CC BY
28
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1991
УДК 616.24-003.661-092.9-092:616.24-008.939.15-074
Л. М. Безрукавникова, Т. В. Вознесенская, Л. М. Купина
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЛИПИДОВ В ТКАНИ ЛЕГКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
Институт гигиены труда и профзаболеваний АМН СССР, Москва
Под термином «общие лнпиды» понимают сумму липидов, содержащихся в той или иной ткани, т. е. фосфолипидов, гликолипидов, нейтральных липидов (в том числе стеринов и стеридов). Современные данные свидетельствуют о важной роли липидов в мембранозависимых процессах, таких как транспорт веществ и катионов, окислительное фосфорили-рование, взаимодействие антиген — антитело, регуляция матричной активности хроматина и т. д. Изменение состава липидов влечет за собой сдвиги в активности мембраносвя-занных ферментов, а это в свою очередь может вызвать глубокие изменения всего клеточного метаболизма [2].
Как известно, суммарное содержание липидов в легких является ранним и информативным показателем степени развития фиброза легккх при экспериментальных пневмо-коннозах, что позволило использовать его для оценки фибро-генного действия промышленных аэрозолей [4]. ф В зависимости от целей исследования (определение "содержания общих липидов или отдельных фракций) по существующим методам липиды извлекают из ткани различными растворителями: эфиром, дихлорэтаном, ацетоном, смесью Фолча (хлороформ — метанол 2:1), смесью Блюра (этанол — эфир 3:1). Содержание липидов определяют гравиметрически по разнице в навеске ткани до и после экстракции или взвешиванием высушенного лииидного экстракта, полученного из заданной навески. Эти способы трудоемки, связаны с использованием горючих и токсичных веществ.
Мы поставили перед собой цель определить содержание общих липидов простым спектрофотометрическим методом, используя набор реактивов «Общие лнпиды» для определения в сыворотке крови и несколько модифицировав его. Метод основан на взаимодействии липидов с концентрированной серной кислотой с образованием карбонкевого аниона, который, реагируя с активированной карбонильной группой фосфата ванилина, образует окрашенный комплекс. Как утверждают авторы [5], в реакцию вступают в основном ненасыщенные соединения; насыщенные жирные кислоты — стеариновая, пальмитиновая, трипальмитиновая — в реакцию не вступают. Следовательно, этим методом мы фактически определяем не общие липиды, а липиды, содержавшие ненасыщенные жирные кислоты. Для подтверждения это-*,го вывода и сравнения получаемых результатов концентрацию липидов параллельно определяли путем экстракции их из навески сухой ткани легких в аппарате Сокслета. В качестве объекта использовали легкие контрольных крыс, крыс с экспериментальным силикозом (группа «Силикоз») н крыс, которым интратрахеалыю была введена малофиброгенная пыль графита (группа «Графит»),
Методика исследования. В зависимости от целей исследования подготовка легочной ткани может быть осуществлена двумя способами. Первый предполагает только количественное определение липидов из сухой ткани легких. При втором способе в хлороформ-.метанолыюм экстракте липидов можно определять фракции общих липидов (фосфолипиды, свободные жирные кислоты, холестерин; moho-, ди- и тригли-
цериды), продукты перекисного окисления липидов, антиокислительную активность и содержание липидных анти-оксндантов.
Реактивы: 1) серная кислота для пробы Саваля;
2) набор «Общие лнпиды» (фирмы «Лахема», ЧСФР) или эталонный раствор — общие лнпиды или трнолеин — 8 г/л, ванилин 10 ммоль/л, ортофосфорная кислота 11,5 моль/л;
3) смесь хлороформ — метанол 2:1, растворители используют свежеперегнанными; 4) смесь растворителей для верхней фазы — хлороформ — метанол — вода 8:4:3.
