CC BY
99
УДК 61:575
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКРЫТОГО МОЗАИЦИЗМА И РОДИТЕЛЬСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Х ХРОМОСОМЫ У БОЛЬНЫХ С СИНДРОМОМ ШЕРЕШЕВСКОГО-ТЕРНЕРА В УЗБЕКСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ
Р.С. Мухамедов1, С.И. Исмаилов1, Л.Б. Нугманова1, Н.Ш. Ибрагимова1, Б.Ш. Адылов2, М.Д. Мирхайдарова2, Р. Якубова2, Б.Э. Назарова2, С.А. Музаффарова2
’Институт биохимии АНРУз, Ташкент, Республика Узбекистан Республиканский научно-практический медицинский центр эндокринологии Министерства здравоохранения Республики
Узбекистан, Ташкент E-mail: [email protected]
DETERMINATION OF HIDDEN MOSAICISM AND PARENTAL ORIGIN OF X CHROMOSOMES IN PATIENTS WITH SHERESHEVSKY-TERNER SYNDROME IN UZBEK POPULATION
R.C. Mukhamedov1, S.I. Ismailov1, L.B. Nugmanova1, N.Sh. Ibragimova1, B.Sh. Adilov2, M.D. Mirkhaydarova2, R. Yakubova2, B.E. Nazarova2, S.A. Muzaffarova2
’Institute of Biochemistry, Academy of Science of the Republic of Uzbekistan, Tashkent Republican Specialized Research and Practical Medical Centre of Endocrinology, Tashkent
В данном исследовании по образцам крови 41 пациентки с синдромом Шерешевского-Тернера в узбекской популяции и их 7 родителей с применением метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) полиморфных локусов Х хромосомы проводилось обнаружение скрытого мозаицизма, а также определение родительского происхождения Х хромосомы. Метод ПЦР позволяет эффективно детектировать моносомию, скрытый мозаицизм и родительское происхождение Х хромосомы.
Ключевые слова: синдром Шерешевского-Тернера, моносомия, мозаицизм.
In the given research on samples of blood of 41 patients with Shereshevsky-Terner syndrome in Uzbek population and their 7 parents with application of a method polymerase chain reaction (PCR) polymorphic loci X of a chromosome detection of hidden моsaicism and also definition of parental origin X of a chromosome were performed. Method PCR allows to detect effectively моnоsoмy hidden моsaicism and parental origin X of a chromosome.
Key words: Shereshevsky-Terner syndrome, моnоsoмy, моsaicism.
Введение
Здоровые женщины (46ХХ) имеют как хромосому, унаследованную от матери (Хт), так и хромосому, унаследованную от отца (Хр). Около 50% пациентов с синдромом Шерешевского-Тернера имеют 45Х моносомию, в то время как у остальной части регистрируется мозаицизм или структурные аномалии Х или У хромосомы.
Традиционным методом верифицирования СШТ является цитогенетический метод (кариотипирование). Известно, что в некоторых случаях низкий уровень мозаициз-ма может ускользнуть от детектиции при кариотипирова-нии. Также известно, что фенотип СШТ проявляет вариабельность, одной из причин которой является мозаицизм. Следовательно, определение скрытого мозаицизма является актуальным аспектом в диагностике СШТ. Фенотип СШТ также проявляет вариабельность даже у пациентов с немозаичным кариотипом, что привело к предположению, что на фенотип СШТ, возможно, оказывает влияние происхождение Х хромосомы. Исследование Цога Sagi и др. [3] показало, что родительское происхождение Х хромо-
сомы действительно влияет на несколько фенотипических признаков СШТ, таких как ожирение, аномалии почек, глаз и показателей липидного обмена, что предполагает потенциальное влияние импритинга генов, расположенных на коротком плече Х хромосомы.
В данном исследовании мы применили метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) полиморфных локусов Х хромосомы с целью обнаружения скрытого мозаициз-ма, а также определения родительского происхождения Х хромосомы у пациентов с СШТ в узбекской популяции.
Материал и методы
Образцы крови получены от 41 пациентки с синдромом Шерешевского-Тернера и 7 их родителей. Из них 24 пациентки стоят на учете в ОЭД МЗ РУз (диагноз подтвержден кариотипированием) и 17 пациенток из вновь обратившихся в 2009 г. в Республиканский научно-практический медицинский Центр Эндокринологии МЗРУз по поводу задержки роста и полового инфантилизма. Из 7
родителей 6 родителей женского и 1 родитель мужского пола.
