CC BY
33
© А.С.Аль-Шукри, В.Н.Ткачук, М.В.Дубина, 2010 УДК 616.62-006.6-036.8:575
А.С. Алъ-Шукри1, В.Н. Ткачук1, М.В. Дубина
ВОЗМОЖНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ДЛЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ
A.S. Al-Shukri, V.N. Tkachuk, M.V Dubina
POSSIBILITIES OF MOLECULAR-GENETIC RESEARCH FOR PREDICTION OF BLADDER CANCER
1Кафедра урологии и 2отдел молекулярно-генетических исследований Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова, Россия
РЕФЕРАТ
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - изучить мутацию гена FGFR3 и экспрессию гена p53 для определения прогноза у больных раком мочевого пузыря. ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ. Обследовано 25 больных раком мочевого пузыря. Материалом для молекулярно-генетических исследований послужил операционный материал. Геномную ДНК из опухоли и крови получали с использованием набора GenElute (США), а мутационные повреждения определяли в генах FGFR3 (экзон 7) и p53 (экзоны 5, 6, 7). РЕЗУЛЬТАТЫ. Согласно полученным данным, мутации экзона 7 гена FGFR3 характеризуют благоприятное течение заболевания, а мутации в экзонах 5, 6, 7 гена p53 наблюдается при неблагоприятном течении рака мочевого пузыря. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Для определения прогноза рака мочевого пузыря целесообразно определять мутации генов FGFR3 и p53.
Ключевые слова: рак мочевого пузыря, прогноз заболевания, мутации генов FGFR3 и p53.
ABSTRACT
THE AIM - to examine FGFR3 gene mutation and expression of p53 gene to determine the prognosis of patients with bladder cancer. PATIENTS AND METHODS. A total of 25 patients with bladder cancer were investigated. Materials for molecular genetic studies were surgical specimens. Genomic DNA from tumor and blood were obtained using a set GenElute (USA), and mutational damage was determined in the genes FGFR3 (exon 7) and p53 (exons 5, 6, 7). RESULTS. According to our data, mutations of exon 7gena FGFR3 characterizes the favorable course of disease, and mutations in exons 5, 6, 7 p53 gene is observed in the poor course of bladder cancer. CONCLUSION. To determine the prognosis of bladder cancer is useful to determine the FGFR3 gene mutations and p53.
Key words: bladder cancer, prognosis, FGFR3 gene mutations and p53.
ВВЕДЕНИЕ
Рак мочевого пузыря является самым частым новообразованием мочевых путей [1, 2]. По данным И.О. Аполихина и соавт. [3], в Российской Федерации с 1995 по 2005 г. заболеваемость раком мочевого пузыря увеличилась на 58,6%.
В последние годы основным методом лечения поверхностного рака мочевого пузыря стала трансуретральная резекция (ТУР), однако прогноз заболевания у многих больных после оперативного лечения является неблагоприятным, а частота возникновения рецидивов после ТУР крайне высока и составляет от 50 до 90% [4]. По данным литературы [5, 6], при первичном диагнозе в настоящее время поверхностные формы рака мочевого пузыря выявляют у 70-75% больных.
Аль-Шукри А.С. 197022, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, 17, Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова, кафедра урологии, тел. (812) 234-91-96.
Известно, что как среди поверхностных, так и среди мышечно-инвазивных опухолей мочевого пузыря, существует биологическая неоднородность, которая определяется не только морфологической формой и степенью инвазии опухоли, но и молекулярно-генетическими изменениями [6, 7]. Поэтому стали развиваться прикладные аспекты применения молекулярно-генетической диагностики в уроонкологии. Было доказано, что наиболее информативными факторами прогноза у больных с поверхностным раком мочевого пузыря являются мутации гена БОБЮ и экспрессия гена р53 [8, 9]. Однако опубликованы лить единичные исследования, посвященные молекулярно-генетическим факторам прогноза у больных раком мочевого пузыря. Дальнейшие исследования в этом направлении помогут значительно улучшить определение прогноза заболевания у больных раком мочевого пузыря, что имеет существенное практическое значение.
