CC BY
20
УДК 611.018.63
МОНИТОРИНГ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПЕРЕСТРОЕК МИОКАРДА, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ПОДДЕРЖАНИИ АДАПТАЦИОННЫХ РЕАКЦИЙ ОРГАНИЗМА В НОРМЕ, ПРЕДПАТОЛОГИИ НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ
Л.Г.Прошина, Л.В.Коваленко*, Л.М.Шевцова, О.С.Быкова, Н.П.Федорова, М.В.Григорьева,
Н.Н.Максимюк, М.В.Гюльмагомедова*
STRUCTURAL AND FUNCTIONAL ALTERATIONS OF MYOCARDIUM FOR SUPPORTING ADAPTIVE RESPONSES OF THE ORGANISM IN THE NORMAL AND PRE-PATHOLOGICAL STATES STUDIED ON EXPERIMENTAL MODELS
L.G.Proshina, L.V.Kovalenko*, L.M.Shevtsova, O.S.Bykova, N.P.Fedorova, M.V.Grigor'eva,
N.N.Maksimiuk, M.V.Giul'magomedova*
Институт медицинского образования НовГУ, Lidiya.Proshina@novsu.ru *Сургутский государственный университет
Исследована динамика структурно-функциональных перестроек миокарда в экспериментальных моделях хронической сердечной недостаточности и эмоциональном стрессе. Выявлено, что экспериментальная хроническая сердечная недостаточность и эмоциональный стресс вызывают функциональную и структурную перестройку тканей миокарда и предрасположенность кардиомиоцитов к апоптозу. Реактивные изменения клеток и тканей миокарда носят адаптивно-компенсаторный характер.
Ключевые слова: адаптация, стресс, кардиомиоциты, экспериментальная сердечная недостаточность, апоптоз
We studied the dynamics of structural and functional alterations of myocardium in experimental models of chronic heart failure and emotional stress. It is revealed that experimental chronic heart failure and emotional stress cause functional and structural reorganization of myocardial tissues and also they cause susceptibility of cardiomyocytes to apoptosis. Reactive changes of myocardial cells and tissues are adaptive-compensatory in nature.
Keywords: adaptation, stress, cardiomyocytes, experimental cardiac failure, apoptosis
Адаптивные перестройки тканей имеют в своей основе метаболическую подстройку, отсюда значимый интерес представляет изучение цитохимических изменений тканей и клеточных структур (определяющих их функциональные потенции) при экстремальных воздействиях. В структуре заболеваемости и смертности сердечно-сосудистые заболевания занимают лидирующие место [1]. Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) является тяжелым осложнением практически всех болезней сердца, отягощающим их течение и прогноз. В настоящее время установлена четкая
взаимосвязь между психоэмоциональным состоянием и патологией миокарда. Изучение морфологической базы адаптивных, реактивных и регенераторных изменений миокарда при патологии различного генеза, в частности при ХСН и стрессе, является важной составляющей современной медицины. ХСН встречается достаточно часто, поэтому поиск новых маркеров прогнозирования ее течения и эффективных средств терапии остается актуальным [2]. Кардиомиоциты являются детерминированными клетками миокарда, их потеря при экстремальных воздействиях, и в частности при
ХСН и стрессе различной этиологии, в значительной мере определяет степень нарушения его сократительной способности [3,4]. В настоящее время имеется значительное количество публикаций о патологии сердца [5,6], однако данные о функциональных возможностях клеток миокарда при различной степени деструктивных изменений в процессе перестройки сердца под влиянием экспериментальных моделей ХСН и стресса противоречивы и недостаточны, неоднозначны материалы об индуктивных воздействиях и вкладе апоптоза в процессы гибели кардиомиоцитов.
Целью настоящего исследования является мониторинг структурно-функциональных перестроек миокарда, используемых в поддержании адаптационных реакций организма в норме, предпатологии на экспериментальных моделях хронической сердечной недостаточности и эмоционального стресса.
