CC BY
11экспериментальная и клиническая урология №4 2015 www.ecuro.ru
Определение мутации генов /5Ши РШШ в ДНК из осадка мочи у больных раком мочевого пузыря
Detection of FGFR3 and PIK3CA mutations in DNA isolated from urine sediment of bladder cancer patients
D.S. Mikhaylenko,
D.V. Perepechin, G.D. Efremov,
A.V. Sivkov, O.I. Apolikhin
More than 13 thousand cases of bladder cancer are registered in Russia annually that represents an actual problem in modern urologic oncology; Searching and characterization of new molecular markers of non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC - 80% of bladder cancer cases), identified in tumor cells from urine sediment are needed. We have provided complex analysis of mutations in the key oncogenes of NMIBC using PCR and subsequent sequencing of exons 7 and 10 of the gene FGFR3, exons 9 and 20 of the gene PIK3CA. NMIBC cohort includes 22 samples of DNA from urine sediments; control group consists 24 patients with cystitis and urolithiasis. Missense-mutations was detected in 32% NMIBC samples but not in controls. According databases ClinVar, COSMIC and HGMD most of them have been identified as pathogenic DNA-changes during carcinogenesis. Perhaps the panel with aforementioned genes and TERT promoter as addition locus with using allele-specific PCR or other method for the preferential amplification of mutant alleles could form the basis for the development a system of markers in non-invasive molecular genetic diagnostics of NMIBC.
Д.С. Михайленко, Д.В. Перепечин, Г.Д. Ефремов, А.В. Сивков, О.И. Аполихин
НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина -филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России
Г
жегодно в России реги-| J стрируют более 13 тыс. случаев рака мочевого пузыря • (РМП), представляющего | собой актуальную проблему современной онкоуро-^НН логии [1]. В настоящее время для неинвазивной лабораторной диагностики РМП применяют рутинный цитологический анализ мочи, чувствительность которого составляет 25-50% при диагностике небольших высокодифференциро-ванных опухолей. FISH-анализ осадка мочи (зонды на хромосомы 3, 7, 17 и 9р21), иммуноферментный анализ на иВС-антиген (цитокератины 8 и 18), ВТА-тест или определение NMP22 с чувствительностью и специфичностью, близкими к 80-90%, имеют ограниченное применение в клинике [2]. Остается актуальной проблема поиска и характеристики новых молекулярных маркеров РМП, выявляемых в опухолевых клетках из осадка мочи и обладающих высокой диагностической точностью.
В основе развития РМП лежат разнообразные молекулярно-гене-тические нарушения в соматических клетках: точковые мутации, протяженные делеции (потеря гете-розиготности) в областях локализации генов-супрессоров, амплификация онкогенов, аберрантное метилирование ДНК, изменения паттерна экспрессии регуляторных РНК и большого количества структурных генов [3]. Из всего перечисленного выше, точковые мутации
обладают наибольшей потенциальной ценностью как диагностические маркеры, поскольку они являются частым событием канцерогенеза, могут быть выявлены в опухолевых клетках из осадка мочи (в том числе, при рецидиве заболевания) и представляют собой изменение ДНК, выявляемое рутинными молекуляр-но-генетическими методами [4, 5].
Около 90% случаев РМП представлены уротелиальной карциномой, у 80% пациентов наблюдают поверхностные и у 20% - мышечно-инвазивные опухоли. За различиями в морфологической классификации, стадировании и прогнозе РМП стоят разные паттерны мутаций. Например, для инвазивного рака характерны множественные делеции районов локализации генов-супрессоров (3р, 5q, 14q, 9q и др.), самой частой из которых является делеция 9р21 с генами-супрессо-рами ЛЯГ, CDKN2A, CDKN2B, и он развивается через стадию диспла-зии. Напротив, характерными чертами поверхностных опухолей являются активирующие мутации и гиперэкспрессия протоонкогенов (FGFR3, ЕЯВВ2, HRЛS, и др.), поверхностный РМП (ПРМП) развивается через стадию гиперплазии, часто бывает мультифокальным и рецидивирующим [6, 7].
