2,36±1,17* 8,35±0,73*
ЭД, 21 суток 18,31±0,23* 2,37±0,17* 8,17±0,61*
Примечание: * р < 0,05 относительно интактных животных.
Максимальный уровень летальности во всех экспериментальных группах с диабетом был отмечен на 3-5 сутки. Этот период соответствует развитию острой формы диабета, которая обычно приводит к гибели животных. У оставшихся диабетических крыс развивалась хроническая форма с разной степенью проявления симптомов заболевания. В целом летальность на протяжении эксперимента составляла от 31% до 38%. Потеря массы составила от 2,3±0,3% на 10-е сутки до 8,9±0,6% на 21-е сутки после введения аллоксана.
В экспериментальной группе с моделью аллок-санового диабета выявлены существенные изменения окислительно-восстановительного гомеостаза. Сравнительный анализ состояния перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной системы защиты (АОС) продемонстрировал: содержание ДК в тканях миокарда у интактных животных составляет 0,85±0,05 Е/г ткани, МДА — 0,691±0,031 нмоль/500 мг ткани в час. Активность СОД составляет 1,82±0,11 ед/мин.мг белка. При экспериментальном аллоксано-вом диабете наблюдается значительное повышение содержания продуктов ПОЛ на 215% и 126% соответственно. Активность ферментов АОС при ЭД снижается на 87% (р < 0,05 по сравнению с интактной группой).
На гистологических препаратах миокарда животных с ЭД выявлялась полиморфность популяции кардиомиоцитов (КМЦ). Наряду с типичными кардиомиоцитами располагались гипертрофированные, частично или полностью деструктивные клетки, поперечная исчерченность в которых (на светооптическом уровне) не просматривалась. Наблюдалась значительная вакуолизация саркоплазмы. Ядра имели неправильную форму, располага-
лись как в центре кардиомиоцитов, так и на периферии. Ряд кардиомиоцитов были инфильтрированы мононуклеарными клетками. Фибриллярный аппарат подвергался значительным преобразованиям. Миофибриллы претерпевали контрактурные изменения. В одном поле зрения количество клеток, модифицированных по контрактурному типу при ЭД, составило 21,1±0,5%. В кардиомиоцитах с контрактурными повреждениями миофибрилл отмечаются сморщенные ядра, которые были смещены к периферии клеток. Исследование миокарда выявило изменения кардиомиоцитов трех типов: в виде контрактур, первичного глыбчатого распада миофибрилл и внутриклеточного миоцитолизиса. Выраженность структурных изменений миокарда и сосудов представлена в табл.3.
Таблица 3
Сравнительная характеристика изменений кардиомиоцитов и сосудов при ЭД (в процентах)
Характеристика изменений миокарда и сосудов в экспериментальных группах Интактные животные ЭД
Диссоциация кардиомиоцитов 12,4±0,3 33,1±0,7*
Фрагментация кардиомиоцитов 9,8±0,2 31,6±0,5*
Глыбчатый распад кардио-миоцитов 7,3±0,4 16,1±0,4
Внутриклеточный отек 8,7±0,3 57,04±0,5*
Субсегментарные контрактуры 12,3±0,3 21,1±0,6*
Сегментарные контрактуры 7,2±0,2 12,6±0,3
Миоцитолизис 5,8±0,1 34,5±0,5*
Стазы эритроцитов 6,2±0,3 41,5±0,7*
Стазы лейкоцитов 5,9±0,1 43,7±0,6*
Примечание: * р < 0,05 по сравнению с интактными животными.
90
80
70 Л 60
I—
о
о 50
I—
о
5 40 30 20 10 0
'-О
о
■ контроль эЭД
КМЦ
коллаген
Рис.1. Объемная плотность кардиомиоцитов и коллагена в миокарде крыс в условиях ЭД
На гистологических препаратах миокарда встречались поля с истонченными и извитыми, деструктивно измененными функциональными мышечными волокнами. На фоне развития сахарного диабета наблюдался выраженный межмышечный отек, содержание аморфного вещества составило 16,7±0,5%, что в 2,4 раза превышало контрольные цифры. Количество коллагеновых волокон возрастало в 2,8 раза по сравнению с интактной группой животных, паренхи-матозно-стромальный индекс (ПСИ) снизился в 3,5 раза (рис.1).
На фоне увеличения содержания волокнистых компонентов межклеточного вещества миокарда обращало на себя внимание распределение типов коллагеновых волокон: экспериментальный диабет сопровождался возрастанием коллагена III типа (рис.2).
Рис.2. Соотношение коллагена I и в контроле (интактные животные) и при ЭД
типов миокарда
С целью определения функциональных (сократительных) возможностей кардиомиоцитов и вклада в них типа сократительных белков было проведено определение соотношения видов белков в составе мио-цитов (табл.4).