Первый способ. Высушенную в течение 24 ч в сушильном шкафу при 105 °С ткань легких измельчают в ступке до состояния порошка. Берут 3 пробирки — контрольную, эталонную и опытную. В эталонную пробирку добавляют 0,02 мл этанола из набора «Общие лнпиды», в опытную помещают 10 мг измельченной ткани. Во все 3 пробирки добавляют по 1,5 мл серной кислоты, тщательно перемешивают и кипятят в течение 30 мин на водяной бане. После охлаждения в 3 другие пробирки отбирают следующие аликвоты: из контрольной и эталонной пробирок по 0,2 мл, из опытной — 0,05 мл. В каждую из пробирок добавляют по 3 мл реактива, перемешивают и оставляют стоять 40—50 мин, после чего снова перемешивают и фотометрируют эталонную и опытную пробы против контрольной при длине волны 530 нм в кювете толщиной 1 см. Измерение должно быть проведено не позднее чем через 60 мин. Расчет проводят по формуле
Л=0,632А>пР'т-1СГ, АЭТ-т„
где X — количество липидов, содержащихся в легком, мг; Апр — оптическая плотность эталонного раствора; тИ — масса навески сухой ткани, г; тлег — масса сухого легкого, г; 0,632 — коэффициент пересчета, учитывающий разбавления, проводимые в процессе определения.
Второй способ. Легкие экспериментального животного взвешивают, измельчают ножницами; берут навеску 500 мг и гомогенизируют ее в стеклянном гомогенизаторе в 10 мл смеси Фолча, добавляя ее в 3 приема. Гомогенат количественно переносят в мерные пробирки с притертой пробкой, содержимое пробирок фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента» в другие мерные пробирки объемом 15 мл, промывают фильтр смесью хлороформ — метанол и доводят объем гомогената в пробирках до 10 мл. Затем лнпидный экстракт отмывают от нелипидных примесей 2 мл дистиллированной воды. Пробу энергично перемешивают и оставляют в холодильнике на ночь.
После отстаивания система разделяется на две фазы, объем нижней фазы составляет обычно около 7 мл. Верхнюю фазу тщательно декантируют с помощью пипетки с оттянутым концом и водоструйного насоса; поверхность нижней фазы промывают дважды 1,5 мл смеси хлороформ — метанол — вода, избегая перемешивания нижней фазы с промывной жидкостью; промывную смесь удаляют отсасыванием. В полученных пробах определяют содержание липидов так же,
Содержание липидов (в мг) в ткани легких экспериментальных животных, определенное различными методами (М±т)
Метод Группа хнвотных
«Графит» контроль I «Силикоз» Контроль 11
Фосфованилиновый из сухой ткани Фосфованилнновый из экстракта Экстракция в аппарате Сокслета 35,9±4,41 43,1+6,5 41,7±5,4 37,4±2,6 42,6±2,3 41,9±2,7 122,2±33,6 141,5±25,8 292,0±67,7 44,5±9,25 51,1 ±2,57 51,3±4,1
как при первом способе, с той лишь разницей, что в опытную пробирку отбирают 0,2 мл гндролизата; используемая после кипячения аликвота составляет также 0,2 мл. Расчет производят по формуле
Х= 12,53Аь •'«лег. эт
где X — количество липидов, содержащихся в легком, мг; Апр — оптическая плотность пробы; Аэт — оптическая плотность эталона; т1ег—масса сырого легкого, г; 12,53 — коэффициент пересчета.
Результаты сравнительной оценки различных методов определения липидов в легких контрольных крыс, крыс с экспериментальным силикозом и крыс, которым было введено интратрахеально 25 мг пыли графита, представлены в таблице. Число исследованных проб в каждой группе 6.
Сопоставление содержания общих липидов в легких контрольных животных и животных, которым была введена пыль графита, показало хорошее совпадение величин, полученных при экстракции липидов в аппарате Сокслета и при определении липидов, экстрагированных смесью Фолча, по реакции с фосфованилиновым реактивом (г=0,68 для группы «Графит» и г=0,72 для контроля). Содержание липидов в сухой ткани в этих двух группах .оказалось несколько ниже, чем таковое при использовании второго и третьего методов, что можно объяснить окислением ненасыщенных жирных кислот при высушивании ткани на воздухе при высокой температуре. Однако достоверных различий между значениями, полученными всеми тремя методами, не наблюдалось, что свидетельствует о возможности применения всех рассмотренных методов.
При изучении содержания липидов в легких животных с экспериментальным силикозом результаты, полученные при использовании первого и второго методов, достоверно не различаются между собой, тогда как содержание липидов, экстрагированных в аппарате Сокслета, более чем в 2 раза превышает значения, определенные по реакции с фосфованили-новой смесью. Установленные различия можно объяснить тем, что при экстракции эфиром из сухой ткани удаляются липиды, содержащие как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты, а при взаимодействии с фосфованилино-
вым реактивом определяются только липиды, содержащие ненасыщенные жирные кислоты.