В настоящее время идентифицированы сотни мутаций в прото-онкогенах, задействованных в канцерогенезе наиболее частой формы РМП - ПРМП. Среди них можно
экспериментальная и клиническая урология №4 201 5 www.ecuro.ru
выделить точковые мутации, которые встречаются с частотой более 10% в первичных опухолях и локализованы в «горячих точках» мутагенеза. Это активирующие миссенс-мутации в 7 и 10 экзонах гена рецептора фактора роста фибробластов 3 (FGFR3), 9 и 20 экзонах гена фосфоти-дилинозитолкиназы (Р1К3СА).
Ген FGFR3 локализован в области 4р16.3, содержит 19 экзонов, из которых в образовании полноразмерного транскрипта участвуют эк-зоны 2-18 [8]. По различным данным, от 50 до 80% первичного уро-телиального рака при ПРМП несут мутации FGFR3, тогда как в инва-зивных опухолях и их метастазах эта частота составляет не более 10% [7, 9]. Ген FGFR3 принадлежит к семейству генов трансмембранных рецепторов FGFR1-4, которые кодируют гликопротеины - рецепторы фактора роста фибробластов (FGF). Рецептор состоит из трех иммуноглобулин-подобных доменов, обращенных в цитоплазму и связывающихся с сильным митогеном FGF1/2, трансмембранного домена и внутриклеточного тирозинкиназ-ного домена, взаимодействующего со вторичными мессенджерами. После связывания с лигандом рецептор димеризуется и активирует тиро-зинкиназный домен. FGFR3 задействован в Р1К3СА/АКТ1 сигнальном пути. Почти все описанные миссенс-мутации находятся между ^-подобными доменами или в трансмембранном домене, способствуя прочной димеризации и конститутивной активации FGFR3 по механизму образования дисульфид-ных мостиков или иных прочных взаимодействий. Локализация большинства точковых мутаций FGFR3 при ПРМП - экзон 7 (кодоны 248 и 249) и экзон 10 (кодоны 373 и 375) [7, 10-12].
Миссенс-мутации Р1К3СА встречаются в 15-25% случаев ПРМП и значительно реже - при инвазивном РМП. Они локализуются, в основном, в спиральном домене (542 и 545 кодоны) и киназном домене
(1047 кодон). Зачастую мутации сопряжены с потерей гетерозиготно-сти (аллельными делециями) гена РТЕN продукт которого ингибиру-ет сигнальный путь Р1К3СА/АКТ. Хотя мутации в указанных доменах обладают сходным трансформирующим эффектом в клеточных линиях, отношение частоты мутаций в ки-назном и спиральном доменах варьирует в зависимости от типа опухоли: от 0,29 в РМП до 2 в раке эндометрия, что указывает на возможные различия в механизмах активации сигнального пути Р1К3СА/АКТ [13].
Целью настоящей работы является комплексный анализ мутаций в 7-ом и 10-ом экзонах гена FGFR3, 9-ом и 20-ом экзонах гена Р1К3СА в образцах геномной ДНК из осадка мочи у пациентов с ПРМП и контроля для разработки метода неинвазивной молекулярно-генети-ческой диагностики ПРМП.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выборки пациентов. Исследовали 22 образца осадков мочи от больных ПРМП, группу контроля составили 24 пациента с циститом и мочекаменной болезнью.
Пробоподготовка. Собирали 10-30 мл первой порции мочи, центрифугировали при 3000 g в течение 15 мин, удаляли супернатант. Осадки замораживали при минус 70°С.
