CC BY
43
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
г
Для корреспонденции
Малинкин Алексей Дмитриевич - младший научный
сотрудник лаборатории химии пищевых продуктов
ФГБУ «НИИ питания» РАМН
Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский пр., д. 2/14
Телефон: (495) 698-57-36
Е-таИ: sindar7@mail.ru
#
А.Д. Малинкин1, В.В. Бессонов1, А.А. Шумакова1, Е.А. Арианова1, В.И. Прокофьева2
Определение состава основных катионов в соках и нектарах методом капиллярного зонального электрофореза
Determination of major metal cations in juices and nectars by capillary zone electrophoresis
A.D. Malinkin1, V.V. Bessonov1, A.A. Shumakova1, E.A. Arianova1, V.I. Prokofyeva2
1 ФГБУ «НИИ питания» РАМН, Москва
2 ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России
1 Institute of Nutrition of Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University
Предложена методика определения содержания катионов калия, натрия, кальция и магния методом капиллярного зонального электрофореза (с использованием катионов лития в качестве внутреннего стандарта) в соках и нектарах. Подобраны оптимальные условия электро-форетического разделения: pH рабочего буферного раствора (pH 3,6), концентрация имидазола (контрастное вещество, 15-20 ммоль/дм3), концентрация 18-краун-6 эфира (2 ммоль/дм3). Методика апробирована на 15 образцах соков и нектаров. Проведено сравнение полученных результатов определения катионов калия и магния с результатами определения методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой. Уравнение линейной регрессии и коэффициент достоверности аппроксимации при определении катионов магния были определены как: y=0,999x+3,29; R=0,952; при определении катионов калия: y=0,959x+51,94; R=0,997; что свидетельствует о хорошей корреляции между данными, полученными этими методами.
Ключевые слова: капиллярный зональный электрофорез, неорганические катионы, калий, магний, соковая продукция
The method of determination of potassium, sodium, calcium and magnesium cations by capillary zone electrophoresis (using lithium cations as the internal standard) in the juices and nectars was advised. Optimal conditions for electrophoretic separation: pH value of the working buffer (pH 3,6), the concentration of imidazole (contrast agent 15-20 mmol/dm3), the concentration of 18-crown-6 ether (2 mmol/dm3). The method was tested on 15 samples of juices and nectars. The results of determination of potassium and magnesium cations were compared with results obtained by mass spectrometry with
74
inductively coupled plasma. The equation of the linear regression and R-squared value for determinations of magnesium cations were defined as: y=0,999x+3,29; R=0,952; for determination of potassium cations: y=0,959x+51,94; R=0,997; indicating good the correlation between the data obtained by these methods. Key words: capillary zone electrophoresis, inorganic cations, potassium, magnesium, fruit juices
Актуальной проблемой гигиены питания является обеспечение населения адекватным количеством макроэлементов, в частности калия, кальция и магния. Одним из источников данных минеральных веществ являются фрукты и продукты их переработки. Кроме того, содержание катионов калия и натрия регламентируется СанПиН 2.3.2.1078-01 как показатель подлинности соков. Для оценки качества соков, а также определения вклада соков в обеспечение населения этими минеральными элементами необходимо использовать современные аналитические методы. Традиционно для определения минерального состава фруктовых соков применяется метод атомно-адсорбционной спектрометрии (например, ГОСТ Р 51429-99), который имеет ряд недостатков: сравнительная сложность и дороговизна аппаратурного оформления, трудоемкость. Альтернативным методом определения минерального состава может выступать метод капиллярного электрофореза, к достоинствам которого можно отнести относительную простоту аппаратурного оформления, невысокую стоимость, возможность совместного определения нескольких катионов, сравнительную экологичность. Однако у данного метода присутствуют и недостатки: необходимость точного воспроизведения состава буферного раствора, возможные значительные отклонения в объеме при вводе пробы [1, 2, 4, 7].
Целью данной работы явилась разработка метода качественного и количественного определения катионов калия и натрия во фруктовых соках с помощью капиллярного зонального электрофореза (КЗЭ).
Центрифугирование проводили на центрифуге «Eppendorf 5418» (Eppendorf, Германия).
Использовали реактивы: натрия хлорид (х.ч.), калия хлорид (х.ч.), кальция хлорид (ч.), магний хлористый 6-водный (х.ч.), лития ацетат 2-вод-ный (х.ч.), вода деионизированная (сопротивление 18 Мом), имидазол (содержание основного вещества >99,5%, импортный), 18-краун-6 эфир (содержание основного вещества >99%, импортный), кислота муравьиная (х.ч.).
Информация об объектах исследования представлена в табл. 1.
