CC BY
83
УДК 664:543 Ил 2. Библ. 8.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ И КОНСЕРВАНТОВ В МЯСНОЙ ПРОДУКЦИИ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Куликовский А.В., канд. техн. наук, Иванкин А.Н., доктор хим. наук, Шевченко Д.С.
ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова»
DETERMINATION OF ORGANIC ACIDS AND PRESERVATIVES IN MEAT PRODUCTS BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
Kulikovskii A.V., Ivankin A.N., Shevchenko D.S.
The V.M.Gorbatov All-Russian Meat Research Institute
Ключевые слова:
органические кислоты, консерванты, сорбиновая кислота, бензойная кислота, ВЭЖХ
Реферат
Сорбиновая и бензойная кислоты и их соли являются консервантами, широко применяемыми в пищевой промышленности из-за своего бактерицидного действия. Эти консерванты подавляют в микробных клетках активность ферментов, ответственных за окислительно-восстановительные реакции, подавляют рост дрожжей и бактерий маслянокислого брожения. Проведенные исследования позволили разработать селективную и чувствительную методику определения сорбиновой и бензойной кислот. Объектами исследований стали образцы пищевых продуктов, исследования которых проводили в рамках входного контроля торговыми сетями. Метод основан на экстракции сорбиновой и бензойной кислот и их солей из тщательно гомогенизированной пробы, осаждении белков раствором трихлоруксусной кислоты и последующем ВЭЖХ анализе в ультрафиолетовой (УФ) области спектра при длине волны 235нм. Измерения проводили на системе ВЭЖХ Ultimate 3000 (Dionex) с хро-матографической колонкой Mixed-Mode WAX-1 150x4,6 мм 5 мкм (Dionex). Результатом исследований, стала разработка ГОСТ 33809-2016 «Мясо и мясные продукты. Определение сорбиновой и бензойной кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии хроматографии».
Keywords:
organic acids, preservatives, sorbic acid, benzoic acid, HPLC
Summary
Sorbic and benzoic acids and their salts are preservatives, commonly used in the food industry because of their bactericidal action. These preservatives inhibit microbial cells in the activity of enzymes responsible for the oxidation-reduction reactions, inhibit the growth of yeast and bacteria clostridia. The research allowed to develop selective and sensitive method for determining the sorbic and benzoic acids. The objects of research have become food samples, the study which was carried out under the control of the input distribution networks. The method is based on extraction of sorbic and benzoic acids and their salts, thoroughly homogenized sample, precipitation of proteins with trichloroacetic acid solution, and subsequent HPLC analysis at a wavelength of 235 nm. Measurements were made on 3000 Ultimate HPLC system (Dionex) column chromatography with Acclaim Polar Advantage 150x4,6 mm 5 mm (Dionex). The result of research was the development of GOST 33809-2016 "Meat and meat products. Determination of sorbic and benzoic acids by HPLC chromatography».
Введение
орбиновая, бензойная, молочная и лимонная кислоты и их соли разрешены к использованию в пищевой промышленности, существуют регламентированные нормы их содержания в продукции. Однако недостаточный
уровень входного контроля на предприятиях как сырья, так и используемых пищевых добавок зачастую приводит к непреднамеренной фальсификации мяса и готовой продукции. Необходим плановый постоянный контроль выпускаемой продукции по показателям безопасности и качества.
ВСЕ О МЯСЕ №5 | 201G
Основной проблемой использования консервантов является определение их оптимальной концентрации для достижения безопасности. Недостаточное количество не обеспечивает хранение на заданный период времени, а избыток консервантов может быть неприемлем в связи с ухудшением качества защищаемых продуктов или по экономическим соображениям [1].
Использование консервантов в пищевой промышленности не может полностью компенсировать низкое качество сырья или нарушение правил промышленной санитарии. Многие консерванты вредны из-за своего свойства подавлять синтез некоторых белков. Степень их причастности к заболеваниям крови или раковым заболеваниям до конца не установлена из-за недостаточных исследований в этой области [2].
В условиях роста конкуренции производители вынуждены уделять первостепенное внимание вопросам сокращения потерь, в том числе и с помощью широкого использования консервантов, пролонгирующих срок хранения продукции. На российском рынке консервантов присутствует целый ряд отечественных и зарубежных производителей. Наибольшую популярность среди продуктов этой категории завоевали регуляторы кислотности и консерванты на основе органических кислот [3]. В настоящее время российский рынок консервантов насыщен низкокачественной продукцией, которая зачастую не соответствует как по концентрации целевых веществ, входящих в добавку, так и по составу веществ [4, 5].
