CC BY
121
Раздел I
БИОЛОГИЯ СЛОЖНЫХ СИСТЕМ. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ
УДК 621.039.324.2
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ В СУБСТАНЦИИ 4-АМНО-3-(ПИРИДИЛ-3)-БУТАНОВОЙ КИСЛОТЫ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
В.Г. БЕЛИКОВ, Б.В. БОРОВСКИЙ, А.Г.РАССКАЗОВ*
Разработана и валидирована методика количественного определения остаточных органических растворителей в некоторых субстанциях с использованием метода ГЖХ. Обнаружена примесь ацетальдегид в используемом для синтеза этаноле.
Ключевые слова: Производные у-аминомасляной кислоты, валида-ционная оценка, субстанция, газожидкостная хроматография, этанол.
Сотрудниками кафедры органической химии Российского государственного педагогического университета имени А.И.Герцена (г. Санкт-Петербург) было синтезировано новое гетероциклическое производное гамма-аминомасляной кислоты: 4-амино-3-(пиридил-3)-бутановой кислоты дигидрохлорид (РГПУ-195). Доклинические фармакологические исследования, проведенные в Волгоградском государственном медицинском университете, показали, что данное химическое соединение обладает кардиопротекторным и седативным действием, а также проявляет ноотропную и нейропротекторную активность [5].
Если в процессе синтеза лекарственного вещества используются органические растворители, то согласно ОФС 42-0057-07 предусматривают определение их количественного содержания. Органическими растворителями для синтеза 4-амино-3-(пиридил-3)-бутановой кислоты дигидрохлорида являются спирт этиловый и ацетон. Данные вещества являются летучими органическими растворителями третьего класса низкой токсичности. Для установления количеств указанных растворителей используют метод ГЖХ. Газохроматографический метод отвечает необходимым требованиям для количественного определения остаточных количеств растворителей в субстанциях, обеспечивая возможность проведения серийных анализов в малом количестве объекта, за короткое время и с достаточной точностью.
Цель исследования — количественное определение остаточных органических растворителей в субстанции РГПУ-195 методом газожидкостной хроматографии.
Материалы и методы исследования. Исследование проводили на пяти образцах РГПУ-195 предоставленными разработчиками. Используя традиционные методы ввода пробы в хроматографии - прямой ввод микрошприцом раствора в испаритель, большое количество воды может привести к разрушению (гидролизу) некоторых неподвижных жидких фаз, содержащих поли-этиленгликоль [1]. А попадание в хроматографическую колонку нелетучего вещества субстанции, может привести к блокированию активных центров неподвижных жидких фаз продуктами термического разложения. Использование летучих растворителей может привести к блокированию исследуемых веществ и затруднениям в детектировании.
Чтобы исключить перечисленные негативные факторы, для извлечения летучих остаточных растворителей был применен метод «анализа равновесного пара» (АРП) или «парофазный анализ» (ПФА), в зарубежной литературе получивший название Head - Space Analysis (HAS) [3,4], с элементами газовой экстракции. Этот метод позволяет получить информацию о составе и свойствах жидкостей и твердых тел путем анализа контактирующей с ними газовой фазы. Парофазный анализ в зависимости от условий применения различают на статический и динамический. Статический метод заключается в термостатировании определенного количества раствора субстанции, содержащего остаточные летучие растворители в термически закрытом сосуде. После установления фазового равновесия (30-40 мин), при котором часть летучего вещества переходит в газовую фазу, хроматографиче-ским шприцом отбирается часть газовой фазы и вводится в испаритель хроматографа. Динамический метод с приемами газовой экстракции различается на дискретную газовую экстракцию осуществляемую отдельной порцией инертного газа (газа носителя) в замкнутом объеме. И непрерывная газовая экстракция потоком
инертного газа, проходящего через жидкость или поверхность конденсированной фазы. Количество вещества, перешедшего в газовую фазу из раствора, зависит от соотношения объемов фаз и коэффициента распределения (К).
К= Сь / Со , (1) где Сь - концентрация летучего вещества в жидкости,
Со - концентрация летучего вещества в газовой фазе.