Целью настоящего исследования явилось изучение мутации гена FGFR3 и экспрессии гена p53 для определения прогноза у больных раком мочевого пузыря.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
Настоящая работа основана на обследовании 25 больных, страдающих раком мочевого пузыря. Материалом для молекулярно-генетических исследований у этих больных послужил операционный материал (у 7 - цистэктомия, у 18 - ТУР опухоли). Всем больным оперативное лечение было выполнено на базе кафедры и клиники урологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова. По данным гистологического исследования удаленных опухолей мочевого пузыря, у 23 (92%) больных был выявлен переходно-клеточный рак с различной степенью дифференцировки, а у 2 (8%) - аденокарцинома с умеренной и низкой степенью дифференцировки.
Среди обследованных пациентов были 4 (16%) женщины и 21 (84%) мужчина в возрасте от 46 до 85 лет (средний возраст 64,9±9,3 года). Стадия заболевания T1 установлена у 4 (16%) больных, Т2а - у 8 (32%), Т2Ь - у 6 (24%), Т3а - у 4 (16%), Т3Ь -у 2 (8%) и Т4а - у 1 (4%) больного.
Материал из первичных опухолей, а также цельную кровь объемом 5 мл в растворе ЭДТА получали после операции для дальнейших молекулярно-генетических исследований. Образцы опухолевой ткани помещали в специальные кассеты, замораживали при температуре -20°С и транспортировали в лабораторию для последующего хранения и исследований. Весь материал хранили в термоконтейнерах при температуре -80°С. Последующие генетические исследования с образцами опухолей проводили при температуре от -20°С до -4°С (на льду). Для верификации ранее установленного гистологического диагноза, предварительной оценки наличия опухолевых клеток в исследуемых препаратах, изучения стромы и окружающей опухоли делали 2-3 криосреза толщиной 6-7 мкм. Один из криотомных срезов опухолевой ткани обязательно окрашивали гематоксилином - эозином.
Геномную ДНК из образцов крови и опухолей мочевого пузыря получали с использованием коммерческого набора GenElute™ Mammalian Genomic DNA Kit (Sigma, США). Кровь объемом 1 мл размораживали до температуры -20°С и использовали в дальнейшем без дополнительной подготовки. Для полной гомогенизации ткани и лизиса клеточных мембран в каждую пробирку объемом 2,0 мл с исследуемыми индивидуальными образцами тка-
ни или крови добавляли по 180 мкл солевого «ли-тического раствора» (№6678, каталог Sigma, США) и по 20 мкл протеиназы К, которую предварительно разводили из расчёта 20 мг/мл. Пробирки инкубировали на водяной бане при постоянной температуре 55°С в течение 2-4 ч (до полного лизиса тканевых элементов), после чего добавляли в раствор по 200 мкл литического раствора и инкубировали образцы при температуре 70°С в течение 10 мин.
Для оптимизации последующей экстрации ДНК от лизированных клеточных элементов и ингибирования протеиназы в полученную смесь добавляли 200 мкл 95-100% этанола. Затем пробирки центрифугировали при 6500 об/мин в течение 1 мин. Для фильтрации полученного раствора и очистки ДНК через колонку с силиконовой мембраной, специфически связывающей нуклеиновые кислоты, в пробирки дважды добавляли по 500 мкл «моющего раствора» (№6553, каталог Sigma, США) и проводили центрифугирование (6500 об/мин в течение 1 мин и 12.000 об/мин в течение 3 мин). Очищенную геномную ДНК, прикреплённую к силиконовой мембране, получали после добавления 200 мкл вымывающего раствора Elution Solution (Трис-НС1 в концентрации 10 ммоль, ЭДТА в концентрации 0,5 ммоль, рН 9,0) и центрифугирования при 6500 об/мин в течение 1 мин. В окончательном растворе методом спектрофотометрии измеряли концентрацию очищенной ДНК. Соотношение длин волн 260 нм/280 нм в пределах 1,7—1,9 свидетельствовало о наличии и примерной концентрации двуцепочечной ДНК 50мкг/мл окончательного раствора. При условии соблюдения исходных условий экстракции и очистки ДНК в последующем при амплификации генов методом ПЦР использовали по 0,5 мкл окончательного раствора ДНК на отдельную реакцию.