Получение образцов ДНК. Геномную ДНК из осадков мочи выделяли с помощью набора «ДНК-сорб В» (Интерлабсервис, Россия), при котором нуклеиновые кислоты сорбируются на носителе с последующей отмывкой спиртовыми растворами и эллюцией в ТЕ-буфер.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Проводили ПЦР участков гена FGFR3 с праймерами 7F:5' -agtggcggtggtggtgagggag - 3' и 7R:5' -tgtgcgtcactgtacaccttgcag - 3' (экзон 7), ^:5' - caacgcccatgtctttgcag - 3' и 10R:5' - aggcggcagagcgtcacag - 3' (экзон 10). Программа амплификации для эк-зона 7 - 95°С 1 мин 30 с, затем 35
циклов 95°С 40 с, 64°С 25 с, финальная элонгация 72°С 40 с; для экзона 10 - 95°С 1 мин 40 с, затем 35 циклов 95°С 40 с, 62°С 30 с, 72°С 20 с, финальная элонгация 72°С 1 мин. ПЦР участков гена PIK3CA проводили с праймерами 9F:5' -gggaaaaatatgacaaagaaagc - 3' и 9R:5' -ctgagatcagccaaattcagtt - 3' (экзон 9), 20F:5' - ctcaatgatgcttggctctg - 3' и 20R:5' - tggaatccagagtgagctttc - 3' (экзон 20) по программе, аналогичной амплификации экзона 10 гена FGFR3. Состав реакционной смеси ПЦР: 50-100 нг геномной ДНК, 2.5 мМ MgCl2, 1.5 мМ каждого dNTP, по 2 пмоль прямого и обратного праймеров, 1 ед. термостабильной Taq-полимеразы, 5 мкл буфера для ПЦР 5х (Интерлабсервис, Россия), объем смеси составлял 25 мкл.
Секвенирование ПЦР-продук-тов. Предварительно обрабатывали ПЦР-смесь 1 е.а. щелочной фосфа-тазы и 4 е.а. экзонуклеазы I из E.coli для удаления непрореагировавших праймеров и dNTPs. Затем проводили секвенирование ПЦР-про-дукта по Сэнгеру с помощью набора «BigDye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit» на 24-х капиллярном секвенаторе 3500xl (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям фирмы-производителя.
Статистический анализ результатов. Определяли частоту мутаций в группе ПРМП и сравнивали ее с контролем с помощью двустороннего точного критерия Фишера, используя программу Graph-PadInStat. Поиск данных о выявленных мутациях и их патогенетическом значении осуществляли в международных базах данных HGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk), COSMIC (http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) и ClinVar (http://www. ncbi. nlm.nih.gov/ clinvar).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Проведен комплексный анализ мутаций в ключевых онкогенах ПРМП, включающий ПЦР и IB
экспериментальная и клиническая урология №4 2015 www.ecuno.ru
Мутация с. 746C^G (p.S249C)
Мутация с. 1124A^G (p.Y375C)
9 ЛТ «CCI ï С > X > С ' <
Б
Рис. 1. Примеры секвенирования мутаций в гене FGFR3.
последующее секвенирование экзо-нов 7 и 10 гена FGFR3, экзонов 9 и 20 гена PIK3CA (рис. 1). Были исследованы образцы ДНК из осадка мочи 22 больных ПРМП и 24 пациентов контрольной группы с неонкологическими заболеваниями мочевыде-лительной системы. Мутации были выявлены у 31,8% (n=7) пациентов с ПРМП, в контрольной группе мутации не обнаружены (р<0,01). Из 7 случаев ПРМП с мутациями, в 6 образцах они были локализованы в гене FGFR3: 2 мутации - в седьмом и 4 мутации - в десятом экзонах. Еще одна мутация p.H1047R была детектирована в 20 экзоне гена PIK3CA (табл. 1). Аллели, отличающиеся от референсных, были сопоставлены с базами данных клинических ассоциаций с изменениями генома (HGMD, COSMIC, ClinVar) с целью выяснения патогенетической роли выявленных мутаций. За исключением мутации p.H251G и p.F386L,
мены были охарактеризованы как патогенные мутации в злокачественных опухолях. Наблюдаемое отношение частот мутаций FGFR3 к Р1К3СЛ как 85:15 при ПРМП, в целом, соответствует данным других авторов [7, 12, 13].
