CC BY
20
12. Ninfa J. P. Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology / J. P. Ninfa, D. P. Balou, M. Benore // Hoboken, N. J.: John Wiley & Sons. 2010. 341 p.
13. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Paris, 2018. Chapter 2.1.8.
14. Revolutionizing Biotechnology with Artificial Restriction Enzymes. Genetic Engineering and Biotechnology News. 10 February 2017. Retrieved 27 May 2021. (reporting on Programmable DNA-Guided Artificial Restriction Enzymes).
15. Roberts R. J. How Restriction Enzymes Became the Workhorses of Molecular Biology. / R. J. Roberts // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005. V. 102 (17). P. 59055908.
16. Roberts R. J. REBASE-enzymes and Genes for DNA Restriction and Modification / R. J. Roberts, T. Vincze, J. Posfai [et al.] // Nucleic Acids Research. 2007. V. 35 (Database issue): D269-70.
17. Snap Gene. pJet 1.2. // URL: https:// www.snapgene.com/resources/plasmidfiles/?set
=basic_cloning_vectors&plasmid=pJET1.2 (Дата обращения: 14.04.2022).
18. Vomelova I. Methods of RNA Purification. All ways (should) lead to Rome / I. Vomelova, Z. Vanickova, A. Sedo // Folia Biol (Praha). 2009. V. 55(6). P. 243-251.
19. Weber E. A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs / E. Weber, C. Engler, R. Gruetzner [at al.] // PLoS One. 2011 Feb. V. 18;6(2):e16765.
20. Wu P. Recombinant T7 Phage with FMDV AKTIII Strain VP1 Protein is a Potential FMDV Vaccine / P. Wu, X. Yin, Q. Liu // Biotechnol Lett. 2021. V. 43(1). P. 35-41.
Исследование выполнено в рамках научного направления ФГБУ «ВНИИЗЖ» «Ветеринарное благополучие». Исследование выполнено без использования животных и без привлечения людей в качестве испытуемых. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
DOI: 10.24412/2074-5036-2022-3-75-83 УДК 619:578.835.2:615.371.004.12:616-076
Ключевые слова: титр антител против вируса ящура, жидкофазный непрямой вариант ИФА, штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015, генотип A/ASIA/G-VII
Keywords: titer of antibodies against FMD virus, liquid-phase indirect version of ELISA, strain A No.2269/ARRIAH/2015, genotype A/ASIA/G-VII
Доронин М. И., Луговская Н. Н., Михалишин Д. В., Клюкина Н. Д., Оковытая Т. В., Гочмурадов Ы. М.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВИРУСА ЯЩУРА ШТАММА А №2269/ВНИИЗЖ/2015 ГЕНОТИПА A/ASIA/G-VII С ПОМОЩЬЮ ЖИДКОФАЗНОГО БЛОКИРУЮЩЕГО НЕПРЯМОГО ВАРИАНТА ИФА
DETERMINATION OF THE TITER OF ANTIBODIES AGAINST THE FMD VIRUS STRAIN A NO.2269/ARRIAH/2Ü15 GENOTYPE A/ASIA/G-VII USING A LIQUID-PHASE BLOCKING
INDIRECT VARIANT OF ELISA
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец Federal Centrefor Animal Health, Federal Governmental Budgetary Institution. Address: 6ÜÜ9Ü1, Russia, Vladimir, Yur'evets
Доронин М. И., к. б. н., ведущий научный сотрудник, докторант, е-mail: [email protected] Doronin M. I., PhD in Biological Science, Leading Researcher, Doctoral Student, e-mail: [email protected] Луговская Н. Н., к. б. н., ведущий научный сотрудник, е-mail: [email protected] Lugovskaya N. N., PhD in Biological Science, Leading Researcher, e-mail: [email protected] Михалишин Д. В., д. в. н., заведующий лабораторией, е-mail: [email protected] Michalishin D. V., Doctor of Veterinary Science, Head of the Laboratory, e-mail: [email protected] Клюкина Н. Д., к. в. н., старший научный сотрудник, е-mail: [email protected] Klukina N. D., PhD in Veterinary Science, Senior Researcher, e-mail: [email protected] Оковытая Т. В., к. б. н., старший научный сотрудник, е-mail: [email protected] Okovitaya T. V., PhD in Biological Science, Senior Researcher, e-mail: [email protected] Гочмурадов Ы.М., аспирант, e-mail: [email protected] Gochmuradov I. M., Post-Graduate Student, e-mail: [email protected]
