CC BY
17Russian Academy of Agricultural Sciences; house 114-b, Lomonosov str., Voronezh city, Russia, 394087; e-mail: vnivipat@mail.ru
Erin Denis Aleksandrovich, Ph. D. in Veterinary Medicine, Senior Researcher of the Laboratory of Diseases of the Reproductive Organs and Breast of State Scientific Institution 'All-Russian Veterinary Research Institute of Pathology, Pharmacology and Therapy" of the Russian Academy of Agricultural Sciences; house 114-b, Lomonosov str., Voronezh city, Russia, 394087; e-mail: vnivipat@mail.ru
Manzhurina Olga Alekseevna, Ph. D. in Veterinary Medicine, Head of the Laboratory of Diagnostics of Infectious and Invasive Diseases of State Scientific Institution 'All-Russian Veterinary Research Institute of Pathology, Pharmacology and Therapy" of the Russian Academy of Agricultural Sciences; house 114-b, Lomonosov str., Voronezh city, Russia, 394087; e-mail: vnivipat@mail.ru
Chernyshova Irina Sergeevna, Junior Researcher of the Laboratory of Diagnostics of Infectious and Invasive Diseases of State Scientific Institution 'All-Russian Veterinary Research Institute of Pathology, Pharmacology and Therapy" of the Russian Academy of Agricultural Sciences; house 114-b, Lomonosov str., Voronezh city, Russia, 394087; e-mail: vnivipat@mail.ru
УДК: 636.07
Бондаренко Н. Н., Меренкова Н. В., Пахомов А. В., Огурева Г. И.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ МЯСА С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА ДНК-ДИАГНОСТИКИ
Ключевые слова: определение видовой принадлежности, ВЕТФАКТОР «СВИНИНА-КУРИЦА-ФАКТОР», тестовые системы идентификации, ДНК-диагностика.
Резюме: Целью исследования являлось изучение влияния биологических и физико-химических факторов, возникающих при хранении и термической обработке мяса, на эффективность определенных методов и тестовых систем идентификации. Авторами изучено влияние биологических и физико-химических факторов на точность определение видовой принадлежности, основанной на тест-системе ВЕТФАКТОР «СВИНИНА-КУРИЦА-ФАКТОР». Биологические и химико-физические факторы в значительной степени влияют на точность определения видовой принадлежности мяса, как ориентировочных методов исследования: органолептические показатели жира и мяса, точка плавления и застывания жира исследуемого мяса, йодное число, плотность, коэффициент преломления, наличие (качественная реакция) и концентрация гликогена в мышечной ткани, так и довольно точных методов: реакция преципитации (при наличии гипериммунных сывороток) и особенности анатомического строения костей скелета (при их наличии). В связи с этим было проведено исследование влияния биологических и физико-химических факторов, возникающих при хранении и термической обработке мяса, на точность определения видовой принадлежности мяса с помощью метода ДНК-диагностики. Выявлено, что влияние биологических и физико-химических факторов, возникающих при хранении и термической обработке мяса, не сказывается на эффективности определения видовой принадлежности с помощью тест-системы ВЕТФАКТОР «СВИНИНА-КУРИЦА-ФАКТОР».
Введение
Повышение защиты рынка от опасных и контрафактных продуктов является одной из основных целей проводимой реформы технического регулирования. В связи с этим разработка эффективных методов и систем тестирования для идентификации мяса способствует исключению тор-
говли некачественными и фальсифицированными продуктами, которая создает серьезную угрозу для общественного здравоохранения [1, 2]. Идентификация использует различные методы, основанные на ор-ганолептических показателях, биохимические, гистологические исследования [3] и довольно специфические тестовые си-
стемы, основанные на иммунологическом анализе. Методы диагностики ДНК показали себя очень чувствительными и специфическими методами идентификации мяса, они позволяют анализировать образцы, прошедшие термообработку [4, 5]. Однако актуальными проблемами остаются оптимальные методы и системы испытаний для конкретных видов мяса, а также для различных образцов сырья и продуктов. В то же время задачи согласования критериев и методов оценки безопасности, и качества продукции включают в себя, как внедрение стандартизированных систем идентификации испытаний, международно признанных, так и разработку новых методов и систем испытаний, соответствующих международным стандартам. Очень важно изучить влияние биологических и физико-химических факторов, возникающих при хранении и термообработке мяса на эффективность методов и тестовых систем идентификации.
Материалы и методы исследований
Основу исследований составили материалы, полученные в Краснодарской межрегиональной ветеринарной лаборатории
1. Сравнительный анализ методов идентификации мяса при различных условиях температурной обработки.