В уротелиальной карциноме чаще встречаются мутации в киназ-ном домене (как и обнаруженная в образце ПРМП мутация p.H1047R), тогда как в опухолях других типов преобладают мутации в спиральном домене [14]. Одна из мутаций FGFR3 (р.Н25Ш) отсутствовала в базах данных клинических ассоциаций, однако в 251 кодоне были описаны другие онкогенные миссенс-мута-ции.
В настоящей работе показано, что определение мутаций FGFR3 к Р1К3СЛ в осадке мочи с помощью ПЦР и секвенирования по Сэнгеру может быть использовано для выявления ПРМП. Однако частота мутаций FGFR3 в этой работе оказалась на 20-30% ниже, чем в исследованиях с применением методов целенаправленной амплификации и детекции мутантных аллелей. Вместе с тем, применение тест-систем для выявления мутаций FGFR3 методом аллель-специфичной ПЦР в реальном времени или ПЦР с последующим минисеквенированием показало целесообразность использования соматических мутаций этого гена как маркеров РМП в первичной диагностике заболевания [12, 15, 16].
оставшиеся 4 однонуклеотидные за-Таблица 1. Мутации FGFR3 и PIK3CA, выявленные в настоящей работе
Ген Экзон Обозначение Обозначение мутации на мутации на уровне кДНК уровне белка Сведения в базе данных HGMD (при отсутствии - COSMIC) Сведения в базе данных ClinVar
FGFR3 7 c.746C^G p.S249C CM950470, патогенная ^121913483, патогенная
FGFR3 7 c.753C^G p.H251G нет в академической версии ^377554120, нет данных
FGFR3 10 c.1124A^G p.Y375C HGMD и COSMIC ^121913485, патогенная
FGFR3 10 c.1144G^C p.G382R CM960657, патогенная ^28931614, патогенная
FGFR3 10 c.1156T^C* p.F386L* CM940785, патогенная ^17881656, значение не установлено
PIK3CA 20 c.3140A^G p.H1047R HM040060, возможно патогенная нет в академической версии HGMD, COSM94986,патогенная ^121913279, патогенная
Примечание: * - мутация обнаружена в двух случаях ПРМП; базы данных: HGMD - Human genome mutation database, ClinVar - public archive of relationships among sequence variation and human phenotype в структуре NCBI (The National Center for Biotechnology Information, США), COSMIC - Catalogue of Somatic Mutations in Cancer.
Определение специфичных для ПРМП мутаций актуально не только при диагностике первичного РМП, но и при мониторинге рецидива. После удаления первичного ПРМП необходимо регулярно проводить цистоскопию, т.к. в 70% случаев в последующие годы развивается рецидив заболевания. Проведение цистоскопии сопряжено со значительным дискомфортом для пациента, анализ соматических мутаций в осадке мочи мог бы использоваться, как дополнительный критерий отбора пациентов для проведения этой диагностической процедуры [5].
Увеличение чувствительности теста может быть достигнуто, в том числе, за счет включения в список исследуемых локусов активирующих мутаций -124G^A и -146G^A в промоторе гена теломеразы TERT, которые встречаются в 60% случаев ПРМП [18].
Проблему низкого содержания мутантных аллелей FGFR3 на фоне избытка нормальной ДНК при мониторинге рецидива РМП пытались решить с помощью одной из платформ секвенирования следующего поколения, что позволило выявить мутации FGFR3 при доле мутант-ных аллелей, равной 0,02%. Однако в этом случае возникает вопрос о клинической значимости мутаций. Во-первых, соматические мутации FGFR3 могут возникнуть еще на стадии предраковых изменений до морфологически сформированной опухоли. Во-вторых, конкордант-ность результатов поиска мутаций в осадке мочи и первичной опухоли составляет не более 90% [18]. Отчасти различия в частоте мутаций могут также зависеть от стратификации выборки ПРМП по степени дифференцировки опухоли (в настоящей работе не было разделения по степени злокачественности вследствие малого объема выборки ПРМП).