Материалы и методы
Экспериментальное исследование выполнено на 135 крысах-самцах Wistar массой 150-250 г, полученных из питомника «Рапполово» РАМН (Ленинградская обл.) Животные содержались в стандартных условиях вивария с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях, а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96) и Приказа МЗ РФ №267 от 19.06.2003г. «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP). Морфологическое исследование проведено с использованием светооптического бинокулярного микроскопа AxioscopeA1 (Carl Zeiss, Германия). Для анализа морфологических, иммуноги-стохимических и цитохимических особенностей кар-диомиоцитов были сформированы три группы животных:
I. Интактные (контроль) — содержались на стандартном рационе вивария.
II. Группа животных с хронической сердечной недостаточностью (ХСН). Модель ХСН воспроизводилась по методу В.И.Инчиной (2000 г.) путем 20-минутного плавания крыс до глубокого утомления, с предварительным введением им за 10-15 минут до плавания 0,1 мл 1% раствора мезатона в течение 14 дней.
III. Группа животных с эмоциональным стрессом. С целью определения индивидуально-типологических особенностей поведения и прогностической оценки устойчивости крыс к эмоциональному стрессу их предварительно подвергали модифицированному тесту «Открытое поле» (ОП). В качестве модели эмоционального стресса использовали иммобилизацию животных с дополнительным апериодическим электрокожным раздражением. Через трое суток после тестирования в открытом поле крыс помещали в индивидуальные плексигласовые боксы, ограничивающие движения. Электрокожное раздражение наносили в области хвоста по стохастической схеме пороговым значением переменного тока, напряжением 4-6 В, частотой 50 Гц, длительностью импульсов 1 мсек. Продолжительность каждой стимуляции составляла 30 сек
— 1 мин. В качестве критериев устойчивости животных к экспериментальному стрессу использовали следующие показатели: 1) показатели поведения в тесте «ОП»; 2) изменение органов стресс-маркеров в условиях экспериментального стресса — гипертрофия надпочечников инволюция тимуса; 3) критерий выживаемости в условиях эмоционального стресса [7].
Материалом исследования служили ткани миокарда. Парафиновые срезы для морфологического исследования окрашивали гематоксилином-эозином и по Ван-Гизону. Морфометрически оценивалось количество (в объемных процентах, об.%) кардиомиоци-тов (КМЦ), сосудов и межклеточного вещества. Вычисляли соотношение КМЦ и межклеточного вещества, включающего соединительную ткань.
Известно, что стрессовая ситуация сопровождается изменением окислительно-восстановительного гомеостаза. Об интенсивности процессов ПОЛ в сердечной ткани судили по содержанию диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) [8]. Исследовали активность ферментов антиокси-дантной системы защиты (АОС): супероксидисмута-зы (СОД) и каталазы (КАТ) в тканях сердца [9].
В настоящее время имеются сведения о значительной роли апоптоза при ишемических повреждениях сердца и инфаркте миокарда [2,3,6], в связи с чем в данном исследовании изучали роль апоптоза в деструктивных изменениях тканей сердца. Определение экспрессии кардиомиоцитами ключевых белков-регуляторов апоптоза (Ьс1-2 и Ьах) выполнялось при помощи двухэтапного авидин-биотинового метода с демаскировкой антигена (путем высокотемпературной обработки ткани) на парафиновых срезах с использованием моноклональных антител и визуализирующей системы фирмы <Юако Суйтайоп» [9]. Результаты иммуногистохимической реакции оценивались в световом микроскопе: для апоптоза — как отношение прореагировавших клеток к их общему количеству в 10 полях зрения. Функциональная активность кардио-миоцитов оценивалась по содержанию ключевых ферментов: лактатдегидрогеназы (ЛДГ); сукцинатдегидро-геназы (СД) и гликогена по Э. Пирсу (1962) в собственной модификации.