Аннотация. Иммунизация животных является эффективным инструментом борьбы с ящуром. В связи с появлением представителя нового генотипа вируса ящура и необходимостью защиты от него требуется разрабатывать вакцины и создавать высокоспецифичные и высокочувствительные диагностические тест-системы. В статье представлена новая разработанная нами тест-система на основе жидко-фазного блокирующего непрямого варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации. Предлагаемая тест-система является специфичной по отношению к антителам против антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 на 100 %, чувствительной на 99,78 %, стабильной благодаря применению лиофиль-но высушенных специфических компонентов. В данной тест-системе применяются сенсибилизирующие антитела с рабочим разведением 1:12000, детекторные антитела с разведением 1:3000, антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII с рабочим разведением 1:3000. Тест-система предлагает усовершенствованную формулу для расчета процента ингибиции, по его данным находят максимальное разведение сыворотки, при котором она остается положительной, что и принимается за титр антител против указанного антигена. Разработанная тест-система является первой в мире, позволяющей достоверно количество исследовать сыворотки крови животных на предмет определения титра антител против антигена вируса ящура вакцинного штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 нового генотипа A/ASIA/G-VII. Следует отметить, что это отечественная разработка, которая имеет определенное значение в эпоху импортозамещения в России.
Summary. Animal immunization is an effective tool to combat foot-and-mouth disease. Due to the appearance of a representative of a new genotype of the foot-and-mouth disease virus and the need to protect against it, it is required to develop vaccines and create highly specific and highly sensitive diagnostic test systems. The article presents a new test system developed by us based on a liquid-phase blocking indirect variant of ELISA for determining the titer of antibodies against FMD virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII in animal blood sera after immunization. The proposed test system is specific to antibodies against the antigen of the FMD virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 is 100% sensitive by 99.78%, stable due to the use of freeze-dried specific components. In this test system, sensitizing antibodies with a working dilution of 1:12000, detector antibodies with a dilution of 1:3000, the antigen of the FMD virus strain are used A No.2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII with a working dilution of1:3000. The test system offers an improved formula for calculating the percentage of inhibition, according to which the maximum dilution of serum is found, at which it remains positive, which is taken as the titer of antibodies against the specified antigen. The developed test system is the first in the world to reliably examine the amount of animal blood serum to determine the titer of antibodies against the foot-and-mouth disease virus antigen of vaccine strain A No.2269/ARRIAH/2015 of the new genotype A/ASIA/G-VII. It should be noted that this is a domestic development that has a certain significance in the era of import substitution in Russia.
Введение
Ящур - высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, которое характеризуется высокой заболеваемостью, что влечет за собой ограничения на международную торговлю скотом и его продукцией [2, 19].
Возбудителем является РНК-содержа-щий безоболочечный вирус рода Арк-семейства Picornaviridae. Выделяют 7 различных серотипов вируса ящура: О, А, Азия-1, С и БАТ-1, БАТ-2, БАТ-3. Геном кодирует 4 структурных белка: УР1, УР2, УР3, УР4 [9, 10].
В РНК-содержащих вирусах вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации вируса, а возникающие линии и сублинии обусловлены мутациями и рекомбинацией. Рекомбинация - важный процесс, определяющий биологию и эволюцию вирусов. Она представляет собой обмен генетическим материалом между двумя несегментированными РНК-геномами вирусавнутри одного серотипа[ 12].