Полученные нами данные по определению содержания липидов разными методами хорошо согласуются с представленными ранее результатами. Из работ (1,3] известно, что в легких животных при силикозе происходит накопление преимущественно нейтральных липидов, содержание же таких фосфолнпидов, как фосфатидилсерин и фосфатидил-этаноламин, снижается при повышении концентрации метаболически инертного сфингомиелина, т. е. накапливаются липиды с преимущественным содержанием насыщенных жирных кислот.
Таким образом, для изучения механизмов влияния различных промышленных аэрозолей на развитие фиброзного процесса в легких можно рекомендовать сопоставление результатов исследования содержания липидов двумя способами — экстракцией эфиром в аппарате Сокслета и методом с использованием фосфованилинового реактива. Это позволит сделать вывод о том, какие липиды преимущественно накапливаются в легких — содержащие насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты.
Метод определения липидов, в состав которых з основном входят ненасыщенные жирные кислоты, из сухой ткани легких по взаимодействию с фосфованилиновым реактивом обладает рядом преимуществ: он прост в исполнении, не требует длительных экстракций легковоспламеняющимися растворителями и может быть использован при многих экспериментальных исследованиях.
Литература
1. Бабушкина Л. Г. // Патогенез пневмокониозов.— Свердловск, 1970.—С. 124—133.
2. Галлер Г., Ганфельд М., Яросс В. Нарушения липидного обмена,— М„ 1979.
3. Купина Л. М. // Гиг. труда,— 1978,—№ 6,—С. 19—21.
4. Методические подходы к выбору и экспериментальным испытаниям средств патогенетической терапии и профилактики пневмокониозов: Метод, рекомендации.— М., 1986.
5. Knight A., Anderson S., Rawle J. М. // Clin. Chem.— 1972.—Vol. 18.—P. 199—202.
Поступила 22.06.90
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1991 УДК 616.5-008.949.5:662.232.7|-057-074
М. А. Черницьша, И. В. Березняк, М. В. Ларькина
ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭПИХЛОРГИДРИ НА В СМЫВАХ С КОЖНЫХ ПОКРОВОВ
Московский НИИ гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана
Современное производство и применение пластмасс и синтетических смол с использованием эпихлоргидрина (ЗХГ) приводят к загрязнению им как воздуха рабочей зоны, так и кожных покровов работающих.
В связи с выраженным токсическим действием ЭХГ на организм человека при поступлении через кожу необходимо нормирование его содержания на коже и осуществление систематического санитарного контроля за загрязнением кожи рук работников, контактирующих с ЭХГ, с помощью надежного объективного метода исследования.
В настоящее время методика измерения содержания ЭХГ в смывах с кожи отсутствует. В воздухе и воде ЭХГ селективно определяют методом газовой хроматографии на приборах с электронно-захватным (ЭЗД) и пламенно-ионизационным (ПИД) детекторами. Исследование воздуха с использованием ПИД проводят как при прямом анализе пробы воздуха [5], так и при анализе с применением различных способов концентрировання [7, 8|. В случаях использования ЭЗД отбор проб осуществляют только с концентрирова-
нием на сорбент с последующей десорбцией растворителем [4]. Для измерения концентраций ЭХГ в воде на уровне ПДК применяют сложные, трудоемкие и длительные способы подготовки проб к анализу с целью получения концентрированных устойчивых растворов ЭХГ, которые хроматографи-руют в основном с помощью ПИД. Так, авторы [2] преобразуют ЭХГ в 1,3-дихлоргидрин глицерина, экстрагируют его эфиром и анализируют концентрированный экстракт. В работе [3] представлены материалы по проведению адсорбционного концентрирования на активный уголь БАУ, экстракции ЭХГ серным эфиром в аппарате Сокслета в течение 3 ч с последующим упариванием экстракта под вакуумом. Более высокие концентрации ЭХГ определяют после перегонки с водяным паром [ 1 ]. Для хромато-графирования ЭХГ предложены различные носители с большим спектром неподвижных фаз и разнообразными условиями анализа.
Перед нами стояла задача разработки методики измерения содержания ЭХГ в смывах методом газожидкостной хрома-