Таблица 1. Объекты исследования
№ Наименование Тип напитка
1 «Сок из яблок осветленный» Сок осветленный
2 «Яблоко-виноград» Сок восстановленный осветленный
3 «Яблоко-абрикос с мякотью» Сок с мякотью восстановленный
4 «Вишня» Нектар
5 «Яблоко» Сок восстановленный
6 «Мультифрукт» Сок восстановленный неосветленный
7 «Яблоко-вишня» Сок восстановленный осветленный
8 «Яблоко-вишня» Нектар осветленный
9 «Яблоко» Сок восстановленный осветленный
10 «Яблоко» Сок прямого отжима
11 «Зеленое яблоко» Сок восстановленный осветленный
12 «Зеленое яблоко» Сок восстановленный осветленный
13 «Груша» Сок осветленный
14 «Яблоко прямого отжима» Сок прямого отжима осветленный
15 «Яблоко» Сок восстановленный осветленный
Материал и методы
Исследование проводили на системе для капиллярного электрофореза «Agilent 3D CE» (США) с диодно-матричным детектором. Сравнительное определение катионов калия проводили на масс-спектрометре с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС) ICP-MS серии 7700x (G 3281 A) производства фирмы «Agilent Technologies» (Япония) [3].
Для регистрации, обработки данных и определения параметров разделения использовали программное обеспечение «Agilent Chemstation B.04.03» (США).
Условия разделения
Разделение осуществляли на капилляре с общей длиной 64,5 см, эффективной длиной - 56 см, внутренним диаметром - 50 мкм с увеличенным оптическим путем (Agilent G1600-61232, США).
Использовали рабочий буферный раствор следующего состава: 20 ммоль/дм3 имидазола, 2 ммоль/дм3 18-краун-6 эфира, рН 3,6 (доводили муравьиной кислотой).
Ввод пробы: гидродинамический в течение 4 с при давлении 5 кПа. Напряжение: 25 кВ. Детектирование проводили при длине волны 210 нм, длина
75
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
г
волны сравнения - 350 нм. Перед проведением анализов капилляр промывали последовательно водой деионизированной в течение 10 мин, раствором щелочи с концентрацией 0,1 моль/дм3 в течение 5 мин, водой деионизированной в течение 10 мин, рабочим буфером в течение 10 мин. После проведения анализов промывка включала те же этапы, за исключением последнего. Между анализами проводили промывку рабочим буферным раствором в течение 10 мин.
Подготовка проб
Навеску образца (около 1 г) помещали в мерную колбу объемом 100 см3, прибавляли 200 мм3 раствора ацетата лития с содержанием ионов лития 0,5%, затем доводили объем буферным раствором. После перемешивания пробу центрифугировали в течение 10 мин (с относительной силой центрифугирования около 19 740д) и переносили в виалу объемом 2 см3.
Количественное определение проводили методом абсолютной градуировки. Для построения градуировочного графика использовали растворы, полученные разбавлениями раствора, содержащего катионы калия (0,05%), кальция (0,02%), натрия (0,02%), магния (0,02%).
Для улучшения воспроизводимости использовали коррекцию по внутреннему стандарту - катионам лития. Выбор катионов лития в качестве внутреннего стандарта обусловлен сравнительно
низкой электрофоретической подвижностью данных катионов и вследствие этого хорошим разрешением с исследуемыми катионами.
Результаты и обсуждение
Поскольку определяемые вещества не обладают необходимым поглощением в УФ и видимой областях спектра электромагнитного излучения, мы использовали так называемое непрямое УФ-детектирование, при котором зоны веществ регистрируются как области с пониженной концентрацией поглощающего вещества. Для этой цели с учетом данных литературы [4-7] был выбран имидазол, поскольку, помимо необходимого УФ-поглощения, он обладает электрофоретичес-кой подвижностью, близкой к катионам магния и натрия (что уменьшает размывание зон этих катионов при анализе).
Для выявления оптимальной концентрации ими-дазола были проведены исследования буферных электролитов с концентрацией имидазола 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 ммоль/дм3. Зависимость относительных величин времен миграции, кажущегося числа теоретических тарелок и соотношения сигнал/ шум от концентрации имидазола представлены на рис. 1-3 (приведены средние значения 3 определений для каждого типа буфера).
Результаты подбора оптимальной концентрации имидазола (рис. 1-3) показали, что при его низких концентрациях не достигается необходимого
кЧтт
^в-ва/ ^станд
0,9 0,85 0,8 0,75 0,7 0,65 0,6 0,55 0,5
10
20
■ К+
■ Са2+
■ Na+
30 40
ммоль/дм3
Mg2
500000 450000 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0
40
ммоль/дм3
■ Катионы калия
■ Катионы натрия
■ Катионы кальция
■ Катионы магния
Рис. 1. Зависимость относительных величин времени миграции Рис. 2. Зависимость кажущегося числа теоретических тарелок разных катионов от концентрации имидазола от концентрации имидазола
76
0
разделения катионов магния и натрия, присутствует нестабильность базовой линии. При высоких концентрациях происходит значительное возрастание шума, наблюдается нестабильность базовой линии, теряется эффективность в результате избыточного джоулева разогрева и нарушается разделение катионов кальция и натрия. Подобранная оптимальная концентрация имидазола составила 20 ммоль/дм3.