76
Внутритипическая рекомбинация происходит часто. Мутации в результате рекомбинации приводят к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые могут избежать иммунного давления и привести к изменениям тропизма клеток и диапазона хозяев [9]. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус будет приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [12, 19].
Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием вирусных факторов и клеток-хозяев. Изменения в генах, кодирующих капсидные белки, путем мутации
могут привести к антигенным изменениям и появлению новых генетических линий [14].
Белок УР1 является наиболее вариабельным, поскольку на него приходится около 90 % мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [9, 10]. Участок поверхностного белка УР1 в регионе 130-160 а. о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому [9, 12, 19].
В 2015 г. на территории Саудовской Аравии, Ирана, Турции широкое распространение получил вирус ящура, который принадлежит к генотипу А/АБ1АЮ-УП. В ФГБУ «ВНИИЗЖ» данный изолят был адаптирован к различным чувствительным клеточным линиям, в том числе, к монослойной и суспензионной перевиваемой клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК^/БШР^МАН и получен штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 [5].
Иммунизация является эффективным инструментом борьбы с болезнью. Для изготовления вакцин используются производственные штаммы вируса ящура [3, 4, 11]. В связи с появлением представителя нового генотипа возбудителя и необходимостью защиты животных от него в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработали вакцину, в состав которой входит антиген вируса ящура данного штамма [6]. Как следствие, возникла необходимость создания высокоспецифичных и высокочувствительных диагностических тест-систем, которые позволили бы выявлять антитела против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа ААБ1А^-УП.
Защита от ящура после вакцинации определяется уровнем специфических антител в сыворотке крови животных. Имеются сведения, что ^М, специфичные к вирусу ящура, могут быть обнаружены на 2-4 сутки после вакцинации [13, 20]. Уровень гуморального иммунитета вакцинированного поголовья определяется путем выявления антител,
специфичных к капсиду или структурным белкам вируса ящура. В соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE) [18] для определения иммунного статуса животных применяют реакцию нейтрализации и иммуноферментный анализ (ИФА). Реакция нейтрализации считается чувствительным, специфичным и надежным методом, однако проведение исследования имеет ряд ограничений, в частности, большая продолжительность времени постановки реакции (не менее 3 суток), высокая стоимость процедуры, связанная с применением чувствительной клеточной линии, наличие С02-инкубатора, а также предполагает использование неинактивированного вируса ящура, который является биологическим агентом II группы патогенно сти. При этом ИФА обладают многими преимуществами, включая экспрессность, высокую специфичность и чувствительность, пригодность для крупномасштабного скрининга полевых образцов и отсутствие требований к специальным лабораторным условиям, например, наличию культуры клеток или среды CO2 [7, 15]. Исходя из этого, ИФА целесообразно применять для определения титра антител у вакцинированных животных.
В настоящее время тест-системы жидко-фазного блокирующего непрямого варианта ИФА применяются для определения титра антител против вируса ящура, инфекционного ларинготрахеита кур, болезни Ньюкасла и др. [7, 8, 15, 16, 17]. Сведения о разработке количественной ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/ G-VII в литературе отсутствуют.
Цель исследований заключалась в разработке и тестировании метода определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII с помощью жидкофазного блокирующего непрямого варианта ИФА.
Материалы и методы
Генетическая идентификация штамма
Генетическую идентификацию вирусного материала проводили с помощью секвениро-вания Ш-гена вируса ящура, соответствующего структурному белку VP1.