По данным мета-анализов, активирующие мутации FGFR3 при ПРМП ассоциированы с ранней стадией заболевания и высокодифференциро-
экспериментальная и клиническая урология №4 2015 www.ecuro.ru
ванной карциномой [11, 12]. Следует отметить, что при низкой частоте встречаемости мутаций FGFR3 при мышечно-инвазивном РМП, гиперэкспрессия этого гена наблюдается в 40% этих опухолей, а в 5% уротели-ального рака и некоторых клеточных линиях РМП при отсутствии точко-вых мутаций FGFR3 выявлены химерные онкогены FGFR3:TACC3 и FGFR3:BAIAP2L1 [9, 19]. Это указывает на более значительную роль кон-
ститутивной активации FGFR3 при РМП в целом, чем значение описанного ранее онкогенного потенциала точковых мутаций в нескольких экзо-нах при поверхностном раке.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, активирующие миссенс-мутации в «горячих точках» генов FGFR3 и PIK3CA были определены в осадке мочи у пациентов с
ПРМП в 32% случаев с помощью ПЦР и последующего капиллярного секве-нирования по Сэнгеру. При включении в панель исследуемых локусов промотора гена TERT и использовании аллель-специфичной ПЦР или иного метода для преимущественной амплификации мутантных аллелей на фоне избытка нормальной ДНК, возможна разработка системы маркеров для неинвазивной молекулярно-гене-тической диагностики ПРМП. □
Резюме:
Ежегодно в России регистрируют более 13 тыс. случаев рака мочевого пузыря, представляющего собой значительную проблему в современной онкоурологии. Остается актуальной проблема поиска новых молекулярных маркеров поверхностного рака мочевого пузыря (ПРМП, составляющего 80% случаев заболевания), выявляемых в опухолевых клетках из осадка мочи. В настоящей работе был проведен комплексный анализ мутаций в ключевых онкогенах ПРМП, включающий ПЦР и последующее секвенирование эк-зонов 7 и 10 гена FGFR3, экзонов 9 и 20 гена PIK3CA. Проанализированы 22 образца ДНК из осадков мочи от пациентов с ПРМП, группу контроля составили 24 пациента с циститом и мочекаменной болезнью. Миссенс-мутации были определены у пациентов с ПРМП в 32% случаев и отсутствовали в контрольной группе. Согласно базам данных ClinVar, COSMIC и HGMD большинство выявленных мутаций охарактеризованы как патогенные при развитии злокачественных опухолей. Возможно, при включении в панель промотора гена TERT, использовании аллель-специфичной ПЦР или иного метода для преимущественной амплификации мутант-ных аллелей будет разработана система маркеров для неинвазивной молекулярно-генетической диагностики ПРМП.
Ключевые слова: рак мочевого пузыря, гены FGFR3 и PIK3CA, мутация. tey words: bladder cancer, FGFR3 and PIK3CA genes, mutation.
ЛИТЕРАТУРА
1. Злокачественные новообразования в России в 2012 году (заболеваемость и смертность). Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России. 2014. 250 с.
2. Чиссов В.И., Алексеев Б.Я., Русаков И.Г. Онкоурология: национальное руководство. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2012; 688 c.
3. Mendelsohn J., Howley P.M., Israel M.A., Gray J.W., Thompson C.B. The Molecular Basis of Cancer. 4rd edition. Saunders, Philadelphia (USA), 2015.
4. Tan D., Lynch H.T. Principles of Molecular Diagnostics and Personalized Cancer Medicine. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia (USA), 2013.
5. Zuiverloon T.C., Tjin S.S., Busstra M., Bangma C.H., Boeve E.R., Zwarthoff E.C. Optimization of nonmuscle invasive bladder cancer recurrence detection using a urine based FGFR3 mutation assay. J. Urol. 2011; 186(2): 707-712.