В РФ в части контроля содержания консервантов действуют нормативные документы, регламентирующие их содержание, это ТР ТС 021/2011, ТР ТС 034/2013, ЕТ ТС № 299 [6-8]. Для продукции переработки плодов и овощей разработаны ГОСТ 28467-90 «Продукты переработки плодов и овощей. Метод определения бензойной кислоты», ГОСТ Р 50476-93 «Продукты переработки плодов и овощей. Метод определения содержания сорбиновой и бензойной кислот при их совместном присутствии», ГОСТ 30669-2000 «Продукты переработки плодов и овощей. Газохроматографический метод определения содержания бензойной кислоты», ГОСТ Р 52052-2003 «Продукты переработки плодов и овощей. Метод определения массовых долей сорбиновой и бензойной кислот с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии», ГОСТ 33332-2015 «Продукты переработки фруктов и овощей. Определение массовой доли сорбиновой и бензойной кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» по определению сорбиновой и бензойной кислот.
Для мяса и мясной продукции в перечне стандартов, в результате применения которых на добровольной основе обеспечивается соблюдение требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности мяса и мясной продукции» (ТР ТС 034/2013) отсутствует нормативный документ по контролю содержания консервантов, однако бензойная кислота запрещена к применению в мясной продукции, подвергнутой термической обработке. Помимо этого в качестве консервантов в РФ используются такие органические кислоты, как молочная и лимонная кислоты и их соли, присутствующие в мясе и мясной продукции в естественных фоновых количествах.
Существующие на данный момент методы определения консервантов основаны на спектрофотометрической идентификации. Данные методы не обладают достаточной селективностью и имеют высокую погрешность измерений. Оптимальной техникой, как с точки зрения селективности, так и чувствительности и доступности является высокоэффективная жидкостная хроматография — один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ, широко применяемый как в аналитической химии, так и в химической технологии.
Методы исследований
Инструментальную идентификацию консервантов проводили на высокоэффективном жидкостном хроматогафе Ultimate 3000 (Dionex). Подобранные параметры хрома-тографического разделения на анионообменной колонке Mixed-Mode WAX-1 длиной 150 мм и диаметром 4,6 мм с размером частиц 5,0 мкм, имеющей эффективность не менее 5000 теоретических тарелок по пику сорбиновой и бензойной кислот. В качестве стандартных веществ использовали чистые вещества Sigma Aldrich. Преимуществом данной колонки перед использованием обра-щенно-фазовых колонок типа С16-С18, является лучшее разделение таких пар органических кислот как молочная и уксусная. Это особенно актуально при подготовке проб с использованием таких реагентов для осаждения белка, как растворы Карреза, в состав которых входит уксусная кислота и ацетат цинка. Таким образом, при определении лимонной кислоты и лактатов происходит наложение пиков уксусной кислоты и ацетатов вследствие совпадения времен удерживания. Немаловажным фактором селективности определения консервантов является выбор длины волны спектрофотометрического детектора. Оптимальная длина волны для сорбиновой кислоты — 265 нм, для бензойной — 235 нм. На рисунке 1 видно насколько сильно меняется интенсивность пиков консервантов в зависимости от длин волн, так при 265 нм интенсивность пика сорбиновой кислоты более чем в 3 раза выше, чем при 265 нм. Благодаря использованию селективной длины волны стало возможным многократное повышение чувствительности.
В качестве подвижной фазы используется фосфатный буфер и ацетонитрил в режиме изократического элюиро-вания. Состав элюента — 50 % ацетонитрил, 50 % фосфатный буфер (pH = 6,0 ед. рН), скорость подачи элюента — 1,0 см3/мин в течение 20 мин., температура колонки — 30 °С. Подобные условия можно использовать и для разделения молочной кислоты и лактатов, а так же лимонной кислоты и цитратов, хроматограмма разделения которых приведена на рисунке 2. Для экстракции пробу массой 10 г помещают в центрифужную пробирку, добавляют 30 см3 2 % раствора трихлоруксусной кислоты и тщательно гомогенизируют. Гомогенат выдерживают на ультразвуковой бане при температуре 20 °С в течение 15 мин., а затем центрифугируют 5 мин. c центробежным ускорением 4000 д. Полученный супернатант пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографическую виалу вместимостью 2 см3.
Идентификацию пиков хроматограмм исследуемых проб мясной продукции проводили сравнением с хромато-граммой градуировочного раствора по двум параметрам:
2D16 | №5 ВСЕ О МЯСЕ
1 200 KONSERVANTK23.11 #3
1 - sorb. acid - 14,800
2 - benz. acid - 16,
min
20,0
KONSERVANTK23.11 #3
2 - sorb. acid - 14,792
1 - 13,70«.
3 - Ье^. acid - 16
min
20,0
LACTЮ&CITRIC #3 [modified ЬУ User] standart
mAU
1 - ЬасИс ас1с1 - 4.273
2 - СИмс аЫс1 - 5.267
Рисунок 1. Хроматограмма разделения смеси сорбиновой и бензойной кислот надлине волны 235 нм и 265 нм
отношения пиков хроматограммы анализируемой пробы совпадали в пределах допускаемых отклонений (ДД < 0,05, %) с времене м удерживания и спектральными отношениями соответствующих им пиков хроматограммы градуировочного раствора, результат идентификациисчи-тали положительным.