Тогда Сь= Со (К + г), (2) где г - коэффициент соотношения объемов фаз
г = Уо / Уь, (3) где Уо - объем газовой фазы, Уь - объем жидкой пробы.
В таком упрощенном варианте эти формулы лежат в основе статических и динамических вариантах ПФА, если пренебречь изменением объема жидкости за счет испарения раствора в процессе установления равновесия. Значения коэффициентов распределения (К) использовали из литературных источников [6]: этанол - 4440, ацетон - 484, для динамического метода. Для снижения коэффициентов распределения (до сотых значений) и повышения чувствительности применяли солевые добавки.
Для определения количества остаточных растворителей в субстанции РГПУ-195, был применен динамический метод с дискретной одноразовой газовой экстракцией, в замкнутом объеме на приставке для метода ПФА. Хорошая воспроизводимость пневматического дозирования в зависимости от характера исследуемого объекта и его свойства позволяют использовать любой метод дозирования ПФА - абсолютную градуировку, метод внешнего стандарта, метод добавки анализируемого вещества или внутренний стандарт.
Самый целесообразный путь проведения дискретной газовой экстракции - неполная замена равновесного газа на чистый газ-носитель. Эта операция легко и с высокой точностью реализуется путем отбора из сосуда с пробой части газа, находящегося под повышенным давлением и может сочетаться с пневматическим дозированием газа из сосуда с пробой в хроматограф.
Для калибровки летучих растворителей и определения коэффициентов распределения был применен метод экспоненциального разбавления (метод Ловелока) или (метод Фоулиса и Скотта) [2]. Несмотря на расхождения в формулах расчета концентраций веществ в выходящем из флакона с потоком газа-носителя, учитывая малые объемы флакона, расчет концентраций нужно проводить по простейшим соотношениям:
Сот= Соо/Уо, (4)
где С0т - концентрация летучего вещества в парогазовой смеси в данное время экспененциального разбавления (мг/мл), Уо - объем пропущенного газа-носителя (см3), С00 - начальная концентрация летучего вещества в паро-газовой смеси (при Уо=0) (мг/см3);
Соо= Р/Уфл, (5)
где: Р - навеска стандартного летучего вещества, помещенного во флакон (мг), Уфл - объем флакона (см3);
Уо= W • т, (6)
где: W - объемная скорость газа-носителя, продувающего флакон с образцом (см3/мин), т - время пропускания газа-носителя через флакон (мин).
После проведения калибровки методом экспоненциального разбавления с применением непрерывной газовой экстракцией, определяли калибровочный коэффициент или фактор отклика по формуле: Ф.о. = С0т/ Si • М, (7)
где: Si - площадь пика на хроматограмме i - того летучего вещества, М - масштаб шкалы электромера делителя выходного сигнала. Для определения коэффициента распределения летучего вещества между жидким раствором и паро-газовой фазой приготавливают растворы ацетона и этанола в воде для инъекций гравиметрическим методом с концентрациями для ацетона 0,08752 мг/мл и этанола 0,08794 мг/мл.