Различные физические и химические эффекты могут привести к нарушению структуры молекул белка и молекул нуклеиновой кислоты. Известно, например, что термическая обработка мяса приводит к денатурации белковых молекул и потере их антигенных свойств. Результатом является снижение эффективности методов идентификации видов на основе анализа термолабильных белков. Использование термостабильных белков в реакции
в 2017-2018 гг. Изучены методы и системы испытаний для идентификации мяса на основе диагностики ДНК при помощи набора ВЕТФАКТОР «СВИНИНА-КУРИЦА-ФАКТОР» [6]. Изучено влияние биологических и физико-химических факторов, возникающих при хранении и термической обработке мяса на эффективность определенных методов и тестовых систем идентификации.
Результаты и обсуждение
Исследования проводились в два этапа в двух отдельных помещениях (зонах), согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лаборатории, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-4 групп патогенности».
Процесс исследования является строго однонаправленным. Работу следует начинать в зоне подготовки материала, продолжать в зоне экстракции нуклеиновых кислот, затем в зоне амплификации. Запрещается возвращать образцы в зону, в которой была проведена предыдущая стадия процесса. Полученные результаты анализировались в соответствии с таблицей.
не всегда дает достаточно конкретные результаты идентификации. Влияние некоторых температур на ДНК приводит к диссоциации структуры двухцепочечной нуклеиновой кислоты, однако, если поддерживается одноцепочечная структура, этого достаточно для идентификации на основе ДНК. При дальнейшем разрушении ДНК на отдельные фрагменты, которые могут возникать под действием нуклеаз, чувствительность методов идентификации снижается. Как следствие, методы идентификации, основанные на анализе нуклеиновых кислот, являются более перспек-
Таблица 1. Оценка результатов анализа контрольных образцов тест-системы ВЕТФАКТОР «СВИНИНА-КУРИЦА-ФАКТОР»
Контроли Этап Результат (значение О:)
JOE(HEX)/Yellow СВИНИНА FAM/Green КУРИЦА Cy5/Red ВКО
ВК- Экстракция ДНК Нет значения Нет значения <35
Кск+ ПЦР <31 <31 Нет значения
Квк+ ПЦР Нет значения Нет значения <31
К- ПЦР Нет значения Нет значения Нет значения
Таблица 2. Качественные результаты идентификация мяса птицы с использованием тест-системы ВЕТФАКТОР «СВИНИНА-КУРИЦА-ФАКТОР» на примере образца 11492
№ Name Type
Для куриного мяса
1 11492 Образец 22,02
2 11492 Образец 22,94
3 Вк- Образец
4 Кск Образец
5 Квк Образец 22,98
6 К- Образец
Для свинины
1 11492 Образец
2 11492 Образец
3 Вк- Образец
4 Кск Образец 21,78
5 Квк Образец
6 К- Образец
тивными. Целью нашего исследования было изучение влияния различных физических и химических факторов, возникающих при хранении продуктов, на эффективность методов идентификации мяса на основе диагностики ДНК и иммунодиффу-зии. Оценка эффективности анализируемых методов идентификации проводилась на образцах мясного сырья, подвергнутых таким воздействиям, как замораживание, оттаивание и термообработка.
2. Влияние условий хранения мяса на эффективность методов идентификации видов на основе диагностики ДНК.
При транспортировке, хранении, продаже мяса, чтобы защитить его от порчи, используется замораживание [7]. Известно, что кристаллы льда образуются в процессе замораживания. Это может привести к деформации и разрушению мышечных волокон, нарушению соответствия белковых молекул и нуклеиновых кислот. При размораживании могут наблюдаться потеря белка, уменьшение количества вла-
ги и изменения различных физико-химических параметров. Эти процессы могут также служить денатурирующим фактором для белковых молекул, активностью про-теолитических ферментов и эндонуклеаз, что, в конечном счете, влияет на инактивацию антигенов, которые определяют виды или виды видоспецифического разрушения [8]. В этой связи задачи исследования включали оценку эффекта замораживания/оттаивание по эффективности методов идентификации мяса. Смеси из первой группы замораживали при температуре -20 °С, хранили и затем размораживали на воздухе. Вторая группа, замороженная при температуре - 20 °С, оттаивалась и повторно замораживалась каждый день в течение 14 дней. Образцы мяса из третьей группы хранили в течение 14 дней в закрытых пробирках при комнатной температуре.