Для исследования зависимости эффективности разделения от рН была проанализирована смесь катионов с использованием буферных систем с различными значениями рН. Полученные данные представлены на рис. 4 и 5. При значениях рН менее 3,5, а также в диапазоне 4,5-6,0 наблюдалась нестабильность базовой линии. При росте рН наблюдается уменьшение времен миграции вследствие увеличения скорости электроосмотического потока, однако вследствие уменьшения буферной емкости происходит ухудшение робаст-ности системы.
Оптимальное значение рН было подобрано как близкое к рКа муравьиной кислоты (рКа=3,75) для обеспечения необходимой буферной емкости, стабильности системы, а также для перевода определяемых веществ и имидазола в ионную форму.
Для повышения селективности системы, в частности для разделения катионов аммония и калия, использовали добавление в буферный раствор 18-краун-6 эфира. Было исследовано влияние концентрации 18-краун-6 эфира (0; 0,32; 1; 1,5; 2; 2,5; 4 ммоль/дм3) на разделение и разрешение катионов, полученные результаты представлены на рис. 6 и 7. Как следует из этих рисунков, 18-краун-6 эфир селективно взаимодействует с катионами калия, что вызывает увеличение их времени миграции и разделение с катионами аммония.
ммоль/дм3
-♦- Катионы калия -■- Катионы кальция —А— Катионы натрия -х- Катионы магния
Рис. 3. Зависимость соотношения сигнала к шуму для разных катионов от концентрации имидазола
Для характеристики предложенной методики были определены линейность и минимальная обнаруживаемая концентрация (табл. 2).
Методика была апробирована на 15 образцах соковой продукции. Полученные результаты, а также результаты определения катионов макроэлементов с использованием метода масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС) представлены в табл. 3.
По результатам проведенных исследований видно, что 5 исследованных образцов по содержанию натрия не соответствуют требованиям нормативной документации (не более 30 мг/дм3); 2 из них - по содержанию калия. По результатам определения содержания катионов калия и магния в образцах соковой продукции можно сделать
■ рН 6,2 К и /ч
; рН 5.7 К Са № л Л I"1 и
' рН 4.9 к Са N3 1| Мд К и
' рН 4.5 к Са № и
' рН 4.1 к Са Иа Г9 и л--.
' рН 3.5 к Са N3 ц м9 и
■ рН 3,0 к Са N8 Л Мд и
—,—I—I—I—I—|—.—.—.—.—|—.—.—.—.—|—.—.—.—.—|—.—.—.—.—|—.—.—.—.—|—.—.—.—.—|—.—.—.—.—|—■
2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 пш
Рис. 4. Зависимость электрофоретического поведения исследуемых катионов от pH
77
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
г
кЧтт
кЧтт
600000 500000 400000 300000 200000 100000 0
2,5
3,5
4,5
-♦- Катионы калия -Ж- Катионы натрия -Ж- Катионы лития
5,5
■ Катионы кальция
■ Катионы магния
6,5 рН
200000 180000 160000 140000 120000 10000 80000 60000 40000 20000 0
40
ммоль/дм3
-♦- Катионы калия —А— Катионы натрия -Ж- Катионы лития
■ Катионы кальция
■ Катионы магния
■ Катионы аммония
Рис. 5. Зависимость кажущегося числа теоретических тарелок от рН. Использовались средние значения 3 определений для каждого типа буфера
Рис. 6. Влияние концентрации 18-краун-6 эфира на число кажущихся теоретических тарелок
^в-ва/ ^станд
ммоль/дм3
Таблица 2. Параметры оценки методики
Катион Минимальная обнаруживаемая концентрация в образце, мг/дм3 Коэффициент достоверности аппроксимации Диапазон определения катионов в пробе, мг/дм3
Калий 1,96 0,991 20-200
Кальций 2,04 0,998 0,8-8
Натрий 1,00 0,993 0,8-8
Магний 1,04 0,992 0,8-8
-♦- Катионы калия -■- Катионы кальция —А— Катионы натрия -х- Катионы магния -Ж- Катионы лития
Рис. 7. Влияние концентрации 18-краун-6 эфира на относительные величины времен миграции
вывод о том, что данные, полученные с помощью метода КЗЭ, достаточно хорошо совпадают с результатами, полученными с использованием метода ИСП-МС. Уравнение линейной регрессии и коэффициент достоверности аппроксимации при сравнении результатов, полученных методом КЗЭ и методом ИСП-МС по определению катионов маг-
78
ния, были определены как: у=0,999х+3,29; Я=0,952; по определению катионов калия: у=0,959х+51,94; Я=0,997; что свидетельствует о хорошей корреляции между этими методами.