Выделение ДНК из периферической крови девочек с синдромом Шерешевского-Тернера и их родителей проводилось набором реагентов DIATOM™ DNA prep 200. Три X полиморфных маркера: DMD 49, AR и DX1283E - были амплифицированы с помощью ПЦР. Локализация этих маркеров на X хромосоме приведена на рисунке 4, а их нуклеотидная последовательность приведена на рисунках 1, 2, 3 соответственно.
ПЦР амплификация проводилась в конечном объеме реакции 25 мкл, содержащим 1% ПЦР буфер, 250ц M dNTP, 1,5 mM MgCl2, 0,8ц M праймеров, 0,5U Taq полимеразы и 0,4-1 ДНК. Амплификация ДНК проводилась в термоциклерах Applied Biosystems. Специфические условия проведения ПЦР и олигонуклеотидная последовательность для каждого праймера приведены соответственно в таблицах 1 и 2.
ПЦР продукты были подвергнуты электрофорезу на 12% акри-ламид-бисакриламидном (29 :
1) геле с последующим окрашиванием ДНК этидий бромидом и визуализацией системой BioDocAnalyze (Biometra).
Результаты и обсуждение
Результаты ПЦР анализа полиморфных маркеров X хромосомы приведены в таблице 3.
Мы выбрали три X-сцепленные маркеры на основании их высокого уровня гетерозиготнос-ти (варьирующего от 88,6 до 93,3%), количества аллелей (от
11 до 19) и локализации как на коротком, так и на длинном плече Х хромосомы (рис. 4). Согласно Со1ю и др. [1], шанс детекции низкого уровня мозаицизма повышается с увеличением количества используемых различных маркеров. Следовательно, путем использования набора этих праймеров мы повысили вероятность получения информативного маркера и, соответственно, обнаружения скрытого Х-мозаицизма.
Амплификация маркера БМБ49 показала монозигот-ность по этому локусу у образцов 1-8, 10-16, 19-28, 3036, 38-40, 42-44, 47-48. Была также выявлена гетерози-
ТТСЗААСЗАСЗАААССТСАТСАТАТСССАСААСТСаААСАААСААТТТОАТСССААСТТТСТСТТСС
ТССТТТАССАССТСААААТСТСААСТАТСАААСССААСАААААТАСАСАСАСАСАСАСАСАСАС
АСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАССССТСТСССТТТТТСТСТАТССССАААСССТТСАСТ
ССАССТСАССАСТТСССАСТССАСГТАССАТСГТАСССТСССААСТТСТАТСТСТССАСССТТС
ТСАТАААСССТССАСААТССААААСАСОААТССТАТСАТАТСССТСТТСТТСТСТАААСАСТТС
САТСТАСТСТСТССТТТТАОААОА(ЗААТСТААТАСТСССАСАТТАСААССТСТТААТАААТТСС
Рис. 1. Нуклеотидная последовательность локуса DXS989-DMD49, сайты связывания прямого и обратного праймеров выделены серым цветом, динуклеотидный повтор (СА)п выделен подчеркнутой линией
САвТТА6(3(3<эСА(аАТАТ ССАСААСЗСС ТА(3(аА(аАТТТТ(зААСА(э<ЗСТ ТАТСС ССТС ТСАТС ТТСС ТССССТАААССС САССС СА6Т ТТАвСАСАТТАТСААвСТвСТТвТСАТТСАТТСТСТСТСТСТС ТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСОССАТАССТСТСТОА6ТАТТТА13СТАТТ ОТТСТАТАТАСТССАТАСАТСТАТТАТССОААСТТАААТАОАТААААТАСТАСТАААСАСАААС ААССААвТАССС ТАСТАААТААСААТ ТАААТССАСААТААТ САТТСАСТТС ТСАТ ТТТТАААТС
Рис. 2. Нуклеотидная последовательность локуса DXS1283E, сайты связывания прямого и обратного праймеров выделены серым цветом, динуклеотидный повтор (СТ)п выделен подчеркнутой линией п
ССАА(5СТСАА(ЗСАТ(ЗСААвТвСАвТТА(э<3<эСТ(3(ЗОАА(3(ЗСТСТАСССТС(ЗССС(ЗССвТССАА(аА
ССТАССвАСвАвСТТТССАСААТСТСТТССАСАССвТССССаААСТ(5АТССАвААСССвввССС
САСССАСССАОАвСССвСвАвСвСАвСАССТСССвСССССА6ТТТвСТ6СТвСТвСАвСА6САв
САСЗСА(зСА(ЗСА6СА(ЗСА(зСАвСА(эСА(зСА(эСА(зСА6СА(эСА(зСА(зСАСзСАОСА(зСАОСАА(дАСА