Генетический анализ ДНК опухолей проводили на наличие мутационных повреждений в генах FGFR3 и р53. Для поиска возможных мутаций генов в опухолях мочевого пузыря использовали метод секвенирования нуклеотидных последовательностей по Сэнгеру с использованием фермента ДНК-полимеразы Taq, описанного P.M. Green и соавт. в 1994 г. [10]. Метод основан на технологии полимеразной цепной реакции, с помощью которого A.A. Bakkar и соавт. [8] в 2003 г. были обнаружены мутации в генах FGFR3 и p53 при раке мочевого пузыря. Данный метод состоит из следующих основных этапов: амплификация избранных участков ДНК методом ПЦР, денатурация, медленная ренатурация и последующее электрофоретическое разделение амплифицированных генов в
Таблица 1
Олигонуклеотидные праймеры для амплификации генов FGFR3 и р53
Ген Фрагмент гена Праймеры
РСРКЗ Экзон 7 размер: 116 п.н. Прямой: 5'-АСТСССССТССТССТСАСС6АС-3' Обратный: 5'-САССАССССССТСТССТТСС-3'
р53 Экзон 5 размер: 310 п.н. Экзон 6 размер: 331 п.н. Экзон 7 размер: 214 п.н. Прямой: 5'-Т6ТТТСТТТСТТТССТССССТСТ-3' Обратный:5'-СААССАССССТСТССТСТСТ-3' Прямой: 5'-ТСССССССАТССССАТСТАС-3' Обратный:5'-ААССАСССТТААССССТССТ-3' Прямой: 5'-ААССАСССТТААССССТССТ-3' Обратный: 5'-ССССАСТССССТСАТСТТС-3'
Примечание. п.н. - пара нуклеотидов.
полиакриламидном геле. Идентификацию продуктов ПЦР проводили в каждом из 2 однонитевых фрагментов ДНК. Затем с помощью генетического банка нуклеотидных последовательностей (GeneBank), приведенного в сети интернет на странице Национального центра биотехнологической информации и Национальных институтов здоровья США (http: www.ncbi.nlm.nih.gov), определяли нуклеотидные последовательности кодирующих регионов экзона 7 гена FGFR3 и эконов 5, 6 и 7 гена р53.
Поиск и тестирование праймеров на совместимость проводили с использованием специальных программ, доступных в сети интернет по адресу: www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer. Для амплификации кодирующей части генов FGFR3 и р53 использовали несколько пар олигонуклеотидных праймеров (затравок), захватывающих всю исследуемую часть гена. В табл. 1 представлены олигонуклеотиды, рассчитанные в результате компьютерного поиска для амплификации исследуемых экзонов.
Раствор для ПЦР готовили ex tempore из расчета 15 мкл раствора на 1 образец исследуемой ДНК. В работе использовали следующие компоненты и объемы, исходя из расчетного объема раствора для ПЦР:
1) 10х Буфер для ПЦР (200 мМ Tris-HCI, 500 мМ KCl, pH-8,4) - 5 мкл.
2) Праймеры, 0,2 мМоль, разведенные в двойном дистилляте стерильной H2O (для прямого и обратного праймера) - по 1 мкл.
3) Смесь четырем дезоксинуклеотидтрифосфа-тов (dNTP) по 0,2 мМоль каждого (Sigma, США) -1 мкл.
4) Раствор MgCl2, 25 мМоль (Sigma, США) -1,5 мкл.
5) Полимераза ДНК Taq Platinum 5 ед./мкл (Sigma, США) - 0,5 мкл.
6) Геномная ДНК - по 0,5 мкл.
7) Двойной дистиллят стерильной HjO - до 50 мкл.
Сначала проводили полимеразную цепную реакцию с образцами ДНК, выделенными из опухо-
лей мочевого пузыря в присутствии всех четырех типов dNTP и того же набора праймеров. Итоговые реакционные смеси ПЦР (5 мкл), содержащие продукты амплификации, подвергали электрофорезу в 0,9% агарозном геле, содержащем 1X ТВЕ (44,5 ммоль трис-гидроксиметиламинометан, 44,5 мМ борной кислоты, 1 ммоль ЭДТА, рН 8,3) для контроля реакции. Затем гели окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ-свете, что позволяло выявить конечный продукт реакции.
После этого реакционные смеси ПЦР очищали от несвязавшихся дезоксинуклеозидтрифосфа-тов с использованием коммерческого набора для очистки ПЦР продуктов по прилагаемой в наборе методике.