77
Получение антигена вируса ящура
В работе использовали производственный штамм А № 2269/ВНИИЗЖ/2015 культураль-ного вируса ящура, который депонирован в государственной коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИ-ИЗЖ»). Для получения антигена проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21 с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 6,5 ^ ТЦД50/см3. Полученную вирусную суспензию инактивиро-вали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли благодаря полигексаметиленгуа-нидину. Инактивированную культуральную жидкость осветляли центрифугированием при температуре 4±0,5 °С. В надосадочную жидкость добавляли ПЭГ-6000 и №С1, интенсивно перемешивали и инкубировали при температуре 4±2 оС в течение 18-24 часов. Вирусную суспензию осаждали, осадок растворяли в 1/15 М ФБР, концентрируя в 200 раз. К полученному преципитату добавляли трихлорметан, интенсивно перемешивали и фракционировали. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015.
Антиген вируса ящура обрабатывали детергентом. Для выделения 146Б компонента готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50 %. Наслаивали суспензию антигена и проводили осаждение при скорости 25 000 об./мин и температуре 4±0,5 °С в течение 4 часов. С помощью перистальтического насоса отбирали фракции по 1 мл и анализировали их. Опалесцирую-щие зоны, содержащие 146Б компонент без посторонних примесей, переосаждали с помощью ультрацентрифугирования, полученный осадок ресуспендировали в 1/15 М ФБР.
Анализ фракций антигена вируса ящура
Полученные после фракционирования пробы исследовали с помощью спектрофотометра для определения содержания белка по формуле Калькара: Сбелка = 1,45 ■ А280 -0,74 ■ А260 (мг/мл) [1]. Фракции исследовали на степень чистоты с помощью гель-электрофореза в 12 %-ном полиакриламидном геле (ПААГ) по стандартной методике [1].
78
Получение сенсибилизирующих и детекторных антител для ИФА
Для получения сенсибилизирующих антител против антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 использовали клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг. Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный антиген, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта МоПашёе 1БА-61 VG (Беррю, Р. Франция). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 21 и 42 дни в объеме 0,5 см3. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови, содержащую сенсибилизирующие антитела.
Для гипериммунизации морских свинок с целью получения детекторных антител использовали эмульсию очищенного препарата концентрированного инактивирован-ного вируса ящура штамма А №2269/ВНИ-ИЗЖ/2015, полученного, как описано выше. Приготовление вакцины и схема иммунизации такая же.
Определение диагностических показателей тест-системы
Проводили определение основных показателей тест-систем: чувствительность (Бе), специфичность (Бр), к-критерий (индекс Каппа Коэна), прогностичность положительного результата (РРУ), прогностичность отрицательного результата (МРУ), общую точность (Ас) в соответствии со стандартными методиками.
Результаты исследований и обсуждение
На первом этапе работы проводили мо-лекулярно-биологические исследования по подтверждению принадлежности штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 к генотипу А/ АБНАЮ-УП. На основе анализа и сравнения нуклеотидных последовательностей Ш-гена разных штаммов вируса ящура типа А определили, что данный штамм относится к указанному генотипу (рисунок 1).
На следующем этапе работы проводили получение антигена вируса ящура штамма А № 2269/ВНИИЗЖ/2015. В результа-
Рис. 1. Филогенетическая принадлежность штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура генотипа А/А81АЮ-УП.
те культивирования в клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH получили 40 л куль-турального вируса ящура, который инакти-вировали, очищали и концентрировали в 200 раз, получив 200 мл. Полученный материал исследовали спектрометрическим методом и с помощью гель-электрофореза. Результаты отражены на рисунках 2 и 3. Полученный антиген подвергли лиофильному высушиванию для сохранения активности в течение не менее 3 лет.
На следующем этапе получили сенсибилизирующие и детекторные антитела против вируса ящура штамма А №2269/ ВНИИЗЖ/2015. Индивидуальные пробы сывороток проверяли на активность и специфичность в жидкофазном блокирующем непрямом варианте варианте ИФА. Был проведен подбор оптимальных рабочих разведений указанных компонентов для получения достоверных результатов в ИФА. Полученные данные анализа представлены в таблице 1. Выявлено, что рабочее разведение антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИ-ИЗЖ/2015, сенсибилизирующих и детекторных антител составляло 1:3000, 1:12000, 1:3000, соответственно. Полученные компоненты лиофильно высушивали для дальнейшего использования в тест-системе.