Если спектральные отношения совпадали в пределах допускаемых отклонений, а разницв времени удерживания пиков хроматограммы анализируемой пробы и хрома-тограммы градуировочного раствора больше допускаемых откленений, проводили хроматографический анализ соответствующего градуировочного раствора и сравнивали время удерживания. В дальнейшем, в случае совподения в качестве образца использовали новую хроматограмму. В случае повторного несовпадения времени удерживания использовали метод доСавск, для чего к анализируемой пробе добавляли известные количества определяемой сорбиновой или бензойной кислот с концентрацией, сравнимой с концентрацией «слмнительных» пиков и ансли-зировали. Если на хроматограмме пробы с добавкой площади «сомнительных» пиков увеличилась на величину, соответствующую величине добавки, эти пики относили к определяемым компонентам. Если на хроматограмме пробы с добавкой наряду с «сомнительными» пиками присутствовали пики, время удерживания и спектральные отношения которых совпадали с соответствующими параметрами добавленных веществ, сомнительные пики не относили к определяемым компонентам.
Диапазон измерений массовой доли сорбиновой и бензойной кислот и их солей от 0,01 % до 2,0 %. Методика позволяет одновременно определять не только сорбино-
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0
mir 15.0
Рисунок 2. Хроматограмма разделения смеси молочной и лимонной кислот
времени удерживания и спектральному отношению Д (отношение высот хроматографического пика на разных длинах волн). Если время удерживания и спектральные
МБ 2
№ 3
Ж/1_:235 пт
^1_:265 пт
3 000-
1 000-
2 500-
2 000-
1 500-
1 000-
0
0
-500
-200
2,5
17,5
2,5
ВСЕ О МЯСЕ №5 | 201Б
вую и бензойную кислоты, но их соли (сорбат натрия Е201, сорбат калия Е202, сорбат кальция Е203, бензонат натрия Е211, бензонат калия Е212, бензонат кальция Е213). Для пересчета сорбиновой или бензойной кислоты на их соли используют коэффициенты: К = 1,196 — для пересчета на сорбат натрия; К = 1,340 — для пересчета на сорбат калия; К = 1,170 — для пересчета на сорбат кальция; К = 1,180 — для пересчета на бензоат натрия; К = 1,311 — для пересчета на бензоат калия; К = 1,755 — для пересчета на бензоат калия *3Н20; К = 1,164 — для пересчета на бензоат кальция.
Диапазон измерения молочной и лимонной кислот составил от 0,1 % до 3,0 %. Методика позволяет одновременно определять лактаты (лактат натрия Е325, лактат калия Е326, лактат кальция Е327) и цитраты (цитрат натрия Е331, цитрат калия Е332, цитрат кальция Е333).
По результатам исследований в лаборатории «Научно-методических работ, биологических и аналитических исследований» (НМРБиАИ) разработаны методики, позволяющие определять молочную и лимонную кислоты и их соли — ГОСТ 33429-2015 «Мясо и мясные продукты.
Определение содержания молочной кислоты и лактатов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии», МИ 1035-135-2012 «Определение массовой доли лимонной и молочной кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в мясном сырье, мясных и мясосодержащих продуктах», а так же бензойную и сор-биновую кислоты и их соли — ГОСТ 33809-2016 «Определение сорбиновой и бензойной кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии». Ш
В КОНТАКТЫ:
Куликовский Андрей Владимирович V +7 (495) 676-79-61 а [email protected]
Иванкин Андрей Николаевич а [email protected]
Шевченко Денис Сергеевич а [email protected]
5. Дьяченко Ю.А. Оценка содержания сорбиновой кислоты в рационах питания старшеклассников и студентов и ее влияния на активность панкреатической липазы / Дьяченко Ю.А. // Вестник Адыгейского государственного университета. Серия 4: Естественно-математические и технические науки. — 2015. — № 1 (154). — С. 49-52.
Y. Dyachenko Y.A. Evaluation of the content of sorbic acid in the diets of senior pupils and students and its effect on the activity of pancreatic lipase / Dyachenko Y.A. // Herald of Adygeya State University. Episode 4: The natural-mathematical and technical sciences. - 2015. - № 1 (154). - P. 49-52.
6. Технический регламент Таможенного союза 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» от 09.12.2011 Technical Regulation CU 021/2011 "On food safety" from 09.12.2011
7. Технический регламент Таможенного союза 034/2013 «О безопасности мяса и мясной продукции» от 09.10.2013 Technical Regulations of the CU 034/2013 "On the safety of meat and meat products" from 09.10.2013
8. Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащих санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю), утв. Решением комиссии таможенного союза № 299 от 28.05.2010. Uniform sanitary and epidemiological and hygienic requirements for goods subject to sanitary and epidemiological supervision, approved by the (control). Commission Decision of the Customs Union of № 299 from 28.05.2010.