Полученные данные свидетельствуют о том, что двухкратная процедура замораживания/оттаивания не влияла на чувствительность идентификации мяса кур. Од-
нако дальнейшие процедуры замораживания/оттаивания привели к снижению чувствительности. Четырнадцатикратная обработка не влияла на чувствительность идентификации мяса кур. Аналогичные результаты были получены при изучении свинины. В мясной смеси (мясо курицы/ свинины) увеличение количества операций замораживания/оттаивания до 14 также не привело к снижению чувствительности. Полученные результаты показывают, что процедура множественного замораживания/оттаивания не снижает чувствительность методов идентификации мяса курицы и свинины на основе ДНК-диагностики. Чувствительность методов идентификации мяса на основе ДНК-диагностики практически не зависела от многократного замораживания и оттаивания измельченных смесей. Таким образом, чувствительность идентификации мяса с использованием тестовых систем ВЕТФАКТОР «СВИНИНА-КУРИЦА-ФАКТОР» составляла 0,01 %. на эффективность методов, основанных на анализе видоспецифи-ческих белков.
Полученные данные показывают, что методы, основанные на ДНК-диагностике, более чем подходят для идентификации мяса с нарушением режимов хранения.
3. Влияние обработки термического мяса на эффективность методов идентификации.
Термическая обработка мяса осуществляется при приготовлении мясных продуктов [9]. Известны несколько типов термической обработки. В производстве консервов основными типами термообработки являются пастеризация и стерилизация [10]. Термическая переработка мяса приводит к изменению свойств структурных компонентов клетки. Наибольшие изменения обычно представляют собой белковые молекулы. Нарушение вторичных и третичных структур белковых молекул начинается уже при их нагревании до 30-50 °С. Коагуляция большинства белков происходит в температурном интервале 70-90 °С. Во время денатурации изменяются водородные связи, разрушаются электростатические взаимодействия. В результате этих изменений белки теряют свои антигенные свойства, и в результате возникают трудности при идентификации термообрабо-танных мясных продуктов иммунологическими методами. Известно, что ДНК является более термостабильной молекулой. Долгосрочная высокотемпературная обработка (выше 100 °С) может привести к
разрушению ДНК - ее деградации, которая заключается в разрушении фосфодиэ-фирных связей между отдельными дезок-сирибонуклеотидами. Потеря ДНК в определенных пределах может привести к изменению способности к амплификации и гибридизации. На следующем этапе исследования было оценено влияние различных режимов термообработки на эффективность методов определения видов, принадлежащих к мясу. С этой целью были приготовлены образцы смесей из куриного фарша и подвергнуты термической обработке от 50 до 120 °С, а также обработаны индивидуальным мясным фаршем при 120 °С под давлением (2 атм.). В качестве контроля использовались сырые мясные смеси. Полученные результаты показали, что термическая обработка образцов мяса оказывает незначительное влияние на чувствительность методов идентификации видов мяса курицы и свинины на основе ДНК-диагностики. Короткая переработка мясного сырья при относительно низких температурах (55-65 °С) практически не влияла на чувствительность иммунологических методов. Порог чувствительности реакции иммунодиффузии при идентификации смесей из фарша, нагретых при + 55 °С в течение одного часа или при + 65 °С в течение 30 минут, соответствовал чувствительности контролей. Увеличение температурного воздействия до трех часов при + 55 °С или 1 час при + 75 °С не приводило к снижению чувствительности.
Использованные методы диагностики ДНК не чувствительны к термообработке. В результате термической обработки мяса в течение двух часов при + 80 °С и в течение часа при + 100 °С чувствительность метода на основе ДНК-диагностики тест системой ВЕТФАКТОР «СВИНИНА-КУРИЦА-ФАКТОР» неизменен и составил 0,01 % от примеси мяса анализируемых видов от общей массы фарша. Более жесткая термообработка не привела к более низкому пороговому значению чувствительности. Автоклавирование не препятствовало идентификации методом на основе ДНК-диагностики. Чувствительность составляла 0,01 %. Автоклавирование также не оказывало существенного влияния на идентификацию путем гибридизации ДНК. Результаты показали, что методы диагностики ДНК более устойчивы к негативным последствиям высоких температур по сравнению с иммунологическими тестами.
Выводы
Таким образом, высокая чувствительность и специфичность методов на основе определение ДНК при помощи тест-набора систем ВЕТФАКТОР «СВИНИНА-КУРИЦА-ФАКТОР», позволяющая идентифицировать до 0,01 % мяса птицы, свинины в сырье и пищевых продуктах, в
том числе термически обработанных. Неправильный режим хранения и физико-химические факторы никак не отражаются на точности метода определения видовой принадлежности с помощью тест-набора систем ВЕТФАКТОР «СВИНИНА-КУРИЦА-ФАКТОР».