Разработанная нами тест-система определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 с применением жидкофазного блокирующего непрямого варианта ИФА основана на спе-
Рис. 2. Седиментационный профиль антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 в разведении 1:10 при длине волны 260 нм.
цифическом блокировании антигена антителами, содержащимися в исследуемой пробе сыворотки в жидкой фазе. Смесь «исследуемая сыворотка/антиген» переносили в лунки планшета, предварительно иммобилизованного сенсибилизирующими антителами. Наличие антител к вирусу ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в исследуемой пробе выражалась в образовании иммунного комплекса и уменьшении количества свободного антигена, который связывался иммобилизованными на планшете сенсибилизирующими антителами. Фиксированный в лунках антиген взаимодействовал с детекторными антителами, которые выявлялись в реакции с имму-нопероксидазным конъюгатом против IgG морской свинки и последующим окрашиванием с помощью хромогенного субстрата ABTS. Интенсивность окрашивания обратно
1234SG799 10 11
Рис. 3. Седиментационный профиль антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 в разведении 1:10 при длине волны 260 нм.
79
пропорциональна концентрации специфических антител в исследуемой пробе и учитывается с помощью спектрофотометра. Принципиальная схема жидкофазного блокирующего непрямого варианта ИФА представлена на рисунке 4.
Разработанные этапы проведения жидкофазного блокирующего непрямого варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/ G-VII представлены ниже.
1) Сенсибилизация планшетов. Раствор сенсибилизирующих антител готовили в оптимальном разведении в карбонатно-бикар-бонатном буферном растворе. Во все лунки иммунологического 96-луночного планшета вносили по 100 мкл раствора сенсибилизирующих антител, инкубировали в течение 18-20 часов при температуре (2-8) °С. Данный этап проводили заранее до осуществления непосредственных этапов постановки реакции.
2) Реакция в жидкой фазе. Осуществляли двойное промывание лунок планшета с помощью буферного раствора TBST. Параллельно с сенсибилизацией планшета проводили реакцию антигена с испытуемыми и контрольными пробами сыворотки крови. Готовили следующие разведения сывороток крови животных: 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024. Для этого во все лунки полимерного планшета за исключением лунок H1-6, которые оставляют для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносят по 0,047см3 буферного раствора и 0,003 см3 пробы. В лунки H1-6 вносят по 0,05 см3 буферного раствора. В качестве контроля 1 использовали положительную сыворотку крови КРС против инактивированного вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (процент ингибиции >75%), контроля 2 -положительную сыворотку крови КРС к инактивированному вирусу ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (процент ингибиции более 50 %, но менее 75 %), контроля 3 - нормальную сыворотку КРС. Затем во все лунки планшета добавляют по 0,05 см3 рабочего разведения антигена.
Рис. 4. Принципиальная схема жидкофазного блокирующего непрямого варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ ВНИИЗЖ/2015.
После перемешивания содержимого лунок планшета его инкубировали в течение 18 часов при температуре (2-8) °С.
3 ) Улавливание антигена. В промытые лунки сенсибилизированного планшета вносили по 0,05 см3 смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет инкубировали в течение 1 часа при температуре (37±2) °С. Лунки планшета промывали 4 раза.
4) Внесение детекторных антител. Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК, куда добавляли по 0,05 см3 буферного раствора, вносили по 0,05 см3 рабочего разведения детекторных антител. Планшет инкубировали в течение 1 часа при температуре (37±2) °С. Проводили промывание лунок планшета 4 раза.
5) Внесение конъюгата. Во все лунки планшета вносили по 0,05 см3 рабочего разведения пер оксид азного конъюгата антител против антител морской свинки. Планшет инкубировали в течение 1 часа при температуре (37±2) °С. Планшет промывали 4 раза.