Результаты исследования
Сравнительный анализ миокарда контрольных групп животных продемонстрировал следующую картину. При средней массе крыс 250,0 ± 14,3 грамма масса сердца составляла 95,7 ± 38,3 мг. Относительная масса сердца к массе тела (мг на 1 грамм) равнялась 3,8. Объемная плотность кардиомиоцитов равна 85,5 ± 5,2 об.%; межклеточного вещества (включавшего аморфное вещество и коллагеновые волокна) — 14,5% ± 0,1 об.%. Соотношение КМЦ и межклеточного вещества составляет 5,9. Строма миокарда представлена рыхлой соединительной тканью, оплетающей кардиомиоциты и включающей большое количество капилляров, объемная плотность которых составляет 7,4 ± 0,1 об.%.
Экспериментальная сердечная недостаточность привела к деструкции мышечных «волокон». Выявляются контрактурные повреждения кардиомиоцитов, в
ряде клеток имеет место ослабление анизотропии дисков А или исчезновение анизотропных структур в отдельных кардиомиоцитах. Объемная плотность кар-диомиоцитов II группы животных уменьшилась на 27%, а III группы — на 23%, по сравнению с интакт-ными. Объемная плотность капилляров снизилась на 17% и на 15% соответственно. Содержание межклеточного вещества возросло у II группы животных на 32%, у III группы — на 28%, по сравнению с интакт-ными крысами (I группа животных). Соотношение КМЦ и стромальных компонентов миокарда при хронической сердечной недостаточности составило 1,5, а при эмоциональном стрессе 3,5, что практически в 4 и в 2 раз меньше, чем у интактных животных (5,9).
Иммуногистохимическое исследование показало, что экспрессия кардиомиоцитами антиапоптотиче-ского белка Ьс1-2 в группе контроля (группа I) выше, чем в группах с ХСН (группа II) и эмоционального стресса (группа III), достоверных различий эксперес-сии этого белка в экспериментальных группах не выявлено. Частота экспрессии проапоптотического белка Ьах повышается в экспериментальных группах (II, III) в 2,5 и в 2 раза соответственно (рис. 1).
0,5
0,3
0,2
Рис.1. Частота экспрессии кардиомиоцитами антиапоптоти-ческого белка Ь^-2 и проапоптотического белка bax в норме, при экспериментальной сердечной недостаточности (ЭСН) и при эмоциональном стрессе (ЭМС). Примечание: * р < 0,05, по сравнению с контролем
Анализ полученных данных свидетельствует о повышении содержания в кардиомиоцитах белка Ьах, который является маркером запуска программированной гибели клеток при ХСН и стрессе. Частота экспрессии кардиомиоцитами проапоптотического белка Ьах при ХСН выражена больше, в то время как экспрессия антиапоптотического белка Ьс1-2 при ХСН
выражена меньше. Вышеизложенное свидетельствует о значительном вкладе апоптоза в процесс гибели кар-диомиоцитов и, по всей видимости, послужило индукцией для развития соединительнотканных компонентов (в частности, коллагеновых волокон). Исследование содержания гликогена в кардиомиоцитах показало, что его уровень во II экспериментальной группе снизился на 64%, во III группе на 21%; активность ЛДГ — на 42% и на 72%; сДг — на 23% и на 12%, соответственно, по сравнению с кардиомиоцитами интактных животных (рис.2). Иначе говоря, как при ХСН, так и при эмоциональном стрессе, прослеживается снижение метаболической активности исследуемых ферментов, следовательно, и функциональных возможностей кар-диомиоцитов, однако интенсивность падения энзимов в различных ситуациях неоднозначна, что, очевидно, свидетельствует о различном вкладе исследуемых ферментов в патогенез ХСН и стресса.