Таблица 4
Сократительные белки кардиомиоцитов крыс линии Wistar в условиях ЭД (M±m)
Условия эксперимента Десмин, Миозин,
усл.ед. усл.ед.
Интактные животные, n = 50 12,4±0,3 7,9±0,2
ЭД (14 сут.), n = 85 15,6±0,2* 8,3±0,4
Примечание: *p < 0,05 относительно интактных (контрольных) животных.
В миокарде животных с ЭД наблюдалось повышение содержания белка цитоскелета десмина в среднем на 18%. Увеличение экспрессии сократительного белка миозина на 10% свидетельствует о гипертрофических изменениях значительной части кардиомиоцитов, которые отмечали на 14-е сутки.
Повышение синтеза ряда цитоскелетных белков, очевидно, связано с компенсаторной перестройкой кардиомиоцитов в ответ на повышенную нагрузку. Однако длительное повышение синтеза белков со временем, очевидно, приводит к патологическим изменениям. Повышение уровня экспрессии изоформ десмина, белка промежуточных фи-ламентов, у животных на ранних стадиях патологии приводит к увеличению жесткости и прочности миофиламентов, испытывающих повышенную механическую нагрузку. По мере накопления этого белка в клетке происходит повышение вязкости саркоплазмы, окружающей рабочие актомиозино-вые структуры. В результате этого процесс продвижения миозиновых филаментов относительно актиновых затрудняется, и эффективность сокращения падает.
Обращает на себя внимание состояние сосудистого русла миокарда. Экспериментальный сахарный диабет сопровождается периваскулярным отеком, часть капилляров расширены, полнокровны. Выявляется значительное количество сосудов мик-роциркуляторного русла с явлениями стаза форменных элементов. Клетки эндотелия набухшие, выступают в просвет капилляров. Количество циркулирующих эндотелиоцитов на фоне диабета увеличилось в 2,1 раза. Если у интактных крыс линии Wistar их количество составляло 3,7±0,5х104/л, то при ЭД — 7,9±0,8х104/л.
Заключение
Экспериментально вызванный сахарный диабет приводит к выраженным изменениям кардио-миоцитов, нарушению паренхиматозно-стромаль-ных соотношений с ростом численной плотности коллагеновых волокон, среди которых преобладал в 2,8 раза коллаген III типа. При ЭД отмечено увеличение содержания белков цитоскелета и сократительных белков кардиомиоцитов десмина и миозина. Развитие сахарного диабета происходило на фоне повышения ПОЛ и снижения АОС. Нарушение углеводного обмена сопровождалось значительными изменениями сосудистого русла: перива-скулярным отеком, деструкцией и десквамацией эндотелиоцитов.
Статья подготовлена при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках базовой части государственного задания.
1. Nichols G.A., Hillier T.A., Erbey J.R., Brown J.B. Congestive heart failure in type 2 diabetes: prevalence, incidence, and risk factor // Diabetes. Care. 2001. №24. Р.1614-1619.
2. Александров А.А. Диабетическое сердце: схватка за митохондрии // Consilium Medicum. 2003. Т.05. №9. С.509-513.
3. Аметов А.С., Сокарева Е.В., Гиляревская С.Р., Дикова Т.Е. Диастолическая дисфункция левого желудочка у больных сахарным диабетом 2 типа // Сахарный диабет. 2008. №1. С.40-44.
4. Петрищев Н.Н., Беркевич О.А., Власов Т.Д. Диагностическая ценность определения десквамированных эндоте-лиальных клеток в крови // Клинич. лаб. диагностика. 2001. №1. С.50-52.
References
1. Nichols G.A., Hillier T.A., Erbey J.R., Brown J.B. Congestive heart failure in type 2 diabetes: prevalence, incidence, and risk factor. Diabetes Care, 2001, no. 24, pp. 1614-1619.
2. Aleksandrov A.A. Diabeticheskoe serdtse: skhvatka za mi-tokhondrii [Diabetic heart: fight for mitochondria]. Consilium Medicum, 2003, vol. 5, no. 9, pp. 509-513.
3. Ametov A.S., Sokareva E.V., Giliarevskiia S.R., Dikova T.E. Diastolicheskaia disfunktsiia levogo zheludochka u bol'nykh sakharnym diabetom 2 tipa [Diastolic dysfunction of the left ventricle in patients with type 2 diabetes]. Sakharnyi diabet - Diabetes Mellitus, 2008, no. 1, pp. 40-44.
4. Petrishchev N.N., Berkevich O.A., Vlasov T.D. Diagnos-ticheskaia tsennost' opredeleniia deskvamirovannykh endotelial'nykh kletok v krovi [Diagnostic value of determining desquamated endothelial cells in blood]. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika, 2001, no. 1, pp. 50-52.