6) Проявление цветной реакции. Во все лунки планшета вносили по 0,05 см3 хромо-генного субстрата ABTS, выдерживали 1520 минут при температуре (18-25) °С.
7) Остановка реакции. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку планшета
80
Таблица 1
Рабочее разведение антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, сенсибилизирующих и детекторных антител для ИФА
Реагент в ИФА Рабочее развецение
S кролика (СА) 1:3000
АГ А2269/ВНИИЗЖ/2015 1:2000 1:3000 1:4000 1:2000 1:3000 1:4000
S мор. свинки (ДА) 1:3000 1:12000
№ п/п Образцы сыворотки крови Результаты исследований (качественный анализ) в ИФА с разными концентрациями реагентов (СА-АГ-ДА)
300020003000 300030003000 300040003000 300080003000 3000200012000 3000300012000 3000400012000 3000800012000
1 Sn КРС - - - - - - - -
2 Sn свиная - - - - - - - -
3 S полиштаммная (типы А, О, Азия-1) положительная, №1 - - - - + + + -
4 S полиштаммная (типы А, О, Азия-1) положительная, №2 - - - - + + + -
5 S полиштаммная (типы А, О, Азия-1) положительная, №1 - - - - - + - -
6 S полиштаммная (типы А, О, Азия-1) положительная, №2 - - - - - + - -
7 S свиная к ВЯ А2269, 14 ДПВ - - - - + + - -
8 S свиная к ВЯ А2269, 21 ДПВ - - - - + + + +
9 S свиная к ВЯ А2269, 28 ДПВ - - - - + + + +
10 S КРС к ВЯ А/Кути/13, 28 ДПВ - - - - - - - -
11 S КРС к ВЯ О/Сауцовская Аравия/08, 28 ДПВ - - - - - - - -
12 S свиная к ВЯ О/Забайкальский/16, 21 ДПВ - - - - - - - -
13 S КРС к ВЯ О/Приморский/14, 28 ДПВ - - - - - - - -
14 S КРС к ВЯ Азия-1/Шамир 3/89, 28 ДПВ - - - - - - - -
15 S КРС к ВЯ SAT1, 28 ДПВ - - - - - - - -
16 S свиная к ВЯ SAT2, 28 ДПВ - - - - - - - -
17 S КРС к ВЯ SAT3, 28 ДПВ - - - - - - - -
Примечание: ВЯ - вирус ящура, ДПВ - дни после вакцинации, СА - сенсибилизирующие антитела, ДА - детекторные антитела, АГ - антиген, Б - сыворотка крови, «-» - отрицательно, «+» - положительно.
0,05 см3 1 %-ного раствора додецилсульфата натрия.
8) Учет результатов ИФА. Результаты анализа учитывали инструментальным способом. Сразу после остановки реакции измеряли оптическую плотность (ОП) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 405 нм, используя спектрофотометр-ридер для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения ОП контрольных и исследуемых проб переводили в значение процента ингибиции (Р1) по формуле:
где ОП пробы - среднее значение оптической плотности смеси исследуемой или контрольной пробы с антигеном вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015; ОП КА -среднее значение оптической плотности контроля антигена; ОП КК - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата.
Результаты реакции считали достоверными, если они удовлетворяли следующим критериям:
- разница между значениями ОП КА и ОП КК не менее 0,4 оптических единиц;
- контроль 1 имеет значение Р1>75 %;
- контроль 2 имеет значение Р1 в пределах 50-75 %;
81
Таблица 2
Пределы диагностических возможностей тест-системы по определению титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 с помощью жидкофазного блокирующего
непрямого варианта ИФА
Диагностические показатели Результаты статистической обработки данных
значение 95 %-ный доверительный интервал
DSe 99,78 % 98,77-99,99 %
DSp 100 % 98,08-100 %
k-критерий 0,996
PPV 100 % -
NPV 99,48 % 96,41-99,93 %
DAc 99,84 % 99,13-100,00 %
Примечание: * - не требуется определять.