Библиографический список:
1. Пронин В. В. Ветеринарно-санитарная экспертиза
с основами технологии и стандартизации продуктов животноводства. Практикум [Текст]: учебное пособие / В. В. Пронин, С. П. Фисенко // - СПб.: Издательство «Лань», 2012. - 240 с.
2. Кабанова Е. М. Основные методы распознавания
жира животных при определении видовой принадлежности мяса / Е. М. Кабанова, Н. Н. Бон-даренко // Труды КубГАХ - Краснодар. - № 1(46). - 2014. - С. 168-171.
3. Черняева М. Н. Анализ видовой принадлежности
мяса и мясопродуктов / М. Н. Черняева // Ветеринария. - № 6. - 2001 - С. 47-50.
4. Оценка безопасности и качества продуктов с ис-
пользованием тест-систем на основе ДНК и иммунодиагностики // Научно-практическая конференция «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» Сборник научных трудов. - М.: МГУ ПБ, 2006. - С. 494-496.
5. Узунян Д. Г. Идентификация мяса птицы на основе
методов ДНК диагностики / Д. Г. Узунян // Про-
блемы ветеринарной санитарии, гигиены и эко-лопии. - Т 118. - 2006. - С. 23-25.
6. Наставление по применению тест-систем для определения видовой принадлежности тканей свинины и курицы методом полимеразной цепной ракции ВЕТФАКТОР «СВИНИНА-КУРИЦА-ФАКТОР». Утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ 2000.
7. Татулов Ю. Качество свинины - одного из основ-
ных видов сырья мясной промышленности / Ю. Татулов // Свиноводство. - № 6. - 1997. - С. 24-26.
8. Узунян Д. Г. Изучение влияния различных спосо-
бов хранения мяса на эффективность методов определения видовой принадлежности / Д. Г. Узу-нян // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. - Т. 118. - 2006. - С. 26-27.
9. Мясо. Технические условия и методы анализа - М.,
1997.
10. Лори Т. А. Наука о мясе / Т. А. Лори // Пищевая промышленность. - Москва. - 1973.
1. Pronin V V Veterinarno-sanitarnaya ekspertiza s osnovami tehnologii i standartizatsii produktov zhivotnovodstva [Veterinary and sanitary examination with the basics of technology and standardization of livestock products] Praktikum [Tekst]: uchebnoe posobie / V V Pronin, S. P Fisenko // - SPb.: Izdatelstvo «Lan», 2012. - 240 s.
2. Kabanova E. M. Osnovnyie metodyi raspoznavaniya
zhira zhivotnyih pri opredelenii vidovoy prinadlezhnosti myasa [The main methods of recognition of animal fat in determining the species of meat] / E. M. Kabanova, N. N. Bondarenko // Trudyi KubGAU. - Krasnodar. - # 1(46). - 2014. - S. 168-171.
3. Chernyaeva M. N. Analiz vidovoy prinadlezhnosti myasa i myasoproduktov [Analysis of the species belonging to meat and meat products] / M. N. Chernyaeva // Veterinariya. - # 6. - 2001 - S. 47-50.
4. Otsenka bezopasnosti i kachestva produktov s ispolzovaniem test-sistem na osnove DNK i immunodiagnostiki [Evaluation of the safety and quality of products using DNA-based test systems and immunodiagnostics] // Nauchno-prakticheskaya konferentsiya «Aktualnyie problemyi infektsionnoy patologii i immunologii zhivotnyih» Sbornik nauchnyih trudov. - M.: MGU PB, 2006. - S. 494-496.
5. Uzunyan D. G. Identifikatsiya myasa ptitsyi na osnove
metodov DNK diagnostiki [Identification of poultry
meat on the basis of DNA diagnosis methods] / D. G. Uzunyan // Problemyi veterinarnoy sanitarii, gigienyi i ekolopii. - T 118. - 2006. - S. 23-25.
6. Nastavlenie po primeneniyu test-sistem dlya opredeleniya vidovoy prinadlezhnosti tkaney svininyi i kuritsyi metodom polimeraznoy tsepnoy raktsii VETFAKTOR «SVININA-KURITSA-FAKTOR» [Manual on the use of test systems for determining the species of pork and chicken fabrics by polymerase chain reaction VETFACTOR «PORK-CHICKER-FACTOR»] Utverzhdenyi Departamentom veterinarii MSH RF 2000.
7. Tatulov Yu. Kachestvo svininyi - odnogo iz osnovnyih
vidov syirya myasnoy promyishlennosti [The quality of pork - one of the main types of raw meat industry] / Yu. Tatulov // Svinovodstvo. - # 6. - 1997. - S. 24-26.