□ К
□ ХСН
□ стресс
СДГ
ЛДГ
Рис.2. Активность СДГ, ЛДГ и гликогена в кардиомиоцитах крыс линии Wistar в I, II и III экспериментальных группах. Примечание: * p < 0,05, по сравнению с контролем
В норме содержание диеновых коньюгатов (ДК) в тканях миокарда составляет 0,87 ± 0,05 Е/г ткани, МДА — 0,695 ± 0,041 нмоль/500 мг ткани в час. Активность СОД и КАТ составляет 1,71 ± 0,14 ед/мин.мг белка, — 0,233 ± 0,015 ед/мин.мг белка соответственно. В условиях экспериментальной хронической сердечной недостаточности и эмоционального стресса наблюдается значительное повышение содержание продуктов ПОЛ на 215% и 126% соответственно. Активность ферментов АОС при хронической сердечной недостаточности снижается: СОД — на 87%, КАТ — на 88%. При эмоциональном стрессе активность СОД снизилась на 76%, КАТ — на 69% (см. табл.).
0,6
0,4
□ bcl-2
bax
0,1
0
Содержание продуктов ПОЛ и ферментов АОС в тканях сердца у крыс линии Wistar в норме при экспериментальной хронической недостаточности и эмоциональном стрессе
Серия эксперимента ДК, Е/г ткани МДА, нмоль/500 мг ткани в час СОД, ед/мин.мг белка КАТ, ед/мин.мг белка
Контроль I группа 0,87 ± 0,05 0,695 ± 0,041 1,71 ± 0,14 0,233 ± 0,015
Хроническая сердечная недостаточность II группа 1,67 ± 0,05* 0,859 ± 0,050* 0,65 ± 0,16* 0,326 ± 0,011
Эмоциональный стресс III группа 1,87 ± 0,08* 1,302 ± 0,043* 0,41 ± 0,07* 0,073 ± 0,006*
Примечание: * p < 0,05, по сравнению с контролем.
Анализ содержания ДК, МДА в кардиомиоци-тах свидетельствует о смещении окислительно-восстановительного гомеостаза в сторону проокси-дантов, что может быть интерпретировано как окси-дативный стресс, присутствующий как при ХСН, так и при эмоциональном стрессе. Однако при эмоциональном стрессе отмечается более выраженное падение антиоксидантных ферментов.
Заключение
Таким образом, мониторинг структурно-функциональных перестроек миокарда в экспериментальных ситуациях хронической сердечной недостаточности и эмоционального стресса показал, что они носят неспецифический характер: как при ХСН, так и при стрессе наблюдается уменьшение объемной плотности кардиомиоцитов и повышение объемной плотности соединительнотканного компартмента. Однонаправлена, но с разной степенью выражена метаболическая активность СДГ, ЛДГ и гликогена. На модификацию функциональной активности и структурной организации миокарда, очевидно, оказывает определенное влияние окислительный стресс. Аналитический обзор исследованных экспериментальных моделей позволил отметить более выраженную предрасположенность кардиомиоцитов к запуску программы гибели клеток в условиях повышенной нагрузки при ХСН. Структурно-функциональные преобразования носят адаптивно-компенсаторный характер и вызваны реакцией клеток и тканей на экстремальные воздействия ХСН и стресса.
Статья подготовлена при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках базовой части государственного задания.
1. Казаков В.А., Суходоло И.В., Шипулин В.М., Миллер А.А. Ультраструктурные аспекты постинфарктного ре-моделирования левого желудочка // Сибирский медицинский журнал. 2009. №4. Выпуск 1. С.6-11.
2. Бершова Т.В., Монаенкова С.В., Гасанов А.Г. Патогенетическое значение апоптоза кардиомиоцитов при сердечной недостаточности // Педиатрия. 2009. Т.88. №5. С.147-154.
3. Залесский В.Н., Гавриленко Т.И., Фильченков А.А. Апоптоз при ишемии и реперфузии миокарда // Лжарска справка. 2002. №1. С.21-24.
4. Bing O.H. Hypothesis: apoptosis may be a mechanism for the transition to heart failure with chronic pressure overload // J. Mol. Cell Cordial. 1994. V.26(8). P.943-948.
5. Fukuda N., Granzier H. Role of the giant elastic protein titin in the Frank-Starling mechanism of the heart // Curr. Vasc. Pharmacol. 2004. V.2. P.135-139.