- контроль 3 имеет значение Р1<50 %.
Пробы, демонстрирующие значение Р1>50 %, считали положительными, а животные, от которых получены данные пробы сыворотки крови, иммунными к антигену вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа А/АБ1АЮ^П. Значение Р1<50 % является отрицательным, что свидетельствует об отсутствии специфических антител к антигену вируса ящура генотипа ААБ1АЮ-VII в сыворотке крови обследуемых животных. Исходя из полученных данных брали последнее разведение сыворотки, для которого процент ингибиции составляет >50 %. Это разведение считают титром антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИ-ИЗЖ/2015.
На следующем этапе исследования определяли стандартные диагностические показатели разработанной тест-системы. Для оценки чувствительности предложенной тест-системы анализировали 450 сывороток крови животных, которые являлись заведомо положительными по данным реакции нейтрализации в чувствительной клеточной линии почки свиньи Ю^Б-2. Титр антител для данных сывороток крови находился в диапазоне 1:32-1:1024. Постановку ИФА проводили, как отражено выше. Разработанной тест-системой определили, что из 450 истинно положительных образцов сывороток 449 определены в качестве положительных, а 1 - в качестве отрицательной (титр 1:16). Для исследования специфичности метода тестировали 190 отрицательных сывороток
82
крови. В результате исследования с помощью ИФА определили, что из 190 истинно отрицательных проб 190 определены в качестве отрицательных. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа, выявили, что диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,78 % (в 95 %-ном доверительном интервале: 98,77-99,99 %), диагностическая специфичность (DSp) - 100 % (в 95 %-ном доверительном интервале: 98,08-100,0 %), k-критерий - 0,996; прогностичность положительного результата (PPV) - 100 %, прогностичность отрицательного результата (NPV) - 99,48 % (в 95 %-ном доверительном интервале: 96,41-99,93 %), общая точность (DAc) - 99,84 % (в 95 %-ном доверительном интервале: 99,13-100,00 %) (таблица 2).
Заключение
Разработана новая тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/ G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации.
Определено, что предлагаемая тест-система является специфичной по отношению к антителам против антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 на 100 %, чувствительной на 99,78 %, стабильной благодаря применению лиофильно высушенных специфических компонентов.
В данной тест-системе применяются сенсибилизирующие антитела с рабочим разведением 1:12000, детекторные антитела с разведением 1:3000, антиген вируса ящура штамма А №°2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа АМША^-УП с рабочим разведением 1:3000.
Тест-система предлагает усовершенствованную формулу для расчета процента инги-биции. По данным процента ингибиции находят максимальное разведение сыворотки, при котором она остается положительной, что и принимается за титр антител против указанного антигена.
Разработанная тест-система является первой в мире, позволяющей достоверно количество исследовать сыворотку крови животных на предмет определения титра антител против антигена вируса ящура вакцинного штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 нового генотипа А/АБ1АЮ-УП. Следует отметить, что это отечественная разработка, которая имеет определенное значение в эпоху импортоза-мещения в России.
Список литературы
1. Биохимия белков: практикум для студентов биол. фак. спец. 31.01.01-2 «Биология» / И. В. Семак, Т. Н. Зырянова, О.И. Губич. Минск: БГУ, 2007. 49 с.
2. Груздев К. Н. Программа совместных действий по профилактике и борьбе с ящуром животных в странах СНГ / К. Н. Груздев, В. М. Захаров, А. М. Рахманов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. Владимир, 2005. Т. 3. С. 3-13.
3. Гуленкин В. М. Экономическая эффективность проведения профилактической вакцинации животных против ящура на территории Российской Федерации / В. М. Гуленкин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. Владимир, 2012. Т. 10. С. 31-41.
4. Динамика развития противоящурного гуморального иммунитета у крупного рогатого скота, иммунизированного трехвалентной сорбированной вакциной типов А, О, Азия-1 / Д. В. Михалишин, Т. Н. Лезова, Н. Н. Ходакова [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. Владимир, 2007. Т. 5. С. 75-82.