* ГОУ ВПО Пятигорская государственная фармацевтическая академия
Исследования проводили на газовом хроматографе марки ЛХМ - 8МД 5 (Россия). Он
Таблица 1
Хроматографические параметры разделения остаточных количеств растворителей
Исследуемое веществ Воспроизводимость (е) п=6 Открываемость Я±АЯ% Ст;п мг/мл пгф/водн. Стах мг/мл пгф/водн Чувств ^ А*С/мг Линейный диапазон конц. мг/мл Коэфф. ассиметр
Ацетальдегид 0,3081% 94±0,309 2,74* 10-6 2,47* 10-3 7,49* 10-7 1,8*10-52,47*10-3 1,5>3
Ацетон 0,5619% 98,57±0,977 2,68*10-5/ 3,557*10-4 3,15* 10 -3/ 0,334 1,63*10-7 1,7*10-30,334 1,5>3
Этанол 1,881% 97,5±0,551 1,22*10-5/ 1,07*10-3 9*10-3/ 1,576 1,21*10-7 8,8*10-3 1,576 2,0>3
Ацетон
Этанол
50*10-10А
Диапазон конц.эксп разбавл. мг/см3
Валидационные характеристики определения остаточных количеств растворителей
Ацетальдегид
Наименование пробы Летучие вещества, мг/гр Навеска, г
Ацетальдегид Ацетон Этанол
1. РГПУ-195 (май 2008) 0,0035 Не обнаружен 2,6384 0,200
2. РГПУ-195 (июнь 2008) 0,00094 Не обнаружен 3,0144 0,200
3. РГПУ-195 (сентябрь 2008) 0,004125 Не обнаружен 3,3691 0,200
4. РГПУ-195 (ноябрь 2008) Не обнаружен 0,6172 Не обнаружен 0,200
5. РГПУ-195 (февраль2009) 0,00513 Не обнаружен 3,6782 0,200
Ацетон
0,5619%
внутренним диаметром - 3 мм. Насадка: неподвижная жидкая фаза (НЖФ) - ББАР (карбовикс 20м, терминированный 2-нитротерефталиевой кислотой) в количестве 10% от твердого носителя (N=AW). Размер частиц 0,255 - 0,350 мм, температура колонки 85оС - режим изотермический, температура испарителя - 125оС, газ носитель - азот, скорость потока 30 мл/мин, температура термостата приставки (АРП) -85оС, объем реакционного флакона для установления равновесия жидкость - газ -13,8506 мл. Давление газа-носителя на входе в хроматографическую колонку 0,55КПа, давление газа-носителя во флаконе и в дозирующей петле - 1,25КПа, объем дозирующей петли 0,8954 мл. Время необходимое для установления равновесия перехода фаз - 7 мин, рабочая шкала электромера (иМт-05) 50^10-1 А, школа самописца (КСП-4) -1мВ.
Методика эксперимента состояла в следующем: 1 мл каждого образца помещали во флакон, термостатировали 7 мин, с помощью запорного крана производили подачу газа носителя до установления давления во флаконе 1,25 КПа. Далее производили ввод паро-газовой смеси через дозирующую петлю в хроматографическую колонку пневмоспособом. На хроматограмме идентифицировали по времени удерживания, измеряли высоты или площади пиков. С помощью фактора отклика определяем концентрацию (Со) и коэффициент распределения по формуле (1). Для ацетона и этанола эти коэффициенты соответствуют: 36,475 и 75,16 при 85оС термостатирования. Количественное содержание ацетона и этилового спирта (Сь) в водных растворителях вычисляли по формуле (2). Определение содержания ацетона и этилового спирта в субстанции РГПУ-195 проводили аналогичным способом и вычисляли по формуле:
Х;= С ь • 1,0 / Рпр, (8) где Рпр - навеска препарата (гр).
С использованием расчетного фактора отклика, полученного при калибровке паро-газовой фазы методом экспоненциального разбавления и экспериментально определенного коэффициента распределения фаз по высотам или площадям пиков, определяли концентрации остаточных количеств растворителей.
На рис.1 представлена хроматограмма, на которой наблюдаются симметричные пики остаточных органических растворителей ацетона и этанола, что свидетельствуют об адекватности предложенного способа хроматографического процесса. Пик №1 является специфической примесью в этаноле, используемым для синтеза РГПУ-195.
0,0004 - 0,0021
0,0008 - 0,0042
Фактор отклик. Ф.о.
Конц. в водном ра-ре (введена/обн)
мг/мл
0,08752/0,0024
0,08794/0,00117
Коэфф. РаспредК
Коэфф. разделен Кк
1,44>0,74
0,875>0,74
На следующем этапе исследования была проведена валида-ционная оценка разработанной методики, полученные результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2
СгаЬ мг/мл пгф/водн.
2,74* 10-'
2,68*10-5/ 3,557*10-4
1,22*10-5/ 1,07*10-3
Стах мг/мл пгф/водн
2,47* 10-3
3,15* 10 -3/ 0,334
9*10-3/ 1,576
Чувств ^ А*С/мг
7,49*10-
1,63*10-7
1,21*10-
Линейный диапазон конц.