На заключительном этапе проводили повторную полимеразную цепную реакцию с исходными очищенными продуктами и в режиме секвениро-вания. В реакционную смесь для секвенирования объемом 20 мкл входили следующие компоненты: 9 мкг очищенного продукта ПЦР, 3,2 пмоль соответствующего праймера и готовая реакционная смесь из набора Big Dye Terminator Kit v. 3.0 (Perkin Elmer), включающая в себя фермент Taq ДНК полимеразу и смесь четырех 2',3'-дидезоксинуклео-зидтрифосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP). Данная комбинация реактивов позволяет в одной реакции «прочитать» до 500 нуклеотидов в цепочке ДНК. Маркированные индивидуальным цветом 2',3'-дидезоксинуклеозидтрифосфаты (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP) обеспечивали специфический обрыв синтеза за счет способности включаться в растущую цепь ДНК и блокировать дальнейший синтез новой цепочки ДНК из-за отсутствия З’-ОН группы, необходимой для присоединения следующего дезоксинуклеозидтри-фосфата.
Для секвенирования использовали метод ПЦР из 25 циклов, включавших в себя денатурацию при температуре 96°С (30 с), отжиг при температуре 50°С (15 с) и синтез при температуре 60°С (4 мин). В результате данной реакции получали набор продуктов неполного копирования матричных фрагментов ДНК.
После этого полученные продукты вносили в автоматический секвенатор АВ1 Рrism 3700. Затем с помощью специальных компьютерных программ по расположению цветовых полос, создаваемых группами отдельных нуклеотидов в месте обрыва синтеза, определяли их последовательность в структуре исследуемых генов. Полученные дан-
Таблица 2
Распределение больных в зависимости от патогистологической характеристики опухоли
Гистологический диагноз (степень дифференцировки) Количество образцов опухолей
Абс. число %
Переходно-клеточный рак высокой степени дифференцировки 13 52,0
Переходно-клеточный рак умеренной степени дифференцировки 5 20,0
Переходно-клеточный рак низкой степени дифференцировки 5 20,0
Аденокарцинома разной степени дифференцировки и недифференцированные опухоли 2 8,0
Всего 25 100,0
ные сравнивали с нуклеотидными последовательностями изучаемых экзонов генов, доступных в генетической базе данных «Genebank». Для этого использовали семейство программ поиска похожих участков сравниваемых нуклеотидных последовательностей «BLAST 2». Принцип работы данных программ основан на том, что пользователь вводит в программу найденную опытным путем нуклеотидную последовательность и исследуемую последовательность из базы данных. Затем программа производит поиск и выводит на экран компьютера список похожих последовательностей с указанием степени их гомологичности.
РЕЗУЛЬТАТЫ
По результатам предварительного гистологического исследования все образцы злокачественных опухолей мочевого пузыря, полученные от пациентов при хирургических операциях, были разделены на 4 группы в зависимости от степени дифференцировки опухолевых клеток в исследуемых тканях (табл. 2).
Как видно из таблицы, наибольший процент исследуемых образов представляли опухоли с высокой степенью дифференцировки (52% от общего числа исследуемых случаев).
При исследовании нуклеотидной последовательности методом прямого секвенирования в образцах опухолей мочевого пузыря были установлены следующие характеристики генетических нарушений в последовательности нуклеотидных оснований.
В результате прямого секвенирования экзона 7 гена FGFR3 у 9 из 25 больных, что составило 36%, была обнаружена нуклеотидная замена цитозина (С) па гуанин (G) в кодоне 746 с соответствующей заменой аминокислоты серина (Ser) на цистин (С^) в 249-й позиции белка. Исходя из гистологической классификации, обнаруженные мутационные изменения гена FGFR3 соответствовали определённой форме и стадии злокачественного процесса, а именно: все образцы опухолей мочевого пузыря, в которых была обнаружена данная мутация, характеризовались высокой степенью дифференцировки и
составляли 69,2% от всех опухолей этой группы. Кроме того, данные опухоли были локализованы в поверхностном слое мочевого пузыря и были обнаружены у пациентов на стадии Т1 (2 случая) и Т2а (3 случая) рака мочевого пузыря.