5. Российский патент RU2640261, 27.12.2017 по МПК С12Ш/00 А61К39/135. Штамм А №2269/ ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура АрЫ;ае ер170011еае типа А для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.
6. Российский патент RU2665850, 25.12.2017 61K 39/135 (2006.01); C12N 7/00 (2006.01) Вакцина инак-тивированная эмульсионная против ящура типа А.
7. Basagoudanavar S. H. Development of a Liquidphase Blocking ELISA Based on Foot-and-mouth Disease Virus Empty Capsid Antigen For Seromonitoring Vaccinated Animals / S. H. Basagoudanavar, M. Hosamani, R. P. T. Selvan [et al.] // Arch Virol. 2013 May. V. 158(5). P. 993-1001.
8. Cao Y. Synthesis of Empty Capsid-like Particles of Asia I Foot-and-mouth Disease Virus in Insect Cells and their Immunogenicity in Guinea Pigs / Y. Cao, Z. Lu, J. Sun [et al.] // Vet Microbiol. 2009. V. 137(1-2). P. 10-17.
9. Curry S. Dissecting the Roles of VP0 Cleavage and RNA Packaging in Picornavirus Capsid Stabilization: the Structure of Empty Capsids of Foot-and-mouth Disease Virus / S. Curry, E. Fry, W. Blakemore [et al.] // J Virol. 1997. V. 71(12). P. 9743-9752.
10. Curry S. R. Foot-and-mouth Disease Virus 3C Protease: Recent Structural and Functional Insights into an Antiviral Target / S. R. Curry, P. A. Zunszain, R. J. Leatherbarrow // Int J Biochem Cell Biol. 2007. V. 39(1). P. 1-6.
11. Diagnostic Assays Developed for the Control of Foot-and-mouth Disease in India / G. K. Sharma, S. Mahajan, R. Matura [et al.] // World J Virology. 2015. V. 4(3). P. 295-302.
12. Fry E. E. The Structure of Foot-and-mouth Disease Virus / E. E. Fry, D. I. Stuart, D. J. Rowlands // Curr Top Microbiol Immunol. 2005. V. 288. P. 71-101.
13. Global Strategy for Control of Foot-and-mouth Disease. Bangkok, Thailand. 2012. P. 27-29.
14. Grubman M. J. Evading the Host Immune Response: How Foot-and-mouth Disease Virus Has Become an Effective Pathogen / M. J. Grubman, M. P. Moraes, F. Diaz-San Segundo // FEMS Immunol Med Microbiol. 2008. V. 53(1). P. 8-17.
15. Hamblin C. A New Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) for the Detection of Antibodies Against Foot-and-mouth Disease Virus. I. Development and Method of ELISA / C. Hamblin, I. T. Barnett, R. S. Hedger // J Immunol Methods. 1986. V. 93(1). P. 115-121.
16. Ma L. N. An Overview on ELISA Techniques for FMD / L. N. Ma, J. Zhang, H. T. Chen // Virol J. 2011. Sep 4. V. 8. P. 419.
17. Oem J. K. Characterization of Recombinant Foot-and-mouth Disease Virus Pentamer-like Structures Expressed by Baculovirus and Their Use as Diagnostic Antigens in a Blocking ELISA / J. K. Oem, J. H. Park, K. N. Lee // Vaccine. 2007. V. 25(20). P. 4112-4121.
18. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Paris, 2018. Chapter 2.1.8.
19. Palmenberg A. C. Proteolytic Processing of Picornaviral Polyprotein / A. C. Palmenberg // Annu Rev Microbiol. 1990. V. 44. P. 603-623.
20. Wong C. L. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease / C. L. Wong, C. Y. Yong, H. K. Ong // Front Vet Sci. 2020, Aug. V. 21. P. 477.
83