мг/мл
1,8*10-52,47*10-3
1,7*10-30,334
8,8*101,576
Коэфф.
ассиметр __
1,5>3
Рис.1 ГЖХ-хроматограмма остаточных растворителей в субстанции РГПУ-195: 1 - ацетальальдегид;2 - ацетон;3 - спирт этиловый
В табл. 1 представлены параметры хроматографирования, которые были получены при определении остаточных органических растворителей в субстанции РГПУ-195. Как видно из рис. 1 и табл. 1 пики исследуемых веществ хорошо разделимы, симметричны, коэффициент разделения больше 0,75. Это свидетельствует о том, что разработанная методика позволяет хорошо разделить пики исследуемых остаточных органических растворителей.
Как, видно из табл. 2 разработанная методика обладает высокой воспроизводимостью, степень дисперсии не больше допустимого значения 5%. Методика обладает высокой чувствительностью, нижний порог детектирования 2,74* 10-3. Линейность соблюдается в диапазоне концентраций от 10-5 до 10-3. Коэффициент ассиметрии соответствует нормативам 1,5>3. Коэффициент распределения для ацетальдегида не определялся ввиду его высокой летучести.
В табл. 3 представлены результаты количественного определения остаточных органических растворителей в зависимости от их времени синтеза.
Таблица 3
Содержание остаточных количеств растворителей в субстанции РГПУ-195
Наименование пробы
1. РГПУ-195 (май 2008)
2. РГПУ-195 (июнь 2008)
3. РГПУ-195 (сентябрь 2008)
4. РГПУ-195 (ноябрь 2008)
5. РГПУ-195 (февраль2009)
Летучие вещества, мг/гр
Ацетальдегид
0,0035
Не обнаружен
Ацетон
Не обнаружен
Не обнаружен
Не обнаружен
Не обнаружен
Этанол
Не обнаружен
Навеска, г
По результатам табл. 3 видно, что по количественному содержанию остаточных органических растворителей, этанола содержится в субстанции РГПУ-195 больше, чем остальных органических растворителей. Отсутствие ацетоальдегида в серии синтезированной с использованием ацетона, подтверждает что ацетоальдегид является примесью в использованном для синтеза этаноле. Содержание остаточных органических растворителей сопоставимо с временем синтеза субстанции РГПУ-195.
Таким образом, была разработана методика количественного определения остаточных органических растворителей в субстанции РГПУ-195, этанола и ацетона, с использованием метода ГЖХ. Была обнаружена примесь ацетоальдегид в используемом для синтеза этаноле. Проведена валидационная оценка разработанной методики.
Литература
1. Вигдергауз, М.С. Расчеты в газовой хроматографии / М.С. Вигдергауз.- М.: Химия, 1978.- 248 с.
2. Витенберг, А.Г. Газовая экстракция в хроматографиче-ском анализе / А.Г. Витенберг, Б.В. Иоффе.- Л.: Химия, 1982.-280с.
3. Гольберт, К.А. Курс газовой хроматографии / К.А. Голь-берт, М.С. Вигдергауз.- М.: Химия, 1974.- 365 с.
4. Гольберт, К.А. Введение в газовую хроматографию / К. А. Гольберт, М.С. Вигдергауз.- М.: Химия, 1990.- 352с.
5. Перфилова, В. Н. Кардиопротекторные свойства структурных аналогов ГАМК: автореф. дис.... д-ра. биол. наук. Волгоград, 2009.- С.47.
6. Столяров, Б.В. Руководство к практическим работам по
газовой хроматографии / Б.В. Столяров, И.М. Савинов, Н.Г. Ви-тенберг.- Л.: Химия, 1988.- 241 с.
DEFINITION OF RESIDUAL ORGANIC SOLVENTS IN SOME SUBSTANCES BY MEANS OF GAS-LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD
V.G.BELIKOV, B.V.BOROVSKI, A.G.RASSKAZOV Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy
A new technique of quantitative defining residual organic solvents in some substances with use of gas-liquid chromatography method has been developed and validated. Acetaldehyde admixture in for ethanol synthesis is displayed.