СТАСССССАО<ЗСА<ЗСАССА!ЗСА(ЗСА0СА(3<ЗОТОАОСАТ<ЗСТТСТССССАА0СССАТСОТАОА(ЗС
ССССАСАСССТАССТбСТССТСвАТвАвОААСАССААССТТСАСАвССОСАСТССССССТвСАС
ТвССАСССССАвАвА6СТТвСвТСССАвАвССТвСА6ССвССвТ6ССССССАвСААвССвСТвС
Рис. 3. Нуклеотидная последовательность локуса Ай, сайты связывания прямого и обратного праймеров выделены серым цветом, динуклеотидный повтор (САО)п выделен подчеркнутой линией п
Таблица 1
Характеристика Х хромосомного полиморфного маркера и специфические условия проведения ПЦР
Характеристика маркера
Условия ПЦР
Название локуса Локализация на хромосомной карте Количество аллелей Гетерози-готность, % Размер п. о. Денатурация Отжиг Элонгация Количество циклов Заключительная элонгация
DMD49 Xp11.1 19 93.3 117-157 94 "C, 30 s 61 "C 30 s 65 "C, 4 min 14 65 "C 10 min
AR Xq11.1 11 9О.1 195-115 94 "C, 60 s 58 "C, 1 min 71 "C, 1 min 30 65 "C 10 min
DX1183E Xp11.3 11 88,6 145-167 94 "C, 60 s 58 "C 60s 71 "C, 60 s 30 71 "C 7 min
Таблица 1
Нуклеотидная последовательность праймеров
Forward Primer Reverse Primer
DMD49 CGTTTACCAGCTCAAAATCTCAAC CATATGATACGATTCGTGTTTTGC
AR GAGGAGCTTTCCAGAATCT TTGCTGTTCCTCATCCAGGA
DX1183E AGTTTAGGAGATTATCAAGCTGG GTTCCCATAATAGATGTATCCAG
Таблица 3
Результаты ПЦР анализа полиморфных маркеров Х хромосомы (М - монозиготный, Г - гетерозиготный, НА - нет амплификации)
№ пациента Хр-короткое плечо Х хромосомы Xq-длинное плечо Х хромосомы Заключение Совпадение с результатами кариотипирования
DXS1283E DMD49 AR
1 М М М моносомия +
2 М М М моносомия +
3 М М М моносомия +
4 М М Г мозаицизм +
5 М М Г мозаицизм +
6 М М М моносомия +
7 М М М моносомия +
8 М М М моносомия +
9 Г Г Г мозаицизм +
10 Г М Г скрытый мозаицизм - (моносомия)
11 М М М моносомия +
12 М М М моносомия +
13 НА М М
14 М М Г мозаицизм +
15 М М М моносомия +
16 М М М моносомия +
17 М НА Г мозаицизм +
18 М НА М
19 М М М моносомия +
20 М М М моносомия +
21 М М М моносомия +
22 М М М моносомия +
23 М М М моносомия +
24 М М М моносомия +
25 М М М моносомия +
26 М М М моносомия +
27 М М М моносомия +
28 М М М моносомия +
29 М Г М здоровый (родитель) кариотипирование не проводилось
30 М М М моносомия
31 М М М моносомия +
32 М М М моносомия +
33 М М М моносомия +
34 М М М моносомия +
35 М М М моносомия +
36 М М М моносомия +
37 М Г Г здоровый (родитель) кариотипирование не проводилось
38 М М М моносомия +
39 М М М родитель моносомия кариотипирование не проводилось
40 М М М моносомия +
41 Г Г Г мозаицизм +
42 Г М М здоровый (родитель) кариотипирование не проводилось
43 М М М моносомия +
44 М М М здоровый (родитель XY) кариотипирование не проводилось
45 М Г М мозаицизм +
46 М Г М здоровый (родитель) кариотипирование не проводилось
47 М М Г мозаицизм +
48 Г М М здоровый (родитель) кариотипирование не проводилось
готность по этому локусу у образцов 9, 29, 37, 41, 45, 46.
Результаты ПЦР анализа маркера ОХ51283Е выявили монозиготность по этому локусу у образцов 1-8, 11-40, 43-48, а также гетерозиготность у образцов 9, 10, 41, 42. Амплификация маркера ЛИ (рис. 5) показала монозиготность у образцов 1-3, 6-8, 11-13, 15, 16, 18-36, 38-40, 42-46, 48 и гетерозиготность у образцов 4, 5, 9, 10, 14, 17, 41, 47.