8. Uzunyan D. G. Izuchenie vliyaniya razlichnyih sposobov hraneniya myasa na effektivnost metodov opredeleniya vidovoy prinadlezhnosti [Study of the influence of different ways of storing meat on the effectiveness of methods for determining species identity] / D. G. Uzunyan // Problemyi veterinarnoy sanitarii, gigienyi i ekologii. - T. 118. - 2006. - S. 26-27.
9. Myaso [Meat]. Tehnicheskie usloviya i metodyi analiza
- M., 1997.
10. Lori T. A. Nauka o myase [The Science of Meat] / T. A. Lori // Pischevaya promyishlennost. - Moskva.
- 1973.
Bondarenko N. N., Merenkova N. V., Pahomov A. V., Ogureva G. I. MEAT SPECIES DETERMINATION BY THE METHOD OF DNA DIAGNOSTICS
Key Words: species identification, VETFACTOR "SVININA-KURITZA--FACTOR", test identification systems, DNA diagnostics
Abstract: The influence of biological and physicochemical factors during the storage and heat treatment of meat on the effectiveness of its identification methods, in particular, the test system VETFACTOR «SVININA-KURITZA-FACTOR», was studied. Biological and chemical-physical factors influence the accuracy of determining such indicators as: organoleptic indicators of fat and meat, melting point and solidification of fat, iodine number, density, refractive index, presence (qualitative reaction) and glycogen concentration, precipitation reaction and anatomical structure skeletal bones. Experimentally it was revealed that the influence of biological and physicochemical factors arising during storage and heat treatment of meat does not affect the efficiency of species identification with the use of the test system VETFACTOR «SVININA-KURITZA-FACTOR».
Сведения об авторах:
Бондаренко Нина Николаевна, доктор с.-х наук, профессор кафедры паразитологии, ветсанэкспертизы и зоогигиены ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина»; д. 13. ул. Калинина, г. Краснодар, Россия, 350044; тел.: +7 (918) 448 04 23; e-mail: bondarienko.49@mail.ru
Меренкова Надежда Владимировна, канд. с.-х наук, доцент кафедры паразитологии, ветсанэкспертизы и зоогигиены ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина»; д. 13. ул. Калинина, г. Краснодар, Россия, 350044; тел.: +7 (918) 340 78 89; e-mail: nvmvtc@mail.ru
Пахомов Александр Валерьевич, магистрант второго года обучения факультета ветеринарной медицины, ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина» д. 13. ул. Калинина, г. Краснодар, Россия, 350044; e-mail: Saniapahomov@yandex.ru
Огурева Галина Ивановна, магистрант первого года обучения факультета ветеринарной медицины, ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина» д. 13. ул. Калинина, г. Краснодар, Россия, 350044; e-mail:galinababinskaja@ rambler.ru
Author affiliation:
Bondarenko Nina Nikolaevna, Sc. D. in Agriculture, Professor of the Department of Parasitology, Veterinary Expertise and Zoohygiene of the Federal State Budgetary Educational Institution (FSBEI) of Higher Professional Education (HPE) «Kuban State Agrarian University named after I. T. Trubilin»; house 13, Kalinina str., Krasnodar city, Russia, 350044; phone: +7 (918) 448 04 23; e-mail: bondarienko.49@mail.ru
Merenkova Nadezhda Vladimirovna, Ph. D. in Agriculture, Associate Professor of the Department of Parasitology, Veterinary Expertise and Zoohygiene of the Federal State Budgetary Educational Institution (FSBEI) of Higher Professional Education (HPE) «Kuban State Agrarian University named after I. T. Trubilin»; house 13, Kalinina str., Krasnodar city, Russia, 350044; phone: +7 (918) 340 78 89; e-mail: nvmvtc@mail.ru
Pakhomov Alexander Valer'evich, second-year Undergraduate of the Faculty of Veterinary Medicine of the Federal State Budgetary Educational Institution (FSBEI) of Higher Professional Education (HPE) «Kuban State Agrarian University named after I. T. Trubilin»; house 13, Kalinina str., Krasnodar city, Russia, 350044; e-mail: Saniapahomov@yandex.ru
Ogureva Galina Ivanovna, First-year Undergraduate of the Faculty of Veterinary Medicine of the Federal State Budgetary Educational Institution (FSBEI) of Higher Professional Education (HPE) «Kuban State Agrarian University named after I. T. Trubilin»; house 13, Kalinina str., Krasnodar city, Russia, 350044; e-mail: galinababinskaja@rambler.ru