Keywords: derivatives of y-amino butyric acid, validation, substance, gas-liquid chromatography method, ethanol.
УДК: 618.17:616-008.831
ОСОБЕННОСТИ ЖИРОВОГО И УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА В ПОСЛЕАБОРТНОМ ПЕРИОДЕ У ЖЕНЩИН, СКЛОННЫХ К МЕТАБОЛИЧЕСКОМУ СИНДРОМУ
А.Ф. ЗАВАЛКО*
В статье рассматривается динамика показателей холестерина, ЛПНП, ЛПВП, триглицеридов, уровня глюкозы натощак, после глюкозотолерантного теста до и после искусственного прерывания беременности у женщин высокого и низкого рисков реализации метаболического синдрома. Выявлена разнонаправленная динамика изучаемых показателей. В группе высокого риска в послеабортном периоде отмечаются изменения, характерные для прогрессирования метаболического синдрома. В группе низкого риска показатели углеводного и жирового обмена остаются стабильными. Установлено, что артифициальный аборт инициирует метаболические нарушения при наличии специфических предпосылок к их развитию. Ключевые слова: метаболический синдром, аборт.
В современной медицине широко представлены и описаны различные предпосылки, ведущие к развитию метаболических нарушений [1,3,6,11].
В этом плане артифициальный аборт занимает особое место. Влияние прерывания беременности многогранно: это и хирургическая травма, нейровегетативный стресс, гормональный стресс и оксидативный стресс. При этом в одной процедуре сочетаются нескольких триггеров метаболического синдрома (МС), которые усиливают негативные воздействия друг друга [5,7-10].
На поздних стадиях в акушерско-гинекологической практике метаболический синдром встречается в виде синдрома поли-кистозных яичников и нейро-обменноэндокринного синдрома. В тоже время ранними проявлениями метаболических дисфункций являются инсулинрезистентность и дислипидемия [2,3,4].
Учитывая существенное влияние аборта на развитие метаболических нарушений представляет интерес диагностика начальных изменений биохимических показателей крови у женщин высокого риска реализации МС.
Цель исследования — оценка клинико-лабораторных показателей жирового и углеводного обменов у женщин высокого и низкого риска развития МС в динамике до- и через 18 месяцев после артифициального аборта.
Материалы и методы исследования. Для реализации поставленной задачи нами проведено проспективное исследование, в котором участвовало 115 женщин в возрасте 18-35 лет, поступивших на искусственное прерывание беременности. Обследуемые пациентки были распределены на 2 группы: основная группа - 75 человек, у которых был высокий риск реализации МС; контрольная группа - 40 человек, у которых риск реализации МС был низким.
Группу высокого риска составили женщины, с нарушениями менструального цикла по типу гипоменструального синдрома в сочетании с 5 и более признаками, предрасполагающими развитию МС: раннее (до 12 лет) и позднее (позже 14 лет) менархе, более двух беременностей в анамнезе, отягощенный акушерско-гинекологический анамнез, индекс массы тела более 28 кг/м2, наличие регулярных стрессов, гирсутизм, инфекционные осложнения после родов, наличие стрий, склонность к гипертензии (АД более 130/85 мм.рт.ст.) [3,8].
Пациентам исследуемых групп не проводились специальные реабилитационные мероприятия, направленные на коррекцию нейроэндокринных нарушений. Женщины обеих групп были тождественны по возрасту, образованию, материальному обеспечению.
В ходе исследования за 1-5 суток до артифициального аборта и через 18 месяцев после него регистрировались объективные изменения таких биохимических показателей, как уро-
* Самарский медицинский институт, ММУ ГБ №10 г. Самара
вень глюкозы натощак и через 2 часа после стандартного глюкозотолерантного теста с нагрузкой 75 г глюкозы, общий холестерин, ЛПНП, ЛПВП, триглицериды.
Биохимические показатели крови, взятой натощак из деку-битальной вены, определялись с использованием полуавтоматической аналитической системы ФП-901-М фирмы «Labsystems» (Финляндия) путем применения адаптированных фотометрических микрометодов, представляющих собой унифицированные методы биохимических исследований с использованием стандартного набора реактивов.