Таким образом, результаты определения катионов калия и магния в соковой продукции, полученные методом капиллярного зонального электрофореза (при использовании капилляра с внутренним диаметром 50 мкм) с использованием катионов лития в качестве внутреннего стандарта с концентрацией контрастного вещества имидазола 15-20 ммоль/дм3 и 18-краун-6 эфира 2 ммоль/дм3, рН 3,6, согласуются с результатами определения данных элементов методом ИСП-МС.
Таблица 3. Результаты определения катионов магния, кальция, натрия и калия в образцах соковой продукции.
Код Содержание Mg2+ в образце, мг/дм3 Содержание K+ в образце, мг/дм3 Содержание Ca2+ в образце, мг/дм3 Содержание Na+ в образце, мг/дм3
КЗЭ ИСП-МС КЗЭ ИСП-МС КЗЭ КЗЭ
1 54±5 62±12 904±90 908±136 138±14 23±2
2 34±3 42±8 381±38 414±82 94±9 64±6
3 41 ±4 47±10 1152±120 1142±171 69±7 60±6
4 42±4 37±7 466±47 544±82 89±9 *
5 50±5 47±10 930±93 973±146 66±7 19±2
6 35±4 45±9 600±60 631±95 77±8 143±14
7 47±5 48±10 775±76 794±119 82±8 91 ±9
8 43±4 47±9 473±47 492±98 127±13 7,0±0,7
9 47±5 49±10 985±99 1009 ±151 66±7 30±3
10 40±4 47±10 1080±108 1089±163 44±4 *
11 30±3 33±7 561 ±56 584±88 63±6 162±16
12 33±3 34±7 724±72 743±112 52±5 14±1
13 89±9 96±19 1404±140 1432±215 131±13 5±2,0
14 46±5 49±10 1064±106 1032±155 65±7 20±2
15 57±6 54±11 853±85 835±125 158±16 8,0±0,8
* - не обнаружено (менее 0,8 мг/дм3).
Сведения об авторах
Малинкин Алексей Дмитриевич - младший научный сотрудник лаборатории химии пищевых продуктов ФГБУ «НИИ питания» РАМН (Москва) E-mail: sindar7@mail.ru
Бессонов Владимир Владимирович - доктор биологических наук, заведующий лабораторией химии пищевых продуктов ФГБУ «НИИ питания» РАМН (Москва) E-mail: bessonov@ion.ru
Шумакова Антонина Александровна - младший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности наноматериалов ФГБУ «НИИ питания» РАМН (Москва) E-mail: antonina_sh@list.ru
Арианова Елена Александровна - младший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности наноматериалов ФГБУ «НИИ питания» РАМН (Москва) E-mail: aria-elena@yandex.ru
Прокофьева Вера Ивановна - доктор фармацевтических наук, профессор кафедры фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России
Литература
Богачук М.Н., Бессонов В.В., Передеряев О.И. Методика количественного определения водорастворимых витаминов в витаминных премиксах и пищевых продуктах с использованием мицеллярной электрокинетической хроматографии на коротком конце капилляра // Вопр. питания. - 2011. - № 3. - С. 67-74. Богачук М.Н., Передеряев О.И, Раменская Г.В. Определение водорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах методом капиллярного зонального электрофореза // Вопр. биол., мед. и фармацевт. химии. -2011. - № 9. - С. 14-22.
МР 1.2.2641-10 Определение приоритетных видов нано-материалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах (п. 6.2). М.: Федераль-
ный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. -103 л.
Руководство по капиллярному электрофорезу / Под ред. А.М. Волощука. - М.: Научный совет Российской академии наук по хроматографии, 1996. - 111 с. Beckers J.L., Bochek P. The preparation of background electrolytes in capillary zone electrophoresis: Golden rules and pitfalls // Electrophoresis. - 2003. - Vol. 24. - P. 518-535. Beck W., Engelhardt H. Capillary Electrophoresis of Organic and Inorganic Cations with Indirect UV Detection. // Chro-matographia. -1992. V. 33. No. 7/8. P. 313-316. Capillary electrophoresis methods for pharmaceutical analysis / Ed.: S. Ahuja, M.L. Jimidar. Vol. 9. - London: Academic Press, 2008. - 529 р.
79
4
5
3
7