В результате прямого секвенирования экзонов 5, 6 и 7 гена р53 при исследовании опухолей мочевого пузыря были обнаружены три вида мутаций. В частности, при секвенировании экзона 5 в одном случае была выявлена делеция (выпадение) цитозина в кодоне 13085 нуклеотидной последовательности, которая приводила к остановке считывания белка в соответствующей позиции. Данная мутация была ассоциирована с переходно-клеточным раком мочевого пузыря в стадии Т2, который ха-растеризовался низкой степенью дифференцировки и инвазией в слизистую оболочку. В экзоне 6 была выявлена замена аденина (А) на гуанин (О) в кодоне 13419 с соответствующей заменой аминокислоты тирозина (Туг) на цистин (Суз) в 220-й позиции белка. Данная мутация была ассоциирована с переходно-клеточным раком в стадии Т2, характеризующимся низкой степенью дифференцировки и прорастанием всех слоев стенки мочевого пузыря. В экзоне 7 была выявлена замена гуанина (О) на аденин (А) в кодоне 14070 с соответствующей заменой аминокислоты аргинина (А^) на глютамин (О1п) в 248-й позиции белка. Данная мутация была ассоциирована с образцами переходно-клеточного рака в стадии ТЗ (2 случая) низкой степени дифференцировки, прорастанием опухоли в мышечный слой и ТЗЬ (1 случай) - недифференцированная опухоль с прорастанием в предстательную железу, мышечную оболочку, стенку, инвазией по сосудам. Взятые вместе мутации гена р53 наблюдались в 62,5% злокачественных опухолей в двух группах, характеризующих рак низкой степени дифференцировки, недифференцированные опухоли и аденокарциномы (5/8).
ОБСУЖДЕНИЕ
Таким образом, в результате проведенного нами молекулярно-генетического исследования генов РОРЮ и р53 у пациентов с гистологически
верифицированным диагнозом «рак мочевого пузыря» был установлен факт преобладания мутаций различных генов, характеризующих разные стадии прогрессии, что может служить важным фактором прогноза заболевания. Согласно нашим данным, мутации, выявленные в наиболее часто мутируемом экзоне 7 гена БОБЮ, характеризовали относительно благоприятное течение заболевания у больных с опухолью мочевого пузыря на стадии Т1 - Т2, с высокой степенью клеточной дифференцировки, а мутации в экзонах 5,6 и 7 гена р53 наблюдались при неблагоприятном течении заболевания.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты проведенного исследования показали возможности молекулярно-генетических исследований для прогнозирования рака мочевого пузыря. При этом основной задачей молекулярно-генетических исследований опухолей мочевого пузыря является проведение правильно спланированных работ, позволяющих выявить значимые молекулярные маркеры для прогноза заболевания и эффективности избранного метода лечения у каждого больного, страдающего раком мочевого пузыря.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Аль-Шукри СХ, Ткачук ВН. Опухоли мочеполовых органов: Руководство для врачей. «Питер», СПб., 2000; 320
2. Jemal A, Siegel R, Ward E et al. Cancer statistics, 2007. Cancer Clin 2007; 57:43-66
3. Аполихин ОИ, Какорина ЕП, Сивков АВ и др. Состояние урологической заболеваемости в Российской Федерации по данным официальной статистики. Урология 2008; (3): 39
4. Павлов ВН, Казихинуров АА, Крупин ВН и др. Изменение ультраструктуры и микроциркуляции стенки мочевого пузыря у пациентов с неинвазивными формами рака. Онкоурология 2008; (4): 57-60
5. Kaufman D. Challenges in the treatment of bladder cancer. Ann Oncol2006; 17: 106-112
6. Knowels M. Molecular subtypes of bladder cancer. Carcinogenesis 2006; 27(3): 361-373
7. Аль-Шукри АС, Ткачук ВН, Дубина МВ. Прогностические молекулярно-генетические маркеры рака мочевого пузыря. Онкоурология 2009; 2: 78-82
8. Bakkar A, Wallerand H, Radvanyi F et al. FGFR3 and p53 characterize alternative genetic pathways in the pathogenesis of urotelial cell carcinoma. Cancer Res 2003; 63(8): 8108-8112
9. Hernandez S, Lopez-Knowels E, Lloreta J et al. FGFR3 and Tp53 mutation in T1G3 transitional bladder carcinomas: independent distribution and lack of association with prognosis. Clin Cancer Res 2005; 11: 5444-5450
10. Green PM, Giannelli F. direct sequencing of PCR-amplified DNA. Molecular Biotechnology 1994; 2: 117-124
Поступила в редакцию 11.02.2010 г.
Принята в печать 02.06.2010 г.