Монозиготность по всем 3 маркерам указывает на наличие только одной Х хромосомы, что у пациентов женского пола будет соответствует истинной моносомии
(ХО). Гетерозиготность по крайней мере одного маркера говорит о наличии дополнительной второй Х хромосомы или части Х хромосомы. Это состояние наблюдается как при кариотипе 46ХХ (здоровые), так и при мозаичных вариантах хромосомных аномалий (45Х0-46ХХ, 45Х0-46ХУ). Поэтому ПЦР целесообразно проводить в комбинации с традиционным методом кариотипирова-ния. В отношении мозаицизма ПЦР метод имеет преимущество в сравнении с традиционным цитогенетическим анализом, выявляя скрытый мозаицизм, который не обнаруживается кариотипированием. Идентификация мо-
заицизма при синдроме Шерешевского-Тернера очень важна с точки зрения установки корреляций между фенотипом и кариотипом. Кроме того сравнительный анализ полиморфных маркеров пациенток СШТ и их родителей позволяет установить происхождение Х хромосомы и определить, в гаметогенезе какого из родителей произошло нарушение мейоза.
Следует также отметить, что у родителей мужского пола монозиготность по всем 3 маркерам является нормальным показателем, так как они содержат только одну Х хромосому (ХУ).
Результаты молекулярно-генетического исследования вместе с результатами кариотипирования позволяют сделать следующие заключения:
1. Наличие истинной моносомии у пациентов № 1-3, 6-8, 11, 12, 15, 16, 19-28, 30-36, 38, 40, 43.
2. Наличие мозаицизма у пациентов № 4, 5, 9, 10, 14, 17, 41, 45, 47.
3. Данные ПЦР анализа пациентки № 10 указывают на наличие скрытого мозаицизма, не детектированного кариотипированием.
ПРЦ анализ родителя под № 44, являющегося отцом ребенка № 43, показал монозиготность по всем 3 маркерам, что согласуется с нормальным мужским кариотипом ХУ. Сравнение ПЦР фрагментов 3 полиморфных маркеров Х хромосомы между ребенком № 43 и его отцом показало совпадение размеров длин этих фрагментов по всем 3 маркерам, что указывает на то, что единственная Х хромосома (45ХО) ребенка № 43 имеет свое происхождение от отцовской хромосомы и нерасхождение Х хромосом во время мейоза наиболее вероятно произошло в процессе оогенеза у матери этого ребенка (рис. 6). Образец № 39, соответствующий матери ребенка № 38, показал монозиготность по всем 3 маркерам, что, вероятно, может произойти в результате следующих причин:
1. Очень редкий случай моносомии (45ХО) без нарушения фертильности [2, 4].
2. Мать с нормальным вариантом 46ХХ родилась в результате близкородственного брака, что привело к комбинации двух идентичных хромосом, при этом все маркеры становятся одинаковыми и теряют свою информативность.
Следует также отметить, что сравнение ПЦР фрагментов 3 полиморфных маркеров Х хромосомы между ребенком № 38 и ее матерью показало различие по длине между маркерами БМБ49 и
Рис. 4. Схема Х хромосомы с локализацией полиморфных маркеров
Рис. 5. Результаты ПЦР на М маркер пациенток № 1-18
Рис. 6. Родительское происхождение Х хромосомы и нарушение мейоза
DXS1283E, что указывает на то, что единственная X хромосома (45ХО) этого ребенка имеет свое происхождение также от отцовской хромосомы и нерасхождение Х хромосом во время мейоза наиболее вероятно произошло также в процессе оогенеза у матери ребенка (рис. 6).
Таким образом, метод ПЦР позволяет эффективно детектировать моносомию, скрытый мозаицизм и родительское происхождение Х хромосомы.
Литература
1. Coto E., Toral J.E., Menendez M.J. et al. PCR-based study of the presence of Y chromo-some sequences in patients with Ullrich-
Turner syndrome // Am. J. Med. Genet. - 1995. - Vol. 57. -
P. 393-396.
2. Jacquemyn Y., Dumon J., Buytaert Ph. Ovarian function in the non-mosaic Turner syndrome; a case report // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. - 1989. - Vol. 30. - P. 187-191.
3. Sagi L., Zuckerman-Levin N., Gawlik A. et al. Clinical significance of the parental originof the X chromosome in Turner syndrome // J. Clinical Endocrinol. Metabol. - Vol. 92, No. 3. - P. 846852.
4. Philip J, Sele V. 45,XO Turner’s syndrome without evidence of mosaicism in a patient with two pregnancies // Acta Obstet. Gynecol. Scand. - 1976. - Vol. 55. - P 283-286.
Поступила 15.08.2011