6. Hoglund M. The bladder cancer genome: chromosomal changes as prognostic markers, opportunities, and obstacles. Urol. Oncol. 2012; 30(4): 533-540.
7. Knowles M.A., Hurst C.D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nat. Rev. Cancer. 2015; 15(1): 25-41.
8. Pandith A.A., Zhah Z.A., Siddiqi M.A. Oncogenic role of fibroblast growth factor receptor 3 in tumorigenesis of urinary bladder cancer. Urol. Oncol. 2013; 31(4): 398-406.
9. Guancial E.A., Werner L., Bellmunt J., Bamias A., Choueiri T.K., Ross R., Schutz F.A., Park R.S., O'Brien R.J., Hirsch M.S., Barletta J.A., Berman D.M., Lis R., Loda M., Stack E.C., Garraway L.A., Riester M., Michor F., Kantoff P.W., Rosenberg J.E. FGFR3 expression in primary and metastatic urothelial carcinoma of the bladder. Cancer Med. 2014; 3(4): 835-844.
10. Dodurga Y., Tataroglu C., Kesen Z., Satiroglu-Tufan N.L. Incidence of fibroblast growth factor receptor 3 gene (FGFR3) A248C, S249C, G372C, and T375C mutations in bladder cancer. Genet. Mol. Res. 2011; 10(1): 86-95.
11. Liu X., Zhang W., Geng D., He J., Zhao Y., Yu L. Clinical significance of fibroblast
growth factor receptor-3 mutations in bladder cancer: a systematic review and meta-analysis. Genet. Mol. Res. 2014; 13(1): 1109-1120.
12. Iyer G., Milowsky M.I. Fibroblast growth factor receptor-3 in urothelial tumorigenesis. Urol. Oncol. 2013; 31(3): 303-311.
13. Ross R.L., Askham J.M., Knowles M.A. PIK3CA mutation spectrum in urothelial carcinoma reflects cell context-dependent signaling and phenotypic outputs. Oncogene. 2013; 32: 768-776.
14. Millis S.Z., Bryant D., Basu G., Bender R., Vranic S., Gatalica Z., Vogelzang N.J. Molecular profiling of infiltrating urothelial carcinoma of bladder and nonbladder origin. Clin. Genitourin. Cancer. 2015; 13(1): e37-e49.
15. Silverberg D.M. Urothelial carcinoma of the upper urinary tract diagnosed via FGFR3 mutation detection in urine: a case report. BMC Urol. 2012; 12: 20.
16. Kandimalla R., Masius R., Beukers W., Bangma C.H., Omtoft T.F., Dyrskjot L., van Leeuwen N., Lingsma H., van Tilborg A.A., Zwarthoff E.C. A 3-plex methyla-tion assay combined with the FGFR3 mutation assay sensitively detects recurrent bladder cancer in voided urine. Clin. Cancer Res. 2013; 19( 17): 4760-4769.
17. Allory Y., Beukers W., Sagrera A., Flandez M., Marques M., Marquez M., van der Keur K.A., Dyrskjot L., Lurkin I., Vermeij M., Carrato A., Lloreta J., Lorente J.A., Carrillo-de Santa Pau E., Masius R.G., Kogevinas M., Steyerberg E.W., van Tilborg A.A., Abas C., Orntoft T.F., Zuiverloon T.C., Malats N., Zwarthoff E.C., Real F.X. Telomerase reverse transcriptase promoter mutations in bladder cancer: high frequency across stages, detection in urine, and lack of association with outcome. Eur. Urol. 2014; 65(2): 360-366.
18. Millholland J.M., Li S., Fernandez C.A., Shuber A.P. Detection of low frequency FGFR3 mutations in the urine of bladder cancer patients using next-generation deep sequencing. Res. Rep. Urol. 2012; 4: 33-40.
19. Williams S.V., Hurst C.D., Knowles M.A. Oncogenic FGFR3 gene fusions in bladder cancer. Hum. Mol. Genet. 2013; 22(4): 795-803.