6. Хлапов А.П., Вечерский Ю.Ю., Рязанцева Н.В., и др. Роль апоптоза кадиомиоцитов в механизмах ишемиче-ского ремоделирования миокарда // Бюллетень сибирской медицины. 2008. №3. С.33-38.
7. Щеголева А.Н., Коплик Е.В., Прошина Л.Г. Влияние эмоционального стресса на функциональную морфологию сердечной мышечной ткани // Актуальные проблемы современной медицины. 2006. Т.8. С.176-177.
8. Гаврилов В.Г., Мешкорудная М.И. Спектрофотометриче-ское определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови // Лаб. дело. 1983. №3. С.33-35.
9. Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Максимова Н.А. Практическая иммуногистоцитохимия: Методические рекомендации. СПб.: ВЦЭРМ МСЧ России, 2001. С.36.
References
1. Kazakov V.A., Sukhodolo I.V., Shipulin V.M., Miller A.A. Ul'trastrukturnye aspekty postinfarktnogo remodelirovaniia levogo zheludochka [Ultrastructural aspects of postinfarction left ventricular remodelling]. Sibirskii meditsinskii zhurnal - Siberian Journal of Medicine, 2009, v.24, no. 4, iss. 1, p.6-11.
2. Bershova T.V., Monaenkova S.V., Gasanov A.G. Patoge-neticheskoe znachenie apoptoza kardiomiotsitov pri serdech-noi nedostatochnosti [Pathogenic role of cardiomyocytes apoptosis in cardiac diseases]. Pediatriia. Zhurnal imeni G.N. Speranskogo - Journal «Pediatria» named after G.N. Sper-ansky, 2009, vol. 88, no. 5, pp. 147-154.
3. Zalesskii V.N., Gavrilenko T.I., Fil'chenkov A.A. Apoptoz pri ishemii i reperfuzii miokarda [Apoptosis in ischemia or reperfusion of miyocardium]. Likars'ka sprava - , 2002, no. 1, pp. 21-24.
4. Bing O.H. Hypothesis: apoptosis may be a mechanism for the transition to heart failure with chronic pressure overload. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 1994, vol. 26(8), pp. 943-948.
5. Fukuda N., Granzier H. Role of the giant elastic protein titin in the Frank-Starling mechanism of the heart. Current Vascular Pharmacology, 2004, no. 2, pp. 135-139.
6. Khlapov A.P., Vecherskii Iu.Iu., Riazantseva N.V., Kaliuzhin V.V., Mustafina L.R., Shipulin V.M., Novitskii V.V. Rol' apoptoza kadiomiotsitov v mekhanizmakh ishemicheskogo remodelirovaniia miokarda [The role of cardiomyocytes apoptosis in the mechanisms of ischemic myocardium remodeling]. Biulleten' sibirskoi meditsiny - Bulletin of Siberian Medicine, 2008, no. 3, pp. 33-38.
7. Shchegoleva A.N., Koplik E.V., Proshina L.G. Vliianie emotsional'nogo stressa na funktsional'nuiu morfologiiu ser-dechnoi myshechnoi tkani [The eefect of emotional stress on the functional morphology of cardiac muscle tissue]. Aktu-al'nye problemy sovremennoi meditsiny, 2006, vol. 8, pp. 176-177.
8. Gavrilov V.G., Meshkorudnaia M.I. Spektrofotometricheskoe opredelenie soderzhaniia gidroperekisei lipidov v plazme krovi [Spectrophotometric determination of the content of lipid hydroperoxides in blood plasma]. Laboratornoe delo, 1983, no. 3, pp. 33-35.
9. Ellinidi V.N., Anikeeva N.V., Maksimova N.A. Prakticheskaia immunogistotsitokhimiia: Metodicheskie rekomendatsii [Practical immunohistocytochemistry. Guidelines]. Saint Petersburg, NRCERM, EMERCOM of Russia, 2001, p. 36.