Результаты и их обсуждение. Из полученных данных, представленных в табл. 1, видно, что в контрольной группе изменения изучаемых показателей до и после аборта были несущественными и находились в диапазоне вероятности от 0,101 (уровень ЛПВП) до 0,078 (уровень триглицеридов), т.е. был выше значений 0,05.
В основной группе по всем изучаемым показателям различия констатировались с р<0,05. Наибольшие изменения в до- и послеабортном периоде выявлены в уровне холестерина (рост на 16%) и ЛПНП (рост на 89%). По этим показателям различие диагностировалось с вероятностью менее 0,01. В основной группе существенными являлись различия уровня глюкозы натощак и после нагрузки (рост на 18% и 37,4%) с р=0,029 и р=0,012, а также триглицеридов (рост на 30%) с р=0,031, то есть через 18 месяцев после аборта отмечается их возрастание. Полученные данные свидетельствуют о росте атерогенного потенциала. Рост перечисленных показателей сопровождается снижением в основной группе уровня ЛПВП (p<0,05), оказывающего эндотелиопротек-тивное действие.
Нами было проведено сопоставление полученных результатов между основной и контрольной группами в период до - и после прерывания беременности.
Установлено, что уровень изучаемых показателей до аборта у наблюдаемых женщин основной и контрольной групп был примерно равным. Через 18 месяцев после прерывания беременности тождественности биохимических показателей у пациенток высокого и низкого риска развития МС не отмечалось. Наибольшие различия были выявлены в показателях холестерина (р=0,009), ЛПНП (р=0,0009), триглицеридов (р=0,009) и в уровне глюкозы после нагрузки (р=0,008).
Биохимические сдвиги, выявленные в основной группе наблюдаемых женщин через 18 месяцев после аборта, характерны для прогрессирования МС.
Беременность является состоянием, сопровождающимся формированием очага-доминанты беременности в коре головного мозга, в ходе которого меняются центральные регуляторные механизмы обмена веществ и поведения женщины: происходит гормональная и метаболическая перестройка организма. В этой ситуации артифициальный аборт является сильнейшим стрессом, так как он сопровождается не только хирургической и психологической травмой, но и срывом филогенетически детерминированных механизмов обеспечения роста плода и прогрессирования беременности.
Таблица 1
Биохимические показатели крови женщин, наблюдаемых групп до и через 18 месяцев после аборта
Показатель Основная группа (75 чел.) Р Контрольная группа (40 чел.) Р Р основ.-контр. (После аборта)
До аборта После аборта До аборта После аборта
М±т М±т М±т М±т
Глюкоза натощак (ммоль/л) 4,49±0,48 5,31±0,64 0,029 4,40±0,41 4,52±0,44 0,086 0,069
Глюкоза после нагрузки (ммоль/л) 6,71±0,99 9,22±1,34 0,012 6,39±0,47 6,33±1,02 0,096 0,008
Холестерин (ммоль/л) 4,22±0,11 4,91±0,20 0,009 4,30±0,13 4,28±0,10 0,09 0,009
ЛПВП (ммоль/л) 1,44±0,10 1,25±0,14 0,040 1,44±0,09 1,46±0,09 0.101 0,029
ЛПНП (ммоль/л) 2,09±0,07 3,95±0,15 0,0009 2,06±0,08 2,03±0,07 0,089 0,0009
Триглице-риды (ммоль/л) 1,60±0,10 2,08±0,21 0,031 1,56±0,16 1,54±0,10 0,078 0,009
Другой возможной причиной прогрессирования метаболических нарушений после аборта у женщин высокого риска могут быть исходно имеющиеся дисфункции гипоталамических структур, при наличии которых любое стрессовое воздействие приводит к дисбалансу регуляторных механизмов гипоталамуса и последующей реализации первоначально лабораторных симптомов, в дальнейшем клинических проявлений и, на заключительном этапе, к органной патологии.
Выводы. На основании проспективного наблюдения за женщинами высокого и низкого риска развития МС в течение 18
